专利名称：用于研究动脉粥样硬化损害的动物模型的制作方法
用于研究动脉粥样硬化损害的动物模型
本发明涉及动物模型、基因和生物化学/生物医学技术，特别是用 于研究动脉粥样硬化的动物模型。本发明也涉及筛选治疗动脉粥样硬 化药物的方法和用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的方法。更具体地
讲，本发明涉及通过给予有需要的受试者丝氨酸椋榈酰-CoA转移酶 (SPT)或其亚单位的抑制剂，预防和/或治疗动脉粥样硬化的方法。
背景技术：
丝氨酸棕榈酰-CoA转移酶(SPT)为在神经鞘脂生物合成中的限速 酶(l)。很长时间已知SPT在神经鞘脂的代谢中扮演重要的角色。另夕卜， 在大鼠肝脏(2)和肺(3)中的SPT活性与在那些组织中的神经鞘脂形成 正相关。祠养高胆固醇伺料提高在兔大动脉中的SPT活性(4)。也已发 现SPT活性的降低与代谢综合征或胰岛素抗性、肥胖和糖尿病有关 (Summer等，D励斷54: 591-602, 2005)。
已经克隆酵母SPT的两个候选cDNA:末端LCB1和LCB2 (5,6)，翻 译的序列显示它们的基因产物具有21 %氨基酸序列同一性(6)。在缺少 LCB1或LCB2的酵母菌抹中SPT活性的缺乏，与蛋白质相似性数据一 起表明SPT的两个基因编码亚单位(6)。也已克隆编码小鼠和人的LCB1 和LCB2的同系物(SPTLCl和SPTLC2)的基因(Sptlcl和Sptlc2) (7, 8)。在 小鼠中，两个mRNA具有相同的组织分布，在所有组织中两个转录物 量的比率大约保持恒定(8)。 Sptlc2 mRNA的组织分布与SPT活性的分 布平行(9)。
已显示哺乳动物的SPT为53-kDa Sptlcl亚单位和63-kDa Sptlc2亚 单位的异源二聚体(8、 10和19)，该两个亚单位结合到内质网(ER)(ll)。 Sptlc2似乎是不稳定的，除非它和Sptlcl締合(ll)。在转录时和转录后可调节SPT的活性，已表明它的上调在由某类应力诱导的凋亡中起作 用(12)。在人类Sptlcl基因中的特定错义变异导致I型遗传性感觉神经 病，该病为常染色体显性的遗传病，这些变异赋予在SPT活性方面的 显性失活效应(13, 14)。也有一些体外的和离体的证据表明Sptlcl和 Sptlc2为SPT的两个亚单位，处理两个基因将影响神经鞘脂的代谢 (11-14)。
然而，尽管迄今为止对SPT的所有研究，但没有保留SPT功能或 用于研究这样的功能的动物模型的直接的体内证据。本发明已经首次 成功地生产Sptlc 1或Sptlc2基因缺乏的动物，该动物可用于评价Sptlc 1 或Sptlc2与SPT活性之间的关系，和Sptlcl或Sptlc2缺乏与SPT的体内作 用例如神经鞘脂代谢之间的关系。
(Zyaha W"cton/)为在传统上用于中药试图达到永远年轻的真菌 (JBC 10)。已从(/. w'"cto'r^分离称为多球壳素的特异性SPT抑制剂 (JBC 10)，多球壳素的特征为具有与鞘氨醇相似的分子结构(JBC 11)。 使用多球壳素-基亲合色谱，可从白介素-2-依赖性小鼠细胞毒性T细胞 系(CTLL-2)纯化两种蛋白质LCB1和LCB2(JBC 12)。该结果表明LCB1 和LCB2为多球壳素结合蛋白，并证实该事实它们负责SPT的活性 (JBC 12)。
发明概述
本发明提供具有至少 一个编码丝氨酸棕榈酰-CoA转移酶(SPT)亚 单位(Sptlcl或Sptlc2)的内源基因的杂合分裂的动物，优选啮齿动物， 更优选小鼠。本发明认为Sptlcl和Sptlc2负责SPT活性，缺乏Sptlcl或 Sptlc2的同型结合导致胚胎的致死率，缺乏Sptlcl或Sptlc2基因的杂合 导致血浆神经鞘脂包括神经酰胺(Cer)和鞘氨醇-l-磷酸酯(SlP)水平的 显著变化，这可导致抗动脉粥样硬化效应。因此和依照本发明，抑制 Sptlcl和/Sptlc2可为动脉粥样硬化的替代治疗。
