专利名称：布氏乳酸杆菌制剂、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于饲料领域，涉及一种功能菌种—布氏乳酸杆菌(L.buchneri)制剂、其制备方法，以及采用布氏乳酸杆菌制剂改善全株玉米青贮饲料开窖后稳定性的用途。
背景技术：
青贮饲料种类繁多，具有来源广，成本低，采集方便，适口性好和养分比较全面等特点，是有关食草性动物的主要饲料，比如是牛、羊等的理想饲料。一般禾本科作物、豆科作物、块根、块茎以及水生饲料和树叶等均可用来青贮。目前用得最多的是专门种植用于青贮的玉米(带谷穗)，其次是摘穗后的玉米秸、高粱秸以及甘薯藤。
青贮的原理是在适宜的条件下，通过厌氧发酵，产生酸性环境，抑制有害微生物的繁衍，从而达到保存饲料的目的。青贮饲料是一个复杂的微生物共生体系，主要包括乳酸菌，酵母菌，梭状芽孢杆菌和芽孢杆菌，乙酸菌，霉菌，其中以乳酸菌的数量和种类最多，也是在青贮饲料发酵中起主要作用的微生物。乳酸菌产酸和耐酸能力都很强，它们能够利用原料中的碳水化合物进行乳酸发酵，形成乳酸和少量乙酸，可使青贮饲料中乳酸含量达到1.5％～2％，使得pH降低。由于青贮饲料中添加了天然快速发酵剂，所以在发酵前期，可以快速降低环境pH值，pH值的迅速下降，不仅抑制丁酸菌的繁殖，也能阻止其他不良菌，如丝状真菌、酵母及霉菌的生长，从而有利于改善青贮饲料的发酵品质。
在制作时，整株秸秆(包括杆、茎、叶)都可用于青贮，秸秆的绿色和叶片可以保存下来。所以，能保存作物秸秆中85％以上的养分。而且由于青贮饲料柔软多汁、气味酸甜芳香，适口性好，十分适于饲喂肉牛，肉牛也很喜欢采食；并能促进消化腺的分泌，对于提高饲料的消化率有良好作用。
玉米青贮饲料是养牛业必不可少的常用饲料，一头牛平均每天采食20千克左右，青贮饲料由于可以全年均衡供给，因此可以克服冬春季节由于缺乏优质的青粗饲料对养牛业带来的不利影响。玉米青贮饲料是我国养牛业的主要饲料，而全株玉米青贮在世界范围内已经被广泛采用，近年来随着奶业的快速发展，在我国养牛业中已经普遍被接受和采用。
全株玉米是一种制备青贮饲料的主要原料，其制备简易，历史久远。然而，传统方法制备的玉米青贮饲料由于采用乳酸发酵，青贮完成后其乙酸、丙酸等浓度偏低，开窖后由于厌氧环境被破坏，耗气性微生物重新大量滋生，引起其稳定性急剧下降，主要特征是酵母、霉菌大量滋生，葡萄糖氧化速度加快，CO2产生量快速增加，不仅造成玉米青贮饲料品质下降，而且由于霉菌大量滋生所产生的霉菌毒素给饲料安全带来极大风险。如不及时利用或利用速度过慢，由于其稳定性急剧下降会造成大量损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种可改善青贮饲料开窖后稳定性和提高全株玉米青贮品质布氏乳酸杆菌(L.buchneri)制剂。
本发明的另一目的是提供一种布氏乳酸杆菌制剂的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种布氏乳酸杆菌制剂在改善青贮饲料开窖后稳定性方面的用途，能有效提高玉米青贮饲料的品质，化解有害微生物大量增殖带来的饲料安全风险。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案为一种布氏乳酸杆菌制剂，每克含1×109～1×1011个布氏乳酸杆菌(L.buchneri)菌落形成单位(cfu/g)。
优选为，每克含1×109～1×1010个L.buchneri菌落形成单位(cfu/g)。
所述的布氏乳酸杆菌(L.buchneri)购自中国微生物菌种保藏中心(CICC)，CICC编号为6007。
布氏乳酸杆菌的生物学特性(1)杆菌，通常短和直，0.7～1.0×2.0～4.0微米，两端圆，单个或成短链。
(2)菌落一般粗糙或为中间型，扁平，可能近乎透明。
(3)异型发酵，从高压灭菌的葡萄糖培养基中产酸和气，对分别灭菌的葡萄糖是好氧分解代谢。发酵产物为DL-乳酸(50％的葡萄糖的总碳量)，其他较重要的产物是乙酸盐、乙醇和CO2。
