产生雄性不育植物的方法和组合物的制作方法

专利名称：产生雄性不育植物的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过增加11-和/或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶的内源活性和/或降低茉莉酮酸11-/12-羟化酶的活性来降低11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯(jasmonate)的水平以产生雄性不育植物，和通过对所述植物施用含有茉莉酮酸酯的组合物在所述植物中恢复雄性不育表型的方法。
现有技术简述有几个茉莉酮酸(JA)和相关环戊酮(统称为茉莉酮酸酯)参与花发育过程的直接和间接的证据(Wasternack和Hause(2002)，ProgNucleic Acid Res Mol Biol 72165-221)。例如，由于花药和花粉发育时期的不适宜造成了在JA生物合成或信号传导上的拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体雄性不育(Feys等人，(1994)PlantCell 6751-759)。已知茉莉酮酸酯在雌性生殖发育中也起着作用。例如，发现对外源施用的甲基茉莉酮酸酯(MeJA)不敏感和不能表达应答创伤的相关防卫性基因的番茄jai-1突变体是雌性不育的(Li等人，(2001)Plant Physiol.1271414-1417)。雄性或雌性配子体的发育对茉莉酮酸酯的需求在物种特异性方面的差异仍需要进行解释。最后，与叶子相比在发育的生殖器官中发现有相对较高水平的茉莉酮酸酯并且在花中存在有特异性的茉莉酮酸酯例如JA酪胺缀合物和12-羟基茉莉酮酸酯(12-OHJA)(Miersch等人，(1998)Phytochemistry 47327-329)。
本发明者已证实了11-和/或12-OHJA(


图1)是花药正常发育所必需的。首先，他们证实对具有JA生物合成缺陷的拟南芥opr3突变体的花序施用外源12-OHJA修复了雄性不育表型。进一步，他们证实了在转基因烟草中过量表达编码11-/12-OHJA磺基转移酶的拟南芥AtST2a基因导致可通过外源施用的JA或12-OHJA修复的雄性不育表型。
已经证明许多功能与茉莉酮酸酯代谢物例如12羟基茉莉酮酸和/或11-羟基茉莉酮酸有关。例如，美国专利号5,935,809提出茉莉酮酸酯在诱导植物防卫机制方面的用途。美国专利号5,814,581描述了含有作为活性成份的茉莉酮酸酯和油菜素内酯的植物生长促进组合物，和Tazaki(1990年4月3日出版的Japanese kokai 292220(A)，和1988年9月29日提交的专利申请号69-242432)；Yoshibara等人，(1989)，Agric.Biol.Chem.532835-2837，Matsuki等人，(1992)，Biosci.Biotech.Biochem.561329.；以及Koda和Okazawa(1988)，Plant Cell Physiol.29969)提出12-羟基茉莉酮酸在马铃薯中诱导块茎形成的用途。这些文献既没有公开也没有暗示通过在体内增加羟基茉莉酮酸酯的磺基化作用或通过降低11-和/或12-OHJA的合成可以产生雄性不育植物。
因此，需要可应用于所有开花植物的产生雄性不育植物的有效方法和修复所述雄性不育表型的方法。也需要通过遗传改造成为雄性不育的植物。
发明简述本发明的目的是提供满足上述需要的方法。
因此，本发明提供了产生雄性不育植物的方法，其特征在于其包括通过在所述植物中增加体内羟基茉莉酮酸酯的磺基化水平或降低11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯的合成水平以降低11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯水平的步骤。
本发明的另一个目标是提供了能帮助将外源核酸转入分离的细胞并且进行表达和/或帮助将外源核酸整合到所述细胞基因组上的植物细胞转化载体，其特征在于所述载体至少包含一个启动子序列、一个增强子和一个外源核酸序列。所述启动子是组成型表达启动子或是可诱导启动子。所述外源核酸选自与SEQ ID no.1或SEQ ID no.2具有至少50％同源性的核酸序列，以及其编码的氨基酸序列与SEQ IDno.3或SEQ ID no.4的氨基酸序列具有至少50％同源性的核酸。