因此，本发明的 一个方面涉及其基因组包含至少 一个编码丝氨酸棕榈酰-CoA转移酶(SPT)亚单位的内源基因的杂合分裂的转基因剔除 动物，优选啮齿动物，更优选小鼠。
本发明的另 一方面涉及具有至少 一个编码SPT亚单位的内源基因 的杂合分裂的变异或转基因剔除动物用于在细胞、组织和/或器官水平 研究动物的生理学的用途。在特定的方面，本发明的Sptlcl和/或Sptlc2 基因缺乏的变异动物例如具有Sptlcl或Sptlc2的杂合分裂的小鼠显示 许多的与它们的野生型副本之间的表型的和/或生理学的/病理学的差 异，包括或涉及但不限于动脉粥样化形成、细胞生长、分化和凋亡的 调节或遗传性感觉神经病、糖尿病、肥胖、代谢综合征和胰岛素抗性。 在一个具体的方面，本发明涉及用于研究动脉粥样硬化的动物模型， 其中动物^f莫型为具有至少 一个编码丝氨酸棕榈酰-CoA转移酶(SPT)亚 单位的内源基因的杂合分裂的哺乳动物，优选啮齿动物，更优选小鼠。 在另 一 个具体的方面，本发明涉及篩选用于治疗动脉粥样硬化的药 物，包括获得或产生用于动脉粥样硬化的动物才莫型和上述的试验候选 的配体/抑制剂，以筛选和获得有效治疗动脉粥样硬化的药物。在还另 一个具体的方面，本发明涉及通过检测Spclcl和/或Spclc2的变异，诊 断动脉粥样硬化或具有动脉粥样硬化的风险的方法。
在一方面，本发明涉及特异性结合到SPT亚单位的配体/抑制剂分子。
在另一方面，本发明涉及用于预防/治疗动脉粥样硬化的方法，该 方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的至少 一个丝氨酸棕榈酰 -CoA转移酶(SPT)亚单位的特异性配体/抑制剂。
在还另 一方面，本发明涉及用于预防/治疗动脉粥样硬化的方法， 该方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的多球壳素，其中通过静 脉内、皮下、肌内或腹膜内途径给药。
在还另一方面，本发明提供用于研究代谢综合征或胰岛素抗性、 肥胖和糖尿病的动物模型，其中模型动物的基因组包含至少 一个编码 丝氨酸棕榈酰-CoA转移酶(SPT)亚单位的内源基因的杂合分裂。附图简述
图l描述用来分裂小鼠Sptlcl基因的策略。
图1A显示通过同源重组 分裂Sptlcl基因的策略。顶部的线代表内源性鼠Sptlcl基因和它的侧翼 序列图。中间的线代表用来靶向Sptlcl基因座的载体。底部的线显示 同源重组之后的基因座的预测结构。使用该线中显示的探针和PCR引 物对以确认位点特异性整合的完整性。
图1B描述用EcoRV消化和用探 针杂交的小鼠尾尖基因组DNA的DNA印迹分析。WT小鼠DNA仅具有 7.2-kb的信号(+Af);杂合缺乏小鼠DNA具有7.2-kb和5.5-kb信号(+/-)。 Neo，新霉素抗性基因。
图2描述用来分裂小鼠Sptlc2基因的策略。图2A显示通过同源重组 分裂Sptlc2基因的策略。顶部的线代表内源性鼠Sptlc2基因和它的侧翼 序列图。中间的线代表用来靶向Sptlc2基因座的载体。底部的线显示 同源重组之后的基因座的预测结构。使用该线中显示的探针和P CR引 物对以确认位点特异性整合的完整性。图2B描述用NcoI/Sphl消化和用 探针杂交的小鼠尾尖基因组DNA的DNA印迹分析。WT小鼠DNA仅具 有6.2-kb的信号(+Z+);杂合缺乏小鼠DNA具有6.2-kb和3.1-kb信号两者 (+/-)。 Neo，新霉素抗性基因。