(4)产生最大量酸的温度是23～30℃，菌种生长最适温度30℃。
为了便于运输使用并减少活菌冻干损失，延长乳酸菌剂产品货架期，可将乳酸菌剂制成冻干粉。当所述布氏乳酸杆菌制剂为冻干剂型时，还含有以制剂总重量计30～40％的冻干保护剂。
所述冻干保护剂为甘油和脱脂奶，甘油和脱脂奶的体积比1∶1～1∶2。
所述布氏乳酸杆菌制剂采用布氏乳酸杆菌(L.buchneri)经活化、接种培养、离心、冷冻干燥而成。
为实现本发明的另一目的，本发明所述布氏乳酸杆菌制剂的制备方法，包括如下步骤1)将布氏乳杆菌种在活化培养基中28～32℃下活化培养15～20h；然后采用平板划线法在28～32℃下纯化培养基中进行纯化培养1～2天，得纯化菌液；2)再将纯化菌液以3～7％的接种量接种到发酵罐中，pH值控制在5.0～7.0，在发酵培养基中28～32℃下混合培养30～40h得发酵液；3)然后所述的发酵液在20～26℃下，转速3000～4000转/分进行离心处理30～40分钟，得发酵菌泥；4)最后向发酵菌泥中加入所述冻干保护剂后，进行冷冻干燥得乳酸菌冻干粉。
其中，所述的活化培养基为MRS液体培养基，其成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.3～6.5。
所述的纯化培养基为加碳酸钙的MRS琼脂培养基，MRS琼脂培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.3～6.5。在上述1000ml液体培养基中加入15～20g琼脂，7.5g碳酸钙，115℃高压灭菌15～20mim备用。
所述的发酵培养基也可采用MRS液体培养基，其成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.3～6.5。
本发明纯化培养时所采用的平板划线法为本领域常用的方法。
本发明所采用的发酵罐为本领域常用的发酵罐，可为5L、10L或50L等规格。
所述发酵过程中pH值的控制可采用乳酸调控。
所述冻干保护剂为甘油和脱脂奶，甘油溶液的浓度为8～15％，脱脂奶溶液为8～15％，以容积比1∶1～1∶2混合。
所述菌泥(细胞糊状物)与保护剂体积比1∶3～1∶4。
所用冷冻干燥工艺采用本领域常用的冷冻设备和工艺步骤即可。
比如，在-30～-40℃预冻5～7h，使其均匀冻结在瓶四周内壁上，然后用ALPHA-2真空冻干机，等温度降至-40～-50℃时，打开真空泵抽真空度至0.1mbar以下，装入干燥瓶，干燥12～24h。将干粉制品保藏在4℃冰箱中。
具体地说，所述布氏乳酸杆菌制剂的制备方法为1)布氏乳杆菌的活化培养在无菌的情况下，将布氏乳杆菌菌粉接种到MRS液体培养基内，在28～32℃下摇床培养15～20h。
MRS液体培养基，其成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.3～6.5。
2)布氏乳杆菌的分离纯培养(平板划线法)将已加入碳酸钙的MRS琼脂培养基倒入平皿，待培养基凝固后，用灭菌接种环蘸取已摇好的菌液进行划线，每个菌种做三个平皿，划好后，用封口胶封住平皿，倒置在28～32℃的生化培养箱内培养1～2天。选取个体均匀的单一菌落纯化培养，试验备用。平皿可以在4℃冰箱保存。
加碳酸钙的MRS琼脂培养基，MRS琼脂培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.3～6.5。在上述1000ml液体培养基中加入15～20g琼脂，7.5g碳酸钙，115℃高压灭菌15～20mim备用。
3)纯化菌液扩繁，培养将纯化菌液以布氏乳杆菌3～7％的接种量，接种于1000ml的锥形瓶中，锥形瓶中培养基的体积为475ml，则相应的接种菌液量为25ml；在28～32℃下pH值为5.0～7.0，培养30～40h；4)离心在20～26℃下，转速3000～4000转/分离心30～40分钟，弃上清液，得菌泥；5)冷冻干燥先将8～15％甘油溶液与8～15％脱脂奶粉溶液，以容积比为1∶1～1∶2混合作为保护剂，灭菌处理，再与菌泥(细胞糊状物)，以菌泥与保护剂体积比为1∶3～1∶4混合均匀；最后在-40～-50℃冷冻干燥12～24小时，制得菌粉。