本发明的另一个目的是提供了用于生产雄性不育植物的方法，所述方法包括-通过上面定义的载体将外源核酸分子导入合适植物的细胞中；-从所述细胞再生转基因植物；并且必要时-培养所述转基因植物，其培养时间和培养条件足以允许外源核酸序列表达，并因此刺激羟基茉莉酮酸磺基转移酶表达。
本发明的另一个目的是提供了遗传改造的雄性不育植物，其特征在于其11-或12-羟基茉莉酮酸酯的内源水平比非遗传改变植物中11-或12-羟基茉莉酮酸酯的内源水平低。
本发明的进一步目的是提供了遗传改造植物，其特征在于其11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶的内源水平比非遗传改变植物中11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶的内源水平高。
根据本发明的另一个目的，提供了用于在根据本发明遗传改造的雄性不育植物中恢复花药正常发育的组合物，所述组合物至少包含一种茉莉酮酸酯和可接受的载体。
根据本发明的另一个目的，提供了用于在遗传改造的雄性不育植物中恢复花药正常发育的组合物，所述组合物至少包含一种11-/12-OHJA磺基转移酶抑制剂和可接受的载体。
还有，根据本发明的另一个目的，提供了用于在遗传改造的雄性不育植物中恢复正常花药发育的方法，所述方法包括对所述植物的雄性不育花施用一种如上描述的组合物。
附图简述
图1表示11-羟基茉莉酮酸和12-羟基茉莉酮酸的化学结构。
图2表示与野生型比较时，使用从筛选的转基因株系中提取的mRNA进行Northern印迹实验的结果。
图3的组合图表示来自表达AtST2a基因的转基因烟草(Nicotiana tabacum)植物花的表型与来自野生型非转基因植物(WT)的花的表型对比，所述AtST2a基因的表达在组成型启动子(CaMV35S)控制之下。
图4表示来自野生型和突变体花的切离组织中茉莉酮酸酯的定量结果。
图5表示标准化实验的结果。用12-OHJA处理转基因植物的顶端14天导致修复所述突变体表型并且产生可生育的花粉。
图6表示获自GenBank(目录号NM_120783)的AtST2a基因核酸序列(SEQ ID NO 1)。
图7表示由图6显示的AtST2a基因编码的蛋白的氨基酸推导序列(SEQ ID NO 3)。
图8表示获自GenBank(目录号NM_120782)的AtST2b基因核酸序列(SEQ ID NO 2)。
图9表示由图8显示的AtST2b基因编码的蛋白的氨基酸推导序列(SEQ ID NO 4)。
发明详述A)定义为了对本说明书，包括对这些术语给定的范围提供更清晰和更一致的理解，提供如下定义11-羟基茉莉酮酸3-氧代-2-(4-羟基-2-戊烯基)-环戊烷-1-乙酸。其化学结构显示于
图1中。
11-羟基茉莉酮酸硫酸酯3-氧代-2-(4-羟基磺酰氧-2-戊烯基)-环戊烷-1-乙酸。
12-羟基茉莉酮酸3-氧代-2-(5-羟基-2-戊烯基)-环戊烷-1-乙酸。其化学结构显示于
图1中。
12-羟基茉莉酮酸硫酸酯3-氧代-2-(5-羟基磺酰氧-2-戊烯基)-环戊烷-1-乙酸。
反义是指在植物中能够调节相应基因表达的核酸分子。如此处所使用的反义分子也可包含了基因构建体，所述基因构建体包含了以相对于其或另外的启动子相反方向排列的结构基因组基因、cDNA基因或其部分。一般地反义核酸序列不是用于蛋白质合成的模板但仍可与其它分子(例如基因或RNA)的互补序列相互作用，从而导致那些分子的功能受到影响。
外源核酸通常不属于植物基因组部分的核酸序列(例如cDNA、cDNA片段、基因组DNA片段、反义RNA、寡核苷酸)。所述“外源核酸”可来自任何生物或完全合成而来。一般地，所述“外源核酸序列”编码植物基因例如AtST2a、AtST2b或这些基因的功能性同源物。
表达将外源核酸例如编码基因的核酸序列转录成mRNA并在之后翻译成肽或蛋白质以执行其功能(如果有的话)的过程。