图3描述Sptlcl和Sptlc2的mRNA水平测定。图3A描述与野生型 (WT)小鼠相比，杂合的Sptlcl缺乏小鼠肝脏中的Sptlcl mRNA。用定 量实时PCR量化Sptlcl(或Sptlc2+小鼠肝脏中的Sptlcl mRNA。图3B 描述与野生型(WT)小鼠相比，杂合Sptlc2缺乏小鼠肝脏中的Sptlc2 mRNA。用定量实时PCR量化Sptlcl+卜或Sptlc2+一小鼠肝脏中的Sptlc2 mRNA。将表达描述为LCBl或LCB2的mRNA与P-肌动蛋白的mRNA 的比率。数值为平均值士SD(1^5， pO.Ol)。
图4A和4B分别描述Sptlcl仏和Sptlc2+小鼠肝脏中的SPT活性。用 3H-丝氨酸和棕榈酰-辅酶A作为底物来测定肝脏匀浆的SPT活性。进行 TLC以分离产物3-酮基-二氢神经鞘氨醇(KDS)。数值为平均值±SD(n=5, pO.Ol)。
图5A和5B分别描述杂合Sptlcl和Sptlc2缺乏小鼠的肝脏Sptlcl和 Sptlc2质量。进行杂合Sptlcl和Sptlc2缺乏小鼠的Sptlcl和Sptlc2的蛋白 质印迹分析。在进行小鼠肝脏Sptlcl和Sptlc2的蛋白质印迹分析时，使 用小鼠肝脏匀浆(200貼蛋白质)，在3-20% SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶上 进行SDS-PAGE，将分离的蛋白质转移至硝基纤维素膜。使用多克隆 抗小鼠Sptlcl抗体(BD Biosciences Pharmingen)进行Sptlcl的蛋白质印 迹分析。依照小鼠Sptlc2肽序列kysrhrlvplldrpfdettyeeted (536-560aa)， 使用Proteintech Group公司生产的多克隆抗小鼠Sptlc2抗体进行Sptlc2 的分析。对于Sptlcl，使用小鼠IgG的辣根过氧化物酶缀合的兔多克隆 抗体(NovusBiologicals)作为第二抗体，对于Sptlc2，使用兔IgG的辣根 过氧化物酶缀合的山羊多克隆抗体(Novus Biologicals)。对于4企测步骤 使用SuperSignal West检测试剂盒(Pierce)。使用GAPDH作为加样对照。 用4.5版本的Image-Pro Plus软件(Media Cybemetics公司)测定每一条带 的最大强度，用于分析。图5A， Sptlcl+/—和Sptlc2+小鼠肝脏中的Sptlcl 质量(n-3, WT对Sptlcl+、 pO.05; n=3， WT对Sptlc2^—, pO.001); 图5B， Sptlcl+r和Sptlc2+「小鼠肝脏中的Sptlc2质量(1^3， WT对Sptlcl" —，pO.05; n=3, WT对Sptlc2+卜，p<0.05)。
图6A至6C表明多球壳素治疗显著减少普通食物(chow diet) apoE 剔除(KO)小鼠的血浆鞘磷脂(SM)水平，增加血浆磷脂酰胆碱(PC)水 平，但不影响血浆胆固醇水平。用FPLC (7, VLDL; L, LDL;和H, HDL) 分析来自经过或没经过多球壳素治疗的小鼠(11=7)的混合血浆的200pl 等分试样。使用每一组分的等分试样测定SM(图6A)、 PC(图6B)和胆固 醇(图6C)。
图7A至7C表明多球壳素治疗显著减少高脂肪食物的apoE KO小 鼠的血浆SM水平，增加血浆PC水平，^f旦不影响血浆胆固醇水平。用 FPLC(V, VLDL; L, LDL;和H, HDL)分析来自经过或没经过多球壳素 治疗的小鼠(n-7)的混合血浆的200^il等分试样。使用每一组分的等分试样测定SM(图7A)、 PC(图7B)和胆固醇(图7C)。
图8A至8E表明多球壳素治疗显著减少apoE KO主动脉中的动脉 粥样硬化。图8A显示得自处死小鼠的结果，解剖其主动脉并拍照。这 组照片为七组的代表。图8B和8C描述在喂食普通食物(图8B)或高脂 肪、高胆固醇饮食(图8C)的小鼠中通过root测定进行主动脉近端的动脉 粥样硬化损害的量化。先前描述了用于root测定的方法(JBC 15)。图8D 和8E描述在喂食普通食物(图8D)或高脂肪、高胆固醇食物(图8E)的小 鼠中通过en face分析进行全主动脉的动脉粥样硬化损害的量化。先前 描述了用于en face分析的方法(JBC 16)。数值为平均值士S.D卢， pO扁；n=7。