本发明所述的布氏乳酸杆菌制剂可用于改善青贮饲料开窖后稳定性，能有效提高玉米青贮饲料的品质，化解有害微生物大量增殖带来的饲料安全风险。
布氏乳酸杆菌制剂用于制备青贮饲料的方法，包括饲料切割、每层饲料添加微生物添加剂，压实后密封发酵，青贮时接菌量为每克饲料含106～108个L.buchneri菌落形成单位(cfu)。
所述的饲料为新鲜玉米秸秆或全株玉米。
所述的微生物添加剂采用布氏乳酸杆菌制剂加去离子水配成悬浮液，浓度控制在1％～5％之间，边青贮边喷洒该悬浮液，按照常规青贮饲料的制备步骤即可。
也就是说，本发明所述的青贮饲料制备方法是以玉米秸秆或全株玉米为原料，在常温下经切碎、填充、接种、压实、密封、发酵、贮存等工序生产的优质安全稳定的玉米青贮饲料。
具体步骤如下先将蜡熟期收获的全株玉米切割成约2～3cm；然后将切割后的玉米填充到青贮窖中；在填充青贮窖的过程中，边青贮，边添加专用微生物添加剂，每千克玉米物料添加25克用去离子水混匀的微生物添加剂的悬浮溶液，使接菌量达到每克饲料含106～108个L.buchneri菌落形成单位(cfu)；在填充物料的过程中压实物料，尽量消除青贮窖内空气；填充完毕后，密封所青贮的物料；发酵3个月后即可开窖利用。
本发明采用布氏乳酸杆菌(L.buchneri)用于玉米青贮饲料的制备，解决了传统方法制备的玉米青贮饲料在开窖后稳定性急剧下降的问题，并能有效提高玉米青贮饲料的品质，化解有害微生物大量增殖带来的饲料安全风险。
本发明所制备的玉米青贮饲料优质安全稳定，适口性好，其pH值为3.8～4.31，干物质26～30％，乙醇0.6～1.4％，乙酸5.0～7.2％，乳酸2.0～13.5％，丙酸0.5～0.9％，丙醇1.1～2.0％。在青贮窖的中心部位，玉米青贮饲料中酵母和霉菌均无检出；而顶层酵母菌落数的对数值小于3.0，无霉菌检出。与传统青贮方法相比，以重量为单位计算，玉米青贮饲料中乳酸菌菌落总量提高10～100倍，而酵母数量减少到1/8～1/10。在常温下稳定性提高1倍以上(温度升高1℃所需时间为260小时以上)。
图1为不同处理的青贮饲料贮存期间干物质损失。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1布氏乳酸杆菌制剂采用布氏乳酸杆菌(L.buchneri)发酵培养、冷冻干燥而成；每克含9.5×1010个L.buchneri菌落形成单位(cfu/g)。
其中，布氏乳酸杆菌购自中国微生物菌种保藏中心(CICC)，CICC编号为6007。
布氏乳酸杆菌制剂中含33％的冻干保护剂，冻干保护剂为甘油和脱脂奶，体积比为1∶1。
具体制备过程如下1.布氏乳杆菌的活化培养在超净工作台中，将接种环在酒精灯内焰处灼烧，接种布氏乳杆菌菌粉到MRS液体培养基内，灼烧试管口和胶塞，塞好试管。将布氏乳杆菌放入30℃的摇床培养18h。
MRS液体培养基，其成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.3。
2、布氏乳杆菌的分离纯培养(平板划线法)将已加入碳酸钙的MRS琼脂培养基倒入平皿，待培养基凝固后，用灭菌接种环蘸取已摇好的菌液进行划线，每个菌种做三个平皿，划好后，用封口胶封住平皿，倒置在30℃的生化培养箱内培养2天。选取个体均匀的单一菌落纯化培养，试验备用。平皿可以在4℃冰箱保存。
其中，加碳酸钙的MRS琼脂培养基，MRS琼脂培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.5。在上述1000ml液体培养基中加入20g琼脂，7.5g碳酸钙，115℃高压灭菌15mim备用。