功能性同源物是指在核苷酸或氨基酸序列的水平上与给定的核酸或氨基酸序列的至少一个或更多个区域具有至少50％、或更优选地至少55％、甚至更优选地至少60％、还有更优选地至少65-70％，以及甚至更优选地大于85％相似性的分子。根据本发明优选的实施方案，所述术语“功能性同源物”是指编码与11-或12-羟基茉莉酮酸酯磺基转移酶及其同功酶具有基本相似生物学活性的酶的蛋白质或核酸序列。这类功能性同源物可以是天然存在的或可以通过使用本领域熟知的方法和原理相对于所述天然发生的酶进行单个或多个氨基酸取代、删除和/或添加获得。蛋白的功能性同源物可能含有或不含有翻译后修饰例如共价连接的糖类，如果这类修饰不是行使特定功能所必需的。然而，应当注意的是核苷酸或氨基酸序列可能具有低于上述百分比的相似性并且仍然编码11-或12-羟基茉莉酮酸酯磺基转移酶类似分子，并且只要这类分子具有序列保守的区域其仍可被认为是在本发明的范围内。
遗传/核苷酸序列这些术语在此处以其最普遍的意思使用并且包含任意相邻连续的核苷酸碱基，所述相邻连续的核苷酸碱基直接地或通过互补的连续碱基编码包括羟基茉莉酮酸磺基转移酶分子并且更特别地是11-或12-OHJA磺基转移酶的氨基酸序列。这样的氨基酸序列可构成如SEQ ID No1和SEQ ID No2所列序列的全长11-或12-OHJA磺基转移酶或其有活性的截短形式或其功能突变体、衍生物、部分、片段、同源物或类似物，或可对应于所述酶的特定区域例如N末端、C末端或内部部分。
遗传改造或遗传工程是指将外源核酸导入一个或多个植物细胞以产生遗传改造植物。用于对植物进行遗传改造的方法在本领域是众所周知的。在某些情况下，遗传改造优选地可以是永久性的，这样遗传改造植物可以再生成完整的、具有性能力的、能生育的遗传改造植物。以永久方式遗传改造的植物将优选地能自花传粉或与其它同种植物异花传粉，这样携带于生殖系中的所述外源核酸可插入到或交配到农业上有用的植物品种中。
内源水平是指在给定的时间和生长阶段在植物(本身的)中正常发现的给定物质的量。此处是指化合物或酶活性的内源水平变化，所述变化涉及所述化合物的水平或酶活性高达30％或更优选的30-50％、或甚至更优选地50-70％或仍然更优选75％的提高或降低或大大高于或低于所述正常的内源水平或存在的水平。化合物的水平或酶活性的水平可使用已知的方法和技术进行测定。
抑制剂如此处所使用的，所述术语“抑制”、“抑制的”和“抑制剂”都是指显著降低生物学活性或功能的功能。这种在活性或功能上的降低可以是例如与细胞组份(例如酶)相关的，或与细胞过程(例如特定蛋白的合成)相关。关于“酶的抑制剂”，这种抑制剂可以以可逆或不可逆的方式结合到酶的活性部位或改变其构象。更具体地，所述术语“抑制剂”扩展至与酶11-或12-OHJA磺基转移酶相互作用的化合物。
分离的核酸分子是指在非天然发生状态下的遗传序列。通常，这是指从其天然状态分离出来或通过在其天然环境中不必遭遇到的方法形成的。更具体地，其包括在体外形成和保持的核酸分子，包括基因组DNA片段、重组或合成的分子和异源核酸例如与本发明遗传序列融合或有效连接的异源核酸。所述术语“分离的核酸分子”也扩展至基因组DNA或cDNA或其部分，所述基因组DNA或cDNA或其部分以相对于其或另外的启动子相反的方向编码羟基茉莉酮酸磺基转移酶，优选地11-或12-OHJA磺基转移酶、或11-或12-OHJA磺基转移酶的功能性突变体、衍生物、部分、片段、同源物或类似物。其进一步扩展至相对于其它核酸序列至少进行部分纯化的天然发生的序列。应该理解此处所使用的术语分离的核酸分子具有与核酸分离物相同的意思。
植物是指完整的植物或植物部分，其包括例如植物细胞、植物组织、外植体或植物的种子。该术语进一步涉及悬浮培养或组织培养形式的植物，所述培养形式包括但不限于愈伤组织、原生质体、胚、器官、细胞器等的培养。
相似性/互补性在核酸序列的上下文中，这些术语是指在如下所限定的较低的、可选择地和优选的中等的以及可选择的和最优选的高严紧条件下可杂交的相似性。这类核酸在例如从各种来源中筛选羟基茉莉酮酸磺基转移酶遗传序列优选地11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶遗传序列或用于监控转基因植物中导入的遗传序列时是有用的。所述优选的寡核苷酸是导向保守的羟基茉莉酮酸磺基转移酶，优选地11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶遗传序列或在植物属、种和/或栽培品种或变种范围内保守的序列。