发明详述
本发明的一个实施方案涉及在其种系细胞(胚胎干细胞或生殖细 胞)中包含人工诱导的杂合Sptlc 1或Sptlc2基因缺乏突变的动物，优选啮 齿动物，更优选小鼠。
"动物"指任何非人哺乳动物。术语"啮齿动物"是指种系啮齿目的 任何和所有成员(例如小鼠、大鼠、松鼠、河狸、旱獭、地鼠、田鼠、 土拨鼠、仓鼠、豚鼠和刺鼠)，包含由此得到的所有后代的任何和所有 子代。术语"鼠科动物"是指鼠科家族的任何和所有成员，包括但不限 于大鼠和小鼠。
依照本发明，人工诱导基因缺乏或基因的杂合分裂。可使用本领 域现在已知或以后发展的任何方法实现这样的突变的人工诱导。这包 含熟知的技术如同源重组、转录重组、定点突变和移码突变的人工诱 导。优选方法为同源重组。
"杂合分裂"指胚胎干细胞/生殖细胞或动物的突变，其中将内源基 因(如SPT)的 一个等位基因打断，因此典型表达于带有野生基因型的细 胞中的翻译产物不表达或在靶生物的细胞中至少一个方面为非功能 性的。"剔除"或"KO"指通过基因工程将所有或部分基因消除或使其失活/灭活。
当在本文中用作SPT蛋白、肽或其片段的修饰因子时，"功能的" 是指显示至少一个归因于SPT的功能特点或生物活性的蛋白质/多肽。
例如，依照本发明，Sptlcl或Sptlc2缺乏引起血浆神经酰胺(Cer) 水平的显著下降，神经酰胺为熟知的涉及细胞凋亡的第二信使(20)。 典型地，提高细胞Cer的策略用于目标为阻止生长或促进凋亡的疗法。 Charks等发现直接将Cer类似物施加至受损动脉可强烈抗增殖(21)。在 体内，C6-Cer涂覆的球嚢导管通过使ERK和AKT信号失活而阻止兔颈 动脉(21)中延展-诱导的新生内膜增生，因此在延展-损伤的血管平滑肌 细胞中促使细胞周期停止(22)。
依照本发明，Sptlcl或Sptlc2缺乏也引起血浆SlP水平显著下降。 在人血浆中，65。/o的SlP与脂蛋白有关，其中HDL为主要载体(23)。 一 方面，已经显示HDL中的S1P与人内皮细胞上的S1P/Edg受体结合，因 此可能介导内皮细胞上的许多HDL抗炎反应(24)。另一方面，在最近 的病例对照研究中发现血清S1P为冠状动脉狭窄发生和其严重程度的 显著强烈预^R因子(25)。
依照本发明，Sptlcl或Sptlc2缺乏还引起血浆LysoSM水平显著下 降。LysoSM为假定的在几个胞内和胞间事件中重要的第二信使，其涉 及细胞生长、分化和凋亡的调节(26)。其增加内皮细胞中的细胞内钙 浓度和一氧化氮产量，引起牛冠状动脉的内皮依赖性血管舒张(27)。 LysoSM也可通过改变心脏的斯里兰卡肉桂碱受体的门控动力学而调 节肌质网的钙释》丈(28)。 LysoSM增强细胞间粘附分子-1的表达水平和 人角质细胞培养的培养基中的坏死因子-a水平(29)。 LysoSM也在尼曼 -匹克病的病理生理学中起作用(30)。
本发明也认识到，Sptlcl或Sptlc2缺乏引起血浆鞘氨醇(Sph)水平 显著下降。最初发现Sph及其N,N-二曱基衍生物(DMS)作为二酰基甘油 (33)的配对物而抑制蛋白激酶C(PKC) (31，32)。最近的报导表明Sph通 过胱冬酶3的激活和PKC5 KD (34)的释放特异性促进细胞凋亡。"交配"指同类的雄性和雌性动物繁殖，或通过体外或体内的人工 方法生育以进一步获得子代产生。人工方法包括但不限于人工授精、
体外受精(FVF)和/或其它人工繁殖技术，如精子卵浆内注射技术 (ICSI)、透明带下授精(SUZI)或部分透明带切割法(PZD)。然而，也可 使用其它方法，如克隆和胚胎移植、克隆和胚胎分割等，本发明考虑 这些方法。
