专利名称：一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法
技术领域：
本发明属于微生物的分子检测技术领域，具体涉及一种林木外生菌根真菌 (Ectomycorrhizal fungi, EMF)彩色豆马勃 O0Z1So^iiAw1S iiflciori^As)的分子检测方法。
背景技术：
外生菌根是真菌与植物根系相互作用形成的互惠共生体，是森林植物正常生长必不可少的部分，具有重要的生态环境效益和经济价值。准确描述和鉴定外生菌根真菌 (Ectomycorrhizal fungi, EMF)是研究外生菌根在自然森林生态系统中功能的最基本要求之一，特别是在进行外生菌根种类和分布状况的野外调查时，对菌根真菌的监测也需要鉴别EMF。同时，对EMF鉴定也可应用于检测接种了外生菌根食用真菌的植物质量，以确保被接种的植物在生产过程中没有被其它真菌污染。彩色豆马勃iPisolithus tinctorius ) 是一种地理分布广泛、寄主范围广、对林木有益的EMF，分布于世界三十多个国家，能够与松树iPinus、、職(^/ca斤/7 ^5)、栎树(ft/ercm )、桦木(Metula )等多种林木形成菌根，在苗圃育苗、树木移栽和人工造林时具有提高幼苗成活率、促进树木营养吸收、提高树木抗病和抗逆境胁迫的能力。传统的EMF鉴定是通过真菌子实体颜色、形状和其它的宏观特征进行鉴定，后来辅以菌索和真菌细胞的显微结构等进行鉴定。但是，由于大多数EMF种类在野外或离体培养时不易形成子实体，因此对EMF进行形态学描述及鉴定存在一定困难。另外，相近种的EMF所形成的菌根往往具有相似的形态学结构，容易混淆，所以探寻合适的检测EMF 的方法是目前亟待解决的一个重要问题。真菌核糖体rDNA的ITS区是一段中度或高度保守序列，其保守性表现为种内相对一致，种间差异比较明显，因此为真菌的分子检测提供了理想的靶序列，再加上分子生物学和生物信息学的发展，许多真菌的rDNA ITS区序列被测定并且向GeneBank等三大数据库提交，为通过ITS区序列来研究EMF的分子检测提供了方便。一系列基于rDNA ITS区的分子生物学检测外生菌根的方法应运而生，主要的分子生物学方法如限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、简单重复序列(Simple Sequence R印eat，SSR)、序列扩增特征区(Sequence Characterized Amplified Region，SCAR)，还有设计特异性引物扩增ITS区和设计专一性探针进行分子杂交检测和鉴定EMF，这使得对EMF 的检测脱离了对形态学的依赖。但是这些方法也存在一些不足，如费用比较昂贵、检测对象 DNA质量不高或DNA浓度太小时难于分析等。而且，土壤中存在多种PCR扩增抑制剂，如腐殖酸等，会对PCR扩增产生严重影响，另外，从植物菌根中只能获得少量的真菌DNA，这些因素给EMF的分子检测带来了不便。同时，对EMF分子检测时，设计出特异性引物也是技术的关键。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，以期为林木EMF彩色豆马勃的检测和评估提供一种准确、快速的途径。
发明内容
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，以待测样品DNA为模板，以通用引物ITSl-F/ ITS4-B、引物PtF和引物PtR为特异性引物，分别进行巢式PCR的第一、二轮反应，产物进行电泳检测，即可快速检测松树外生菌根中的彩色豆马勃；所述的引物PtF序列为 5，-GGGACCTGTGCGTTTCGT-3，；引物 PtR 序列为5，-CATGCCCACCCGCTAATG-3，。一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，具体步骤如下
(1)采用CTAB法提取待测样品的DNA，在进行组培苗和实生苗菌根DNA提取时，当DNA 溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重复提取一次；
(2)巢式PCR反应，巢式PCR第一轮PCR反应的引物为通用引物ITS1-F/ITS4-B，反应体系 20ul 10XPCR buffer (Mg2+ Free)2ul ；MgCl2 (25mM)l. 3ul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 1.6ul ；引物各Iul ；rTaq酶(5U/ul)0. Iul ；模板DNA 2ul ；加无菌去离子水至20ul ；PCR反应条件为94°C预变性4min ；94°C变性lmin，57. 8°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；72°C延伸IOmin ；巢式PCR第二轮反应以特异性引物PtF/PtR为引物，巢式PCR第一轮 PCR产物稀释50倍，取2ul作为第二轮反应模板，PCR反应体系与第一轮相同，PCR反应条件为94°C预变性4min ；94°C变性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；72°C 延伸IOmin ；
(3 )取巢式PCR产物进行琼脂凝胶电泳检测，电泳图中出现347bp条带即为检测出彩色