严紧性为了确定严紧性的水平，可便利地参考Maniatis等人(1982)的文献387-389页，特别是第11段。此处低严紧性被定义为于37-45℃下在4-6XSSC/1％(w/v)SDS中进行2-3小时。根据杂交中涉及的核酸浓度和来源，可应用其它的严紧条件例如中等严紧条件此处被定义为于高于或等于45℃下在1-4XSSC/0.5-1％(w/v)SDS中进行2-3小时；或高度严紧条件此处被定义为于高于或等于60℃下在0.1-1XSSC/0.1-1.0％SDS中进行1-3小时。
转化的植物是指将外源核酸，通常是基因，导入整株植物或其部分并且在植物中表达所述外源核酸。
转基因植物是指通过使用遗传工程方法将外源核酸导入单个植物细胞的基因组中从而获得的稳定转化的整株植物或其部分。
载体自我复制的RNA或DNA分子，所述分子可用于将RNA或DNA片段从一个生物体转移到另一个生物体。载体特别地可用于操作遗传构建体，并且不同载体在克隆过程中可能具有特别适合于在接受体中表达蛋白的性质，并且可以包含不同的选择标记。细菌质粒是通常使用的载体。优选地，本发明的载体可帮助将核酸转移到植物细胞中和/或帮助整合到植物基因组中。
B)发明总述本发明者现已发现通过在植物体内增加羟基茉莉酮酸酯的磺基化作用或降低11-或12-羟基茉莉酮酸酯的合成以降低11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯的水平可能会产生雄性不育植物。因而，本发明涉及遗传改造的雄性不育植物以及植物细胞转化载体。本发明也涉及用于产生这类植物或用于在这样产生的雄性不育植物中恢复正常花药发育的方法。
如上所述，本发明提供了遗传改造的雄性不育植物。更特别地，本发明遗传改造的雄性不育植物的特征在于其11-或12-羟基茉莉酮酸酯的内源水平低于非传遗改造植物中11-或12-羟基茉莉酮酸酯的内源水平。进一步优选地，本发明遗传改造的雄性不育植物的特征在于其11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶的内源水平高于非遗传改造植物中11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶的内源水平。
如此处所使用的，所述术语“高于”是指相对于非遗传改造植物中的磺基转移酶水平，遗传改造植物中磺基转移酶的水平呈显著增长。相对于非遗传改造植物中的磺基转移酶水平，遗传改造植物中的磺基转移酶水平的这种显著增长优选地至少是25％。
如此处所使用的，所述术语“低于”是指相对于非遗传改造植物中的11-或12-羟基茉莉酮酸酯水平，遗传改造植物中的11-或12-羟基茉莉酮酸酯水平呈显著降低。相对于非遗传改造植物中的11-或12-羟基茉莉酮酸酯水平，遗传改造植物中的11-或12-羟基茉莉酮酸酯水平的这种显著降低优选地至少是25％。
应当理解，根据本发明，在本发明的遗传改造的雄性不育植物中具有更高的羟基茉莉酮酸磺基转移酶内源水平将允许12-羟基茉莉酮酸和/或11-羟基茉莉酮酸的磺基化。因此，当与对应的非遗传改造植物比较时，所得的遗传改造的雄性不育植物将有利地具有至少一种给定的茉莉酮酸酯家族化合物降低的内源水平，所述化合物选自12-OHJA、12-OHJA的葡糖苷、12-羟甲基茉莉酮酸、12-羟甲基茉莉酮酸的葡糖苷、11-OHJA、11-OHJA的葡糖苷、11-羟甲基茉莉酮酸和11-羟甲基茉莉酮酸的葡糖苷以及12-OHJA、12-OHJA的葡糖苷、11-OHJA、11-OHJA的葡糖苷的氨基酸缀合体。
根据另一个实施方案，本发明通过包括降低11-或12-羟基茉莉酮酸酯水平的步骤的方法有利地产生遗传改造的雄性不育植物，所述降低11-或12-羟基茉莉酮酸酯的水平是通过在所述植物中增加体内羟基茉莉酮酸酯磺基化水平或降低11-或12-羟基茉莉酮酸酯合成水平来实现的。根据优选的实施方案，通过增加所述植物中羟基茉莉酮酸酯磺基转移酶的内源活性来增加体内羟基茉莉酮酸酯磺基化水平，同时通过降低所述植物中茉莉酮酸11-/12-羟化酶活性来降低11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯合成的水平。
如可被意识到的，体内羟基茉莉酮酸酯磺基化水平的增加或11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯合成水平的降低可通过任何本领域技术人员已知的方法获得，例如但不限于，选自所述植物的遗传改造、所述植物的辐射诱变、所述植物的化学诱变和自然突变体的筛选之类的方法。更优选地，所述方法由遗传改造组成。