"转基因"或"重组"动物指其种系细胞例如胚胎千(ES)细胞或生殖 细胞中引入了外源DNA的动物。被引入动物细胞的外源基因称为"转 基因"或重组体"。外源DNA的引入或插入也称为转染。优选，转基因 动物的转染种系细胞具有非内源性的(外源的)遗传物质(如靶向载体) 整合进其染色体中。根据其整合进和变成发育胚胎的种系的一部分的 能力，选择依照本发明使用的ES细胞系，因此产生转基因或靶向载体 的种系嵌合。本领域技术人员容易理解，由于改变本发明产生的任何 转基因动物的遗传物质而产生的任何期望特性均为可遗传的。虽然最 初将遗传物质单独插入亲本动物的生殖细胞中，但它最终存在于直接 子代和后代的下一代的生殖细胞中。该遗传物质也存在于分化细;^包， 例如子代的体细胞中。
"革巴向载体"指设计抑制或优选消除由动物的一种或多种细胞中的 内源基因编码的多肽的表达或功能的多核苦酸序列。用作靶向载体的 多核苷酸序列典型地包含(l)待抑制的内源基因的一部分或某些部分 的DNA (例如一个或多个外显子序列、内含子序列和/或启动子序列) 和(2)用来检测细胞中耙向载体存在的可选择标记序列。将靶向载体人 工引入含待突变或分裂的内源基因(例如SPT基因)的细胞中。然后将靶 向载体整合进内源性SPT基因的一个或两个等位基因中，这样的SPT 輩巴向载体的整合可防止或阻断全长内源性SPT基因或其亚单位的转 录。典型通过同源重组实现将SPT靶向载体整合进细胞染色体DNA (即当将靶向载体插入细胞中时，与内源性SPT DNA^列同源或互补 的SPT靶向载体区域可彼此杂交；然后这些区域重组，因此将靶向载体结合进内源性DNA的相应位置)。见
图1A和2A。
"可选择标记序列"指能够检测到其结合进细胞染色体的多核苷酸 序列。也就是说，该多核苦酸序列(l)用作较大核苦酸序列结构(即"耙 向载体")的一部分以分裂待突变或分裂的内源基因(例如SPT基因)的 表达，和(2)用作确认已将靶向载体如SPT靶向载体结合进染色体DNA 的那些细胞的方法。可选择标记序列可为达到这些目的的任何序列， 虽然它典型为编码这样的蛋白质的序列，该蛋白质赋予细胞可检测特 性，如抗生素抗性基因或非在动物细胞中天然发现的可检测酶(例如|3-半乳糖苷酶)或荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP) 或藻胆蛋白)。标记序列典型地包含调节其表达的同源或异源启动子。
本文交互使用术语"蛋白质"、"肽"和"多肽"。当用于本文时，"启 动子"或"启动子区域"是指DNA片段，该DNA片段控制其可有效连接 的DNA多核苷酸的转录。启动子区域包含足够RNA聚合酶识别、结合 和转录启动的特定序列。另夕卜，启动子区域包含调节RNA聚合酶识别、 结合和转录启动活性的序列。这些序列可为顺式作用因子或可对反式
作用因子起反应。
"表达"指多核酸转录为mRNA，翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。 如果多核酸来源于基因组DNA,选择合适的真核宿主细胞或有机体， 那么表达可包含mRNA剪接。"核酸"包含核糖核酸(RNA)或脱氧核糖 核酸(DNA)，其中DNA为互补DNA(cDNA)或基因组DNA，例如编码 SPT蛋白的基因。"多核苷酸"包含核酸，该核酸包含由核糖基部分或 脱氧核糖基部分之间的磷酸二酯键形成的"主链"。
当用于本文时，与SPT-特异性多核苷酸序列互补的多核苷酸序列 为与SPT-特异性核苷酸磁羞序列特异性结合或杂交的多核苦酸序列。 短语"特异性结合"或"杂交"包括多核苷酸序列识别互补i威基序列并通 过互补碱基对之间的氢键形成双螺旋片段的能力。因此，互补的序列 包含例如相对于正义序列或编码序列的反义序列。如本领域技术人员 已知，杂交体的稳定性反映于杂交体的解链温度(Tm)上。 一般杂交体的稳定性为钠离子浓度和温度的函数。典型地，在相对低的严谨性的 条件下进行杂交反应，然后改变洗涤，但具有较高的严谨性。涉及杂 交严谨性是指这样的洗涤条件。