豆马勃。步骤(1)中，采用CTAB法提取待测样品的DNA时，在进行组培苗和实生苗菌根DNA 提取时，当DNA溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重复提取一次。本发明利用真菌通用引物ITS1-F/ITS4-B扩增了彩色豆马勃的核糖体DNA内转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较，设计了一对彩色豆马勃引物PtF / PtR，将所设计的特异性引物放回GeneBank中的I^rimer-Blast比对，并用该对引物对所有供试菌株进行巢式PCR扩增以验证所设计引物的特异性。为了评估巢式PCR的灵敏度，将彩色豆马勃DNA稀释为10个梯度，20ul PCR反应体系中分别含 DNA 模板 IOOng, IOng, lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、10fg、Ifg 和 IOOag,分别用特异性引物进行常规PCR和巢式PCR。为了评价本发明的EMF彩色豆马勃巢式PCR检测在实际应用中的效果，以施用彩色豆马勃的组培苗和四年生菌根化盆栽马尾松实生苗进行巢式PCR检测。巢式PCR是基于内部引物，进行两轮PCR扩增，能增加DNA扩增片段的浓度，对PCR 抑制物质起到稀释作用，因此可以避免低DNA浓度和PCR抑制化合物对检测的影响。有益效果本发明以待测样品DNA为模板，以引物PtF和引物PtR为特异性引物， 进行巢式PCR反应，产物进行电泳检测后即可以快速检测外生菌根真菌彩色豆马勃。该方法为林木EMF彩色豆马勃的检测和评估提供一种准确、快速的途径，引物PtF和引物PtR具有很强的特异性，本方法的检测灵敏度能够达到常规PCR的1000倍。
图1是彩色豆马勃巢式PCR引物特异性分析的1.5%琼脂凝胶电泳图；其中，电
4泳条件，IOOv, 57mA,电泳30min ；图中，泳道M为DNA Marker ；泳道广10为彩色豆马勃菌株DNA ；泳道11为黄色须腹菌iHhizopogon luteolus)mk ；泳道12为紫金蜡蘑(Zaccaria amethystea )DNA ；泳道 13 为劣味乳菇 Uactarius insulsus)mk ；泳道 14 为红菇(Mussula sp. )DNA ；泳道 15 为裂WM QSchizophylIum commune ) Μ ；泳道 16 为小马勃 Uycoperdon pusillus )mk ；泳道17为双蒸水；
图2是特异性引物PtF / PtR常规PCR扩增彩色豆马勃DNA灵敏度检测的1.5%琼脂凝胶电泳图；其中，电泳条件，100v，57mA，电泳30min ；图中，泳道M为DNA Marker ；泳道广10 为 20ul PCR 反应体系中分别含 DNA 模板 lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、10fg、 Ifg和1 OOag，泳道11为双蒸水；
图3是特异性引物PtF / PtR巢式PCR扩增彩色豆马勃DNA灵敏度检测的1.5%琼脂凝胶电泳图；其中，电泳条件，100v，57mA，电泳30min ；图中，泳道M为DNA Marker ；泳道广10 为 20ul PCR 反应体系中分别含 DNA 模板 100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、 Ifg和1 OOag，泳道11为双蒸水；
图4是巢式PCR检测两种松树组培苗菌根中彩色豆马勃的1. 5%琼脂凝胶电泳图；其中，电泳条件，IOOv, 57mA,电泳30min ；图中，泳道M为DNA Marker,泳道1为IOOng DNA的阳性对照，泳道2飞均为菌根化湿地松(/ ^ elliottii)根DNA，泳道6、为菌根化赤松 (Pinus densifIoraH DNA，泳道10为未菌根化湿地松根DNA，泳道11为未菌根化赤松根 DNA,泳道12为湿地松松针，泳道13为赤松松针DNA，泳道14为双蒸水；
图5是巢式PCR检测盆栽马尾松实生苗菌根中彩色豆马勃的1. 5%琼脂凝胶电泳图；其中，电泳条件，IOOv, 57mA,电泳30min ；图中，泳道M为DNA Marker,泳道1为IOOng DNA的阳性对照，泳道2飞均为菌根化马尾松QPims massoniana )根DNA，泳道6为未菌根化马尾松根DNA，泳道7为马尾松松针DNA，泳道8为双蒸水。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。以下实施例所使用的材料和方法详情如下