应当理解在11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯合成水平降低的状况下是优选的，负责茉莉酮酸转化成11-和/或12-OHJA的羟化酶的表达降低可通过方法例如反义技术、基因敲除、表达抑制羟化酶活性的抗体或表达对转化茉莉酮酸的11-或12-羟化酶的mRNA特异性的核酶来获得。
在本发明优选的实施方案中，通过刺激至少一个选自AtST2a、AtsT2b和其功能性同源物的基因或至少一个选自AtST2a、AtST2b、与SEQ ID no.1或SEQ ID no.2具有至少50％同源性的其功能性同源物和编码与氨基酸序列SEQ ID no.3或SEQ ID no.4具有至少50％同源性的氨基酸序列的核酸的基因的表达来改造所述植物。
SEQ ID NO 1(图.6；GenBank目录号NM_120783)对应于拟南芥的AtST2a基因。SEQ ID NO 3(图.7)是从SEQ ID NO 1推导的氨基酸序列。该氨基酸序列是个公开的结构域并且可从GenBank中获得，目录号NM_120783。所述来自拟南芥的AtST2a基因编码高度特异性地磺基化12-OHJA和11-OHJA的磺基转移酶。该羟基茉莉酮酸磺基转移酶对其底物表现出高度亲和力，对于12-OHJA Km值为11μM和对于11-OHJA Km值为60μM。所述酶不接受结构相关的化合物例如南瓜酸、花生四烯醇(arachidonyl alcoho1)或前列腺素。在Tris/HCl缓冲液中pH7.5时观察到最大酶活性并且其活性不需要二价阳离子。
SEQ ID NO 2(图.8；GenBank目录号NM_120782)对应于拟南芥的AtST2b基因。SEQ ID NO 4(图.9)是从SEQ ID NO 1推导的氨基酸序列。该氨基酸序列是个公开的结构域并且可从GenBank中获得，目录号NM_120782。SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4之间的氨基酸比对表明其享有85％的氨基酸序列一致性和92％的相似性，暗示着AtST2a和AtST2b编码同工酶。
此处所涉及的核酸分子可单独存在或与植物转化载体组合。因此，本发明的另一方面提供了植物细胞转化载体，所述载体能帮助将外源核酸转移到分离的细胞中并且进行表达和/或帮助外源核酸整合到所述细胞的基因组中，其特征在于所述载体包含至少一个启动子序列、一个增强子序列例如AMV翻译增强子和一个外源核酸序列。优选地，所述启动子序列是组成型表达启动子例如泛素启动子或可诱导的启动子例如乙醇诱导的启动子或糖皮质激素诱导的启动子。更优选地，所述启动子是CaMV35S。所述外源核酸选自与SEQ ID no.1或SEQ IDno.2具有至少50％同源性的核酸序列，以及其编码的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID no.3或SEQ ID no.4具有至少50％的同源性的核酸。这样的载体可以，例如，适用于电穿孔、微粒轰击、农杆菌(Agrobacterium)介导的转移或通过DNA或RNA病毒插入。所述载体和/或其中所含的核酸分子可以或者可以不稳定地整合入植物基因组。所述载体也可在原核细胞中复制和/或表达。优选地，所述载体分子或其部分能整合到植物基因组中。
通过使用来源于拟南芥的核酸序列对本发明进行举例说明，因为这种植物是受到普遍研究的并且其代表方便和易于获得的材料来源。然而，本领域技术人员立刻意识到可以从任何来源例如其它植物或某些微生物(例如真菌或细菌)中分离出类似的序列。所有这些直接或间接编码茉莉酮酸磺基转移酶的序列无论其来源都包括在本发明中。其它合适的编码茉莉酮酸磺基转移酶的基因来源包括，但不限于欧洲油菜(Brassica napus)、马铃薯(Solanum tuberosum)、Solanumdemissum、烟草(Nicotiana tabacum)，菊芋(Helianthus tuberosus)和背扁黄芪(Astragalus complanatus)。
根据另一个实施方案，本发明提供了包括下列步骤的方法a)通过根据上述的本发明的载体将外源核酸分子导入合适植物细胞中，所述载体包含编码植物羟基茉莉酮酸磺基转移酶的核酸序列，优选地是11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶；b)从所述细胞再生转基因植株；并且如果必要c)生长所述转基因植物，其生长时间和生长条件足以允许外源核酸序列表达，并因此刺激植物羟基茉莉酮酸磺基转移酶，特别是11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶的表达。