3、纯化菌液扩繁，培养将纯化菌液以布氏乳杆菌5％的接种量，接种于1000ml的锥形瓶中，锥形瓶中培养基的体积为475ml，则相应的接种菌液量为25ml；在30℃下PH值为6.0，培养36h；4、离心在26℃，4000转/分下离心30分钟，弃上清液，得菌泥；5、冷冻干燥先将10％甘油溶液与10％脱脂奶粉溶液，以容积比为1∶1混合作为保护剂，灭菌处理，再与菌泥(细胞糊状物)，以保护剂与菌泥体积比为3∶1混合均匀；最后在-50℃冷冻干燥24小时，制得菌粉。
实施例2布氏乳酸杆菌制剂采用布氏乳酸杆菌(L.buchneri)发酵培养、冷冻干燥而成；每克含1.2×1010个L.buchneri菌落形成单位(cfu/g)。
其中含40％的冻干保护剂，冻干保护剂为甘油和脱脂奶，体积比为1∶2。
具体制备过程如下1.布氏乳杆菌的活化培养在超净工作台中，将接种环在酒精灯内焰处灼烧，接种布氏乳杆菌菌粉到MRS液体培养基内，灼烧试管口和胶塞，塞好试管。将布氏乳杆菌放入32℃的摇床培养15h。
MRS液体培养基，其成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.5。
2、布氏乳杆菌的分离纯培养(平板划线法)将已加入碳酸钙的MRS琼脂培养基倒入平皿，待培养基凝固后，用灭菌接种环蘸取已摇好的菌液进行划线，每个菌种做三个平皿，划好后，用封口胶封住平皿，倒置在30℃的生化培养箱内培养1天。选取个体均匀的单一菌落纯化培养，试验备用。平皿可以在4℃冰箱保存。
其中，加碳酸钙的MRS琼脂培养基，MRS琼脂培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.3。在上述1000ml液体培养基中加入15g琼脂，7.5g碳酸钙，115℃高压灭菌18mim备用；3、纯化菌液扩繁，培养将纯化菌液以布氏乳杆菌3％的接种量，接种于1000ml的锥形瓶中，锥形瓶中培养基的体积为475ml，则相应的接种菌液量为25ml；在30℃下PH值为5.0，培养30h；4、离心在26℃，5000转/分下离心30分钟，弃上清液，得菌泥；5、冷冻干燥先将8％甘油溶液与12％脱脂奶粉溶液，以容积比为1∶2混合作为保护剂，灭菌处理，再与菌泥(细胞糊状物)，以保护剂与菌泥体积比为4∶1混合均匀；最后在-50℃冷冻干燥24小时，制得菌粉。
实施例3布氏乳酸杆菌制剂采用布氏乳酸杆菌(L.buchneri)发酵培养、冷冻干燥而成；每克含1.0×1011个L.buchneri菌落形成单位(cfu/g)。
其中含30％的冻干保护剂，冻干保护剂为甘油和脱脂奶，体积比为1∶1。
具体制备过程如下1.布氏乳杆菌的活化培养在超静工作台中，将接种环在酒精灯内焰处灼烧，接种布氏乳杆菌菌粉到MRS液体培养基内，灼烧试管口和胶塞，塞好试管。将布氏乳杆菌放入28℃的摇床培养20h。
MRS液体培养基，其成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.5。
2、布氏乳杆菌的分离纯培养(平板划线法)将已加入碳酸钙的MRS琼脂培养基倒入平皿，待培养基凝固后，用灭菌接种环蘸取已摇好的菌液进行划线，每个菌种做三个平皿，划好后，用封口胶封住平皿，倒置在30℃的生化培养箱内培养2天。选取个体均匀的单一菌落纯化培养，试验备用。平皿可以在4℃冰箱保存。
其中，加碳酸钙的MRS琼脂培养基，MRS琼脂培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸馏水100ml)5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，校正pH值为6.5。在上述1000ml液体培养基中加入18g琼脂，7.5g碳酸钙，115℃高压灭菌20mim备用。
3、纯化菌液扩繁，培养将纯化菌液以布氏乳杆菌7％的接种量，接种于1000ml的锥形瓶中，锥形瓶中培养基的体积为475ml，则相应的接种菌液量为25ml；在28℃下PH值为7.0，培养40h；4、离心在26℃，3000转/分下离心40分钟，弃上清液，得菌泥；