当用于本文时，短语"中等严谨性杂交"是指允许耙DNA结合互#卜 的核酸的条件，该互补的核酸具有与靶DNA约60。/。的序列同一性或同 源性，优选约75%的同一性，更优选约85%的同一性；尤其优选对耙 DNA具有大于约90。/。的同一性。优选，中等严谨条件相当于这样的条 件，即42°。时在50%甲酰胺、5xDenhart氏溶液、5xSSPE、 0.2% SDS 中杂交足够的时间，例如2小时或更多时间，然后在65。C时在SSPEI爰 沖液(0.15MNaCl、 10mMNaH2PO4、 2mM EDTA)、 0.2。/oSDS中洗涤 足够的时间，例如1小时或更多的时间。
短语"高严谨性杂交"是指仅允许形成稳定杂交体的那些核酸序列 杂交的条件。可通过例如42。C时在50。/。甲酰胺、5xDenhart氏溶液、 5xSSPE、 0.2。/。SDS中杂交足够的时间，例如2小时或更多的时间，然 后在65。C时在0.1xSSPE、 0.1% SDS中洗涤足够的时间，例如l小时或 更多的时间，提供高严谨性条件。
短语"低严谨性杂交"是指相当于这样的条件，即在42 °C时在10% 甲酰胺、5xDenhart氏溶液、6xSSPE、 0.2% SDS中杂交足够的时间， 例如2小时或更多时间，然后在50。C时在lxSSPE、 0.2。/。SDS中洗涤足 够的时间，例如l小时或更多时间。如其它合适的杂交緩沖液，本领 域技术人员熟知Denhart氏溶液和SSPE (见例如Sambrook等，A/o/ecw/"r C/om"g, ^Z^)orafoo^M"m^/，冷泉港实验室出版社，1989年)。
术语"子代"或"后代"是指得自或来自特定动物的任何和所有未来 代的动物，例如含有一个或多个插入或整合进其基因组DNA的靶向载 体的小鼠祖先或嵌合小鼠，不管该动物对于靶向载体是杂合的或纯合 的。然而，依照本发明，纯合的Spclcl或Spclc2是致命性的。本文包含 任何连续代的子代，因此本定义包含含有靶向载体的子代，即F1、F2、 F3等。依照本发明，可在至少一个内源性SPT等位基因上对动物，优选 啮齿动物，更优选小鼠进行人工突变，因此所述动物的种系细胞缺乏 表达功能性SPT蛋白的能力。可通过本领域已知的各种方法实现这样 的突变，该方法包括但不限于同源重组、转录重组、定点突变和在表 达功能性SPT多肽的关键性SPT基因区域内移码突变。典型地，将这样 的突变引入胚胎干细胞(ES)(见下面的实施例)或生殖细胞，如卵母细 胞或雄性生殖细胞，然后使用该细胞与异性生殖细胞配对而产生转基 因受精卵。
将SPT靶向载体转染入生殖细胞基因组，然后将靶生殖细胞与异 性生殖细胞结合以获得受精卵，该异性生殖细胞也可用靶向载体转 染。外源供应的核酸片段如靶向载体的摄取将在一个或多个发育阶段 到达雄性生殖细胞，将被更可接受的阶段的雄性生殖细胞摄取。原始 的产精子的干细胞，称为Ao/As,分化成B型精原细胞。后者进一步分 化，形成初级精母细胞，进入延长减数分裂前期，在此期间同源梁色 体配对、重组。减数分裂的几个形态学阶段是可区分的细线前期、 细线期、偶线期、粗线期、次级精母细胞和单倍体精细胞。在精子发 生期间后者经历进一步地形态改变，该改变包含其细胞核的整形、顶 体的形成和尾部的集合。精子的最终变化发生于受精之前雌性的生殖 道中。可在体内使用基因治疗技术，或在体外使用许多不同的转染策 略修饰雄性生殖细胞(例如WO 00/69257)。