转基因植物构建的细节对植物遗传工程的技术人员来说是已知的而且与那些之前曾被证明在烟草、矮牵牛和其它模式植物品种中有效的实践(例如，电穿孔、微粒轰击、农杆菌介导的转移或通过DNA或RNA病毒插入)并没有不同。本领域技术人员立刻认识到可用于本发明方法的变化，例如增加天然存在于目的植物中的磺基转移酶的表达可导致雄性不育植物的产生。因此，本发明扩展到所有包含所有或部分本发明核酸序列的转基因植物，和/或任何其同源物或相关形式和特别是那些表现雄性不育表型的转基因植物。
根据本发明，过量表达羟基茉莉酮酸酯磺基转移酶的植物的雄性不育表型可被有利地修复。因此，本发明的另一个实施方案提供了用于在本发明的遗传改造的雄性不育植物中恢复正常花药发育的方法，所述方法通过对所述植物的雄性不育花施用如下文中定义的组合物而实现。在优选的实施方案中，通过在第一个花蕾出现前7天开始每天将雄性不育花浸泡在所述组合物中2分钟，并在第一朵花出现后7天结束浸泡，完成对所述植物雄性不育花应用所述组合物的步骤。
本发明所涉及的组合物包括至少一种茉莉酮酸酯和可接受的载体。优选地，所述茉莉酮酸酯选自11-羟基茉莉酮酸、12-羟基茉莉酮酸、11-羟基茉莉酮酸葡糖苷、12-羟基茉莉酮酸葡糖苷、11-羟甲基茉莉酮酸、11-羟甲基茉莉酮酸葡糖苷、12-羟甲基茉莉酮酸和12-羟甲基茉莉酮酸葡糖苷。上述化合物的结构类似物也可用于恢复所述表型。在本发明优选的实施方案中，遗传改造的雄性不育植物中正常花药的发育可通过对所述植物的雄性不育花施用含有100μM的12-羟基茉莉酮酸或50μM的甲基茉莉酮酸和可接受的载体的组合物进行恢复。所述组合物优选地进一步含有TWEEN20TM，例如以占其总重量的0.05重量百分比的浓度。
如此处所使用的，所述术语“可接受的载体”是指能导入植物而无有害作用的载体，用于含有茉莉酮酸酯。本领域技术人员所知的合适载体包括，但不限于，溶剂例如水、油或醇。所述载体可包括辅助试剂例如肥料和生长调节因子。如果需要，本发明所考虑的组合物也可以在杀真菌剂或杀虫剂存在的情况与乳化剂进行配制。应用于本发明实践中的化合物的精确用量取决于如下列实施例中显示的受处理植物类型和想要的反应、使用的制剂的类型。
可选择地，并且根据另一个实施方案，本发明提供了通过对遗传改造的雄性不育植物的雄性不育花施用含有11-/12-OHJA磺基转移酶抑制剂和可接受载体的组合物以恢复所述植物正常花药发育的方法。
实施例下列实施例用于举例说明本发明广泛的应用性。本发明不限于生产雄性不育烟草植物而且还可以应用到所有开花植物品种中。对根据本发明方法连同其它此处没有特别说明的植物产生雄性不育植物的识别很容易地在本领域技术人员的能力之内。下列的实施例只是用来说明本发明并不用来限制其范围。可对其进行改造和变化而并不背离本发明的精神和范围。
下列实验方法和材料用于下面列出的实施例。
A)材料与方法使用载体的研究为了转基因研究，将来自包含两个串联CaMV35S启动子、之后接着AMV翻译增强子和NOS终止子的质粒pBI-525的EcoR1-HindIII盒连接到之前用相同限制性内切酶降解的质粒pB1-101上。所得的称为pB1-101-525的载体包含两个串联CaMV35S最小启动子，之后接着AMV翻译增强子、NOS终止子和卡那霉素抗性基因。将AtST2a cDNA(SEQ IDNO 1；图.7)以有义方向在BaMHI位点克隆入位于AMV增强子下游的多位点接头处。各种其它启动子可用于驱动外源基因在植物中的表达。例如泛素启动子可用于组成型表达。可选择地，也可以使用可诱导的启动子例如乙醇诱导的启动子或糖皮质激素诱导的启动子。
农杆菌转化通过描述于Gynheung等人(1988)的Biology Manual，A31-19的方法将AtST2a-pBI-101-525有义构建体转化根癌农杆菌(A.tumefaciens)株系LBA4404。
烟草转化通过使用Horsch，R.B.等(1984)Science，Vol.227，1229-1231中所描述的叶片盘转化(leaf disk transformation)方法产生转基因烟草植物。