5、冷冻干燥先将8％甘油溶液与15％脱脂奶粉溶液，以容积比为1∶1混合作为保护剂，灭菌处理，再与菌泥(细胞糊状物)，以保护剂与菌泥体积比为3∶1混合均匀；最后在-50℃冷冻干燥24小时，制得菌粉。
实施例4制备方法同实施例1，不同的是，所述布氏乳酸杆菌制剂每克含1.0×109个L.buchneri菌落形成单位(cfu)。其中含35％的冻干保护剂，冻干保护剂为甘油和脱脂奶，体积比为1∶1。
实施例5制备方法同实施例1，不同的是，所述布氏乳酸杆菌制剂每克含1.3×1011个L.buchneri菌落形成单位(cfu)。其中含40％的冻干保护剂，冻干保护剂为甘油和脱脂奶，体积比为1∶2。
实验例1采用实施例1获得的布氏乳酸杆菌制剂制备青贮饲料，其制备方法如下将蜡熟期收获的全株玉米切割成2cm，将切割后的玉米填充到青贮窖中，在填充过程中，按照每千克玉米物料添加25克用去离子水混匀的布氏乳酸杆菌制剂的悬浮溶液，每克玉米物料提供1×106个L.buchneri菌落形成单位(cfu)；用铲车压实物料，注意不留死角，目的是尽量消除青贮窖内空气；填充完毕后，用黑色的聚乙烯塑料薄膜盖严所青贮的物料，沿青贮窖的四周用土或其它物料压实塑料薄膜，目的是防止发酵过程中由于产生气体而导致漏气，造成青贮厌氧环境的破坏；发酵3个月后即可开窖利用。
所制备的玉米青贮饲料优质安全稳定，适口性好，其pH值为4.3，干物质26％，乙醇0.8％，乙酸6.2％，乳酸2.0％，丙酸0.9％，丙醇2.0％。在青贮窖的中心部位，玉米青贮饲料中酵母和霉菌均无检出；而顶层酵母菌落数的对数值小于3.0，无霉菌检出。
实验例2本实验例目的在于研究本发明所述玉米青贮饲料开窖后稳定性(Aerobicstability)。
1、稳定性定义为温度升高1℃所需要的时间，单位小时(h)。
2、测定方法取0.3kg玉米青贮饲料装于开口的塑料瓶内，放置在20℃的室温下，连续260小时测定青贮饲料中心位置的温度变化。
3、衡量开窖后稳定性的指标(1)、主要指标稳定性(Aerobic stability)使用添加剂后稳定性由135小时提高的260小时以上，生物学统计检验差异极显著(p＜0.01)。
(2)、参考指标开窖后微生物的数量变化，单位log cfu g-1A有益菌乳酸菌总量(LAB)数量的对数值由8.31增加到9.07，生物学统计检验差异极显著(p＜0.01)；B有害菌酵母(Yeast)数量的对数值由3.23减少到2.46，生物学统计检验差异不显著(p＞0.01)；霉菌(Mould)未检出三、其他发现发酵产物中乙酸、丙酸含量明显增加(p＜0.01)，而这两个产物对有害菌均有抑制作用。
四、饲料中乳酸菌的添加量为每千克玉米物料添加25克用去离子水混匀的专用微生物添加剂的悬浮溶液，为每克玉米物料提供106～108个L.buchneri菌落形成单位(cfu)。即每吨用菌种约1～2千克。
五、试验处理说明青贮时共有6个试验处理，每个处理3袋。
Con＝对照组，每kg青贮料添加25g去离子水；g1＝葡萄糖处理1组，每kg青贮料添加37.5g葡萄糖溶液(其中含葡萄糖12.5g)；g2＝葡萄糖处理2组，每kg青贮料添加75g葡萄糖溶液(其中含葡萄糖25g)；L.b＝布氏乳杆菌(L.buchneri)处理组，每kg青贮料添加25g L.buchneri悬浮溶液(可为每g青贮料提供106cfu L.buchneri)；L.b+g1＝布氏乳杆菌(L.buchneri)+葡萄糖处理1组，每kg青贮料添加25g L.buchneri悬浮溶液(可为每g青贮料提供106cfu L.buchneri)+每kg青贮料添加37.5g葡萄糖溶液(其中含葡萄糖12.5g)L.b+g2＝布氏乳杆菌(L.buchneri)+葡萄糖处理2组，每kg青贮料添加25g L.buchneri悬浮溶液(可为每g青贮料提供106cfu L.buchneri)+每kg青贮料添加75g葡萄糖溶液(其中含葡萄糖25g)表1 供试全株玉米的成分测定与微生物组成