供试彩色豆马勃O0^Wiife1S tinctorius) Γ Ο菌株，其中，广2号2个菌株由南京林业大学森林病理实验室保存，3 10号8个菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心；黄色须腹菌(Mhizopogon A/teo^As)、紫金蜡蘑(Zaccaria a eiAj^iea)、劣味乳菇 {Lactarius lnsulsus)> ^If {Schizophyllum commune)纯培养菌禾中禾口红 (Afessw/a sp.)和小马勃Uycoperdon /^1SiWM)子实体作为参考菌株，其中除红菇、小马勃子实体采自江苏省林业科学研究院马尾松林，其余菌种均由南京林业大学森林病理实验室保存。供试彩色豆马勃2号(代号Pt2)是本实验室筛选出的对松树具有较好促生、抗病作用的优良菌株，因此以Pt2作为检测的阳性菌株。选取经Pt2 菌根化处理的湿地松 OdZzw1S elliottii、、狱k QPinus dens i flora) 组培苗，以及马尾松(/ ^^ massoniana)四年生菌根化盆栽实生苗为供试松树菌根化苗。TaKaRa DNA Fragment Purification Kit, Ε. Ζ. N. Α. CycIe-Pure Kit、DNA 聚合酶、dNTP、pMD19-T载体、DNA Marker等购自大连宝生物公司，引物由南京金斯瑞公司合成。实施例1供试菌株及松苗DNA的提取和ITS扩增
5采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行供试菌株及松苗DNA提取，在进行组培苗和实生苗菌根DNA提取时，当DNA溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重复提取一次。所提取DNA经紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测都符合PCR的要求。以 Pt2 DNA为模板，用真菌通用引物ITSl-F / ITS4-B对Pt2进行PCR扩增，反应体系20ul 10XPCR buffer (Mg2+ Free)2ul ；MgC12 (25mM)l. 3ul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 1. 6ul ； 引物各Iul ；rTaq酶(5U/ul)0. Iul ；模板DNA 2ul ；加无菌去离子水至20ul。PCR反应条件为:94°C预变性 ^iin ；94°C变性 lmin，57. 8°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 35 个循环；72°C 延伸 lOmin。其中，ITSl-F 的序列为5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，，ITS4-B 的序列为 5’-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3’ 。将Pt2 的 ITS 区 PCR产物经 Ε. Z. N. A. TMCycle-Pure Kit 回收，连接 pMD19_T 载体， 转化JM109，挑选阳性克隆经插入片段验证后送上海美吉公司测序。Pt2的ITS序列如说明书序列表中的NO. 1所示。实施例2彩色豆马勃巢式PCR特异性引物设计
在GeneBank上获得彩色豆马勃及其同属其余种的ITS序列16条，连同供试Pt2的 ITS序列进行Clustal W多重序列比对，利用Primer premier 5.0设计了一对彩色豆马勃的特异性引物:PtF / PtR, PtF序列为5' -GGGACCTGTGCGTTTCGT-3'，PtR序列为 5，-CATGCCCACCCGCTAATG-3，，扩增产物大小为!347bp。实施例3彩色豆马勃巢式PCR引物的特异性分析
巢式PCR第一轮PCR反应的引物为通用引物ITSl-F / ITS4-B，按照实施例1中的体系和步骤进行PCR扩增。常规PCR和巢式PCR第二轮反应以特异性引物PtF / PtR为引物， 巢式PCR第一轮PCR产物稀释50倍，取2ul作为第二轮反应模板，PCR反应体系与第一轮相同，PCR反应条件为:94°C预变性^iin ；94°C变性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共 35个循环；72°C延伸IOmin。将所设计的特异性引物PtF / PtR放回GeneBank中的I^rimer-Blast比对，只有彩色豆马勃的两个基因登陆序列AF374717、AF374710能产生347bp的片段，说明了该对引物在目前GeneBank中的特异性。此外，采用该对引物对供试10株彩色豆马勃，4种松林中常见EMF黄色须腹菌、紫金蜡蘑、劣味乳菇、红菇，以及2种松林中常见真菌裂褶菌、小马勃进行巢式PCR，结果如图1所示，所有彩色豆马勃菌株扩增结果都为阳性，获得大小为347bp 的扩增产物，其他EMF和非EMF扩增结果为阴性。采用真菌ITS通用引物对所有供试真菌 DNA进行PCR，都获得了 SOObp左右大小的产物。结果表明该对巢式PCR引物只能对彩色豆马勃进行特异性扩增，其他真菌DNA不能获得相应扩增产物。为了进一步确认 PCR 产物的特异性，用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit (购自大连宝生物公司)将巢式PCR电泳产物进行切胶回收，连接PMD19-T载体，转化JM109， 挑选阳性克隆经插入片段验证后送上海美吉公司测序，测序后与目的序列比对来确认扩增产物的正确性。巢式PCR产物凝胶回收测序结果表明，347bp大小的扩增产物与Pt2 ITS区中的一段序列完全匹配。结果表明，引物PtF / PtR能特异性地扩增出EMF彩色豆马勃ITS 区347bp的片段，而对其他真菌没有扩增产物。347bp大小的扩增产物的序列如说明书序列表中的NO. 