mRNA提取物的Northern印迹杂交根据Sambrook等人(1989)描述的方法使用酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1从冰冻组织中提取总RNA。以每泳道20μg总RNA接受电泳并且根据Sambrook等人(1989)的方法进行Nor t hern印迹杂交。用32P标记的包含完整编码序列的拟南芥AtST2a cDNA片段在65℃下与印迹杂交16小时。
Western印迹分析为了分析AtST2a的表达，将来自T1和T2代植株的叶子在液氮中碾磨，并且将粉末在2XSDS样品缓冲液中煮沸。通过在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白提取物并且将其转移到硝酸纤维素膜上。使用抗AtST2a多克隆抗体(稀释1∶1000)和缀合碱性磷酸酶(稀释1∶3000；Bio RadTM)的山羊抗兔二级抗体免疫检测AtST2a。为确定各样品是等量上样的，将蛋白提取物在SDS-PAGE上跑电泳并且用考马斯亮兰染色。
植物生长条件将野生型(SNN)和转基因植物在具有16小时光周期的温室条件下种植在土壤中。
标准化实验将株系7的T2代植物的顶端每天浸入含有下列的溶液中0.05％Tween20水溶液(对照)、含有50μM MeJA的0.05％Tween20水溶液或含有100μM 12-OHJA的0.05％Tween20水溶液中。所述处理在接近第一个花蕾出现前7天开始进行并持续总共14天。在本研究中各处理组最少要分析5颗植株。
B)结果本发明者证明通过异源表达编码12-OHJA磺基转移酶的拟南芥基因AtST2a可以产生雄性不育转基因烟草植物。通过农杆菌介导的转化将AtST2a基因导入烟草植株。植物进行再生并且通过对卡那霉素的抗性筛选转化的植株。通过Southern、Northern和Western印迹杂交确认转化。产生了29个独立的转基因株系。图2显示对三个筛选的转基因株系的Northern印迹杂交照片。来自四个株系(包括株系7)的植物表现雄性不育表型并且发现所述表型与高水平的AtST2a表达相关(图3和2C)。除了雄性不育表型外，在所述转基因株系中没有观察到其它表型改变。
这些结果清楚地表明通过改变磺基化12-OHJA的酶的水平可产生雄性不育植物。也可以预测抑制内源茉莉酮酸11-/12-羟化酶表达将产生同样的效果。
在转基因株系7切下的花组织中对不同茉莉酮酸酯的水平进行定量，并与野生型比较。图4中展示的结果显示花药在野生型花中是积累12-OHJA的优选位置。相反地，当与野生型对比时，观察到在转基因植物的花药中12-OHJA的量急剧减少。这些结果肯定了12-OHJA磺基转移酶的过量表达导致转基因烟草植物花药中12-OHJA的减少。
为了恢复表型，将转基因植物(株系7)的顶端每日浸在含有100μM溶解于0.05％Tween20水溶液中的12-OHJA的溶液中2分钟。所述应用在接近第一个花蕾出现前7天开始并且持续到第一朵花出现后7天。所述结果显示12-OHJA的应用恢复了正常花药的发育(图5)。用50μM MeJA(12-OHJA生物合成的前体)可获得相似结果(数据未显示)。用载体溶液的对照处理没有恢复正常花药发育。12-OHJA的应用也显示修复了拟南芥opr3突变体的雄性不育表型(数据未显示)。
这些结果显示在烟草转基因株系7和拟南芥opr3突变体中观察到的与12-OHJA缺乏相关的雄性不育表型可通过施用12-OHJA修复。
权利要求
1.用于产生雄性不育植物的方法，所述方法特征在于包括在所述植物中增加体内羟基茉莉酮酸酯磺基化水平或降低11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯生物合成水平以降低11-和/12-羟基茉莉酮酸酯水平的步骤。
2.权利要求1的方法，其特征在于通过在所述植物中增加羟基茉莉酮酸酯磺基转移酶的内源活性以增加体内羟基茉莉酮酸酯磺基化水平。
3.权利要求1的方法，其特征在于在所述植物中降低茉莉酮酸11-/12-羟化酶的活性以降低11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯合成水平。
4.权利要求1到3中任一项的方法，其特征在于通过选自所述植物的遗传改造、所述植物的辐射诱变、所述植物的化学诱变和天然突变体的筛选的方法实现体内羟基茉莉酮酸酯磺基化水平的增加或11-和/或12-羟基茉莉酮酸酯合成水平的降低。