表2 玉米青贮饲料贮存91天时的化学组成、发酵产物浓度、微生物组成(青贮装置为聚乙烯双层塑料袋，每袋有2-kg全株玉米)
a，b，c，d，e，f同行肩注不同小写字母者表示差异显著(p＜0.05)A，B，C，D，E，F同行肩注不同大写字母者表示差异极显著(p＜0.01)结论图1为不同处理的青贮饲料贮存期间干物质损失，采用布氏乳杆菌比对照组干物质损失少，而且玉米青贮饲料中采用布氏乳杆菌比对照组乳酸菌菌落总量提高10～100倍，而酵母数量减少到1/8～1/10。在常温下稳定性提高1倍以上(温度升高1℃所需时间为260小时以上)。
权利要求
1.一种布氏乳酸杆菌制剂，其特征在于每克含1×109～1×1011个布氏乳酸杆菌(CICC编号为6007)菌落形成单位。
2.如权利要求1所述的布氏乳酸杆菌制剂，其特征在于每克含1×109～1×1010个L.buchneri菌落形成单位。
3.根据权利要求1或2所述的布氏乳酸杆菌制剂，其特征在于含有以制剂总重量计30～40％的冻干保护剂。
4.根据权利要求3所述的布氏乳酸杆菌制剂，其特征在于所述的冻干保护剂为甘油和脱脂奶，甘油和脱脂奶的体积比1∶1～1∶2。
5.一种制备权利要求1～4中任一权利要求所述的布氏乳酸杆菌制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤1)将布氏乳杆菌种在活化培养基中28～32℃下活化培养15～20h；然后采用平板划线法在28～32℃下纯化培养基中进行纯化培养1～2天，得纯化菌液；2)再将纯化菌液以3～7％的接种量接种到发酵罐中，pH值控制在5.0～7.0，在发酵培养基中28～32℃下混合培养30～40h得发酵液；3)然后所述的发酵液在20～26℃下，转速3000～4000转/分进行离心处理30～40分钟，得发酵菌泥；4)最后向发酵菌泥中加入所述冻干保护剂后，进行冷冻干燥得乳酸菌冻干粉。
6.根据权利要求5所述布氏乳酸杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的活化培养基为MRS液体培养基，其成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，pH值为6.3～6.5。
7.根据权利要求5所述布氏乳酸杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的纯化培养基为加碳酸钙的MRS琼脂培养基，MRS琼脂培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，pH值为6.3～6.5；在上述1000mi液体培养基中加入15～20g琼脂，7.5g碳酸钙，115℃高压灭菌15～20mim备用。
8.根据权利要求5所述布氏乳酸杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基为MRS液体培养基，其成分为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，盐酸甲5ml，将各成分加温溶解于蒸馏水中，过滤，加入葡萄糖20g，蒸馏水加至1000ml，pH值为6.3～6.5。
9.根据权利要求5所述布氏乳酸杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂为甘油和脱脂奶，甘油溶液的浓度为8～15％，脱脂奶溶液为8～15％，以容积比1∶1～1∶2混合，所述菌泥与保护剂体积比1∶3～1∶4。
10.根据权利要求1所述布氏乳酸杆菌制剂在用于制备玉米秸秆或全株玉米青贮饲料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种布氏乳酸杆菌制剂，其每克含1×10
文档编号A23K3/02GK1831111SQ200610011558
公开日2006年9月13日 申请日期2006年3月24日 优先权日2006年3月24日
发明者管武太, 杨金波 申请人:华南农业大学