6所示。实施例4彩色豆马勃巢式PCR检测的灵敏度分析为了评估巢式PCR的灵敏度，将彩色豆马勃DNA稀释为10个梯度，20ul PCR反应体系中分别含 DNA 模板 IOOng, IOng, lng, IOOpg, IOpg, lpg、lOOfg、10fg、lfg、IOOag,分别用特异性引物进行常规PCR和巢式PCR，常规PCR以特异性引物PtF / PtR为引物，Pt2 DNA为模板，反应体系和反应条件同实施例3中巢式PCR第二轮反应，巢式PCR反应体系和反应条件同实施例3。结果显示常规PCR只能检测到IOpg的DNA，如图2所示，常规PCR只能检测到 IOpg的DNA，如图3所示，巢式PCR最低能检测到IOfg的DNA，巢式PCR检测灵敏度是常规 PCR 的 1000 倍。实施例5
为了评价本试验所开发的EMF彩色豆马勃巢式PCR检测在实际应用中的效果，首先以培育的施用Pt2的组培苗进行巢式PCR检测，反应体系和反应条件同实施例3。结果如图 4所示，菌根化的湿地松和赤松根都能获得阳性扩增结果，而未施用Pt2的组培苗根及松针和阴性对照都没有扩增产物。实施例6巢式PCR检测盆栽松苗菌根中彩色豆马勃
为了进一步研究本试验所设计特异性引物的检测效果，对施用Pt2的四年生菌根化盆栽马尾松实生苗进行巢式PCR检测，巢式PCR反应体系和反应条件同实施例3。结果如图5 所示，施用Pt2的马尾松菌根检测结果为阳性，未施用Pt2的马尾松根、松针以及阴性对照都没有扩增产物。
权利要求
1.一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，其特征在于以待测样品DNA为模板，以通用引物ITS1-F/ITS4-B、弓丨物PtF和引物PtR为特异性引物，分别进行巢式PCR的第一、二轮反应，产物进行电泳检测，即可快速检测松树外生菌根中的彩色豆马勃；所述的引物PtF序列为5' -GGGACCTGTGCGTTTCGT-3'；引物PtR序列为 5，-CATGCCCACCCGCTAATG-3，。
2.根据权利要求1所述的林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，其特征在于，具体步骤如下(1)采用CTAB法提取待测样品的DNA，在进行组培苗和实生苗菌根DNA提取时，当DNA 溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重复提取一次；(2)巢式PCR反应，巢式PCR第一轮PCR反应的引物为通用引物ITS1-F/ITS4-B，反应体系 20ul 10XPCR buffer (Mg2+ Free)2ul ；MgCl2 (25mM)l. 3ul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 1.6ul ；引物各Iul ；rTaq酶(5U/ul)0. Iul ；模板DNA 2ul ；加无菌去离子水至20ul ；PCR反应条件为94°C预变性4min ；94°C变性lmin，57. 8°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；72°C延伸IOmin ；巢式PCR第二轮反应以特异性引物PtF/PtR为引物，巢式PCR第一轮 PCR产物稀释50倍，取2ul作为第二轮反应模板，PCR反应体系与第一轮相同，PCR反应条件为94°C预变性4min ；94°C变性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环；72°C 延伸IOmin ；(3 )取巢式PCR产物进行琼脂凝胶电泳检测，电泳图中出现347bp条带即为检测出彩色豆马勃。
3.根据权利要求1所述的林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，其特征在于步骤(1)中，采用CTAB法提取待测样品的DNA时，在进行组培苗和实生苗菌根DNA提取时，当DNA溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重复提取一次。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测外生菌根真菌(Ectomycorrhizalfungi,EMF)彩色豆马勃(Pisolithustinctorius)的分子检测方法及其应用，所述的引物包括引物PtF和引物PtR，引物PtF序列为5′-GGGACCTGTGCGTTTCGT-3′；引物PtR序列为5′-CATGCCCACCCGCTAATG-3′；所述应用为特异性引物在快速检测林木外生菌根真菌彩色豆马勃中的应用。引物PtF和引物PtR具有很强的特异性，巢式PCR检测灵敏度能够达到常规PCR的1000倍。本发明以待测样品DNA为模板，以引物PtF和引物PtR为特异性引物，进行巢式PCR反应，产物进行电泳检测后即可快速检测外生菌根真菌彩色豆马勃。该方法为林木EMF彩色豆马勃的检测提供了一种准确、快速的途径。
文档编号C12Q1/68GK102181544SQ20111008876
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月11日 优先权日2011年4月11日
发明者叶建仁, 吴小芹, 周爱东 申请人:南京林业大学