5.权利要求4的方法，其特征在于所述方法为遗传改造。
6.权利要求5的方法，其特征在于通过刺激选自下列的至少一个基因的表达来增加磺基转移酶的内源活性AtST2a、4tST2b、与SEQID no.1或SEQ ID no.2具有至少50％同源性的其功能性同源物以及编码与氨基酸序列SEQ ID no.3或SEQ ID no.4有至少50％同源性的氨基酸序列的核酸。
7.植物细胞转化载体，所述载体能帮助将外源核酸转移到分离的细胞中并且进行表达和/或帮助外源核酸整合到所述细胞的基因组中，其特征在于所述载体包含至少一个启动子序列、一个增强子序列和一个外源核酸序列，所述启动子序列是组成型表达启动子或是可诱导的启动子，所述外源核酸选自与SEQ ID no.1或SEQ ID no.2具有至少50％同源性的核酸序列以及编码与氨基酸序列SEQ ID no.3或SEQ IDno.4具有至少50％同源性的氨基酸序列的核酸。
8.权利要求7的载体，其特征在于所述可诱导的启动子是乙醇诱导的启动子或糖皮质激素诱导的启动子。
9.权利要求7的载体，其特征在于所述组成型表达启动子是泛素启动子。
10.权利要求7的载体，其特征在于所述启动子是CaMV 35S启动子。
11.权利要求7的载体，其特征在于所述增强子是AMV翻译增强子。
12.产生雄性不育植物的方法，其特征在于所述方法包括-通过如权利要求7到11中任一项定义的载体向合适植物的细胞中导入外源核酸分子；-从所述细胞再生转基因植物；并且如果必要-生长所述转基因植物，其生长时间和生长条件足以允许外源核酸序列的表达，并因此刺激羟基茉莉酮酸磺基转移酶表达。
13.遗传改造的雄性不育植物，其特征在于在所述遗传改造的雄性不育植物中11-或12-羟基茉莉酮酸酯的内源水平比非遗传改造植物中11-或12-羟基茉莉酮酸酯的内源水平低。
14.遗传改造的雄性不育植物，其特征在于在所述遗传改造的雄性不育植物中11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶的内源水平比非遗传改造植物中11-或12-羟基茉莉酮酸磺基转移酶的内源水平高。
15.用于恢复遗传改造的雄性不育植物中正常花药发育的组合物，所述组合物包含至少一种茉莉酮酸酯和可接受的载体。
16.权利要求15的组合物，其特征在于所述茉莉酮酸酯选自11-羟基茉莉酮酸、12-羟基茉莉酮酸、11-羟基茉莉酮酸葡糖苷、12-羟基茉莉酮酸葡糖苷、11-羟基甲基茉莉酮酸、11-羟基甲基茉莉酮酸葡糖苷、12-羟基甲基茉莉酮酸和12-羟基甲基茉莉酮酸葡糖苷。
17.权利要求15的组合物，其特征在于所述组合物包含100μM的12-羟基茉莉酮酸或50μM的甲基-茉莉酮酸。
18.权利要求17的组合物，其特征在于所述组合物进一步包含TWEEN20TM。
19.权利要求18的组合物，其特征在于所述组合物包含占所述组合物总体积的0.05重量百分比的浓度的TWEEN20TM。
20.一种方法，所述方法用于在权利要求13或14中任一项所定义的遗传改造的雄性不育植物中恢复正常花药发育，其包括对所述植物的雄性不育花施用权利要求15到19中任一项所定义的组合物。
21.权利要求20的方法，其特征在于通过在第一个花蕾出现前7天开始每天将雄性不育花浸在所述组合物中2分钟，并在第一朵花出现后7天结束浸泡，从而完成对所述植物雄性不育花施用所述组合物的步骤。
22.组合物，所述组合物用于在遗传改造的雄性不育植物中恢复正常花药的发育，所述组合物包含至少一种11-/12-OHJA磺基转移酶抑制剂和可接受的载体。
23.一种方法，所述方法用于在权利要求13或14中任一项所定义的遗传改造的雄性不育植物中恢复正常花药的发育，其包括对所述植物的雄性不育花施用如权利要求22所定义的组合物。
全文摘要
本发明涉及通过植物的遗传改造增加羟基茉莉酮酸酯磺基转移酶的活性水平来产生雄性不育的这类植物的方法。此外，本发明提供了通过对所述雄性不育花施用包含至少一种茉莉酮酸酯和可接受载体的组合物以恢复在这类遗传改造的植物中观察到的雄性不育表型的可育性的方法。
文档编号A01N37/06GK1771326SQ200480004534
公开日2006年5月10日 申请日期2004年1月13日 优先权日2003年1月13日
发明者H·茂驰尔, O·米尔施, C·瓦斯特纳克, L·瓦林 申请人:弗罗里塞斯公司, 植物生化学院