在优选的实施方案中，在细胞的至少一个SPT基因内源性拷贝和 耙向载体之间通过同源重组引入突变，其中将耙向载体转染入ES细胞 基因组。然后将ES细胞注射入胚泡，显微注射入C57BL/6J胚泡。视情 况而定，将产生的重組体胚泡或受精卵植入4艮妊娠宿主，该重组体胚 泡或受精卵代表FO代。然后篩选存在一个或多个突变体SPT等位基因 的F1子代。例如依照本发明，可通过用C57BL/6雌性与嵌合雄性(具有 转基因)交配而产生F1代动物。可用本领域已知的基因组分析技术，例 如DNA印迹法，确认Sptlcl"—或Sptlc2"-嵌合体。然后将确认的杂合动物例如小鼠杂交或交配以产生F2代动物。依照本发明，可将F2代动物 与同种的野生型动物回交足够代，优选两代或更多代，更优选五代或 更多代，并用合适的祠料喂养。例如将本发明的F2代小鼠与C57BL/6 小鼠回交五代。在同 一代内表现野生型(+/+)和杂合体(+/-)的所有表型 特征，所有的动物均为10至12周大小。将Purina啮齿动物食物(第5001 号)喂给小鼠(美国，新泽西州，新布伦兹维克，Research Diets有限7/^司)。
在优选的实施方案中，通过与如下的靶向载体同源重组来产生 SPT杂合分裂的突变动物
典型地通过分离基因组SPT或cDNA SPT多核苷酸序列片段，将可 选择遗传标记插入所述基因组或cDNA SPT片段来制备SPT靶向载体， 该遗传标记典型地由外源性多核苷酸序列组成。可用各种方法获得用 于制备把向载体的SPT基因或基因片段。也见下面的实施例。
可使用本领域熟知的如Sambrook等描述的方法获得用于制备靶 向载体的天然存在的基因组SPT多核苷酸序列片段或cDNA分子。 (A^ /ecwto厂C/om'"g:爿丄a60raf07iVfawwa/，冷泉港实验室出版社，纽约， 冷泉港，1989年)。这样的方法包括例如使用寡核苷酸引物PCR扩增特 定DNA多核苷酸序列，或用编码至少一部分相同或高同源性SPT基因 的cDNA探针筛选由包含SPT基因的细胞或组织制备的基因组库，以获 得至少一部分的SPT基因组多核香酸序列。或者，如果将cDNA^列用 于靶向载体，那么通过用寡核苷酸探针、同源cDNA探针或抗体筛选 cDNA库(优选由表达SPT基因组序列的组织或细胞制备的cDNA库，其 中组织或细胞取自作为靶物质的相同或类似种的哺乳动物)可获得 cDNA (其中将库克隆进表达载体)。在优选的实施方案中，可从包含 来自小鼠129X基因组库的Sptlcl外显子7-10的12 kb小鼠基因组DNA片 段中分离SPT基因，使用SPT基因来构建靶向载体(
图1)。
为了基因操作，应产生足量的制备用于靶向载体的SPT基因组 DNA片段或SPTcDNA分子。可通过以下方法进行扩增1)将片^i文入合适栽体，转化可迅速扩增载体的细菌或其它细胞，2)PCR扩增，3) 用DNA合成仪合成，或4)通过现在已知或以后发现的其它合适方法。
可用 一种或多种限制性内切酶消化用于结合进SPT靶向载体的基 因组SPT多核苦酸序列片段、cDNA分子或PCR产生的片段(本文称为" 靶向载体的SPT多核苷酸序列部分")，选择限制性内切酶以在限制性位 点酶切，该限制性位点也存在于可选择标记序列中，因此可将可选择 标记序列插入靶向载体的SPT多核苷酸序列部分之内的期望位置。也 就是说，将可选择标记序列插入沿靶向载体的SPT多核苷酸序列部分 的位置，因此，插入特定细胞的SPT基因染色体拷贝中的可选择标记 序列在所述细胞中不会表达，该特定细胞典型地表达SPT蛋白、功能 性SPT蛋白。该特定位置取决于许多因素而改变，该因素包含可选择 标记序列所插入的SPT多核普酸DNA序列片段中的可用限制性位点， 不管阻断的是外显子序列或启动子序列，或两者都^^皮阻断，不管哺乳 动物中存在几个异构重整产物(由于选择性剪接)，仅一个这样的异构 重整产物被分裂。在将靶向载体的SPT多核苷酸序列部分消化并插入 可选择标记序列之后，该可选择标记序列的侧翼应包含至少约600, 优选约1 ,OOO个消化的靶向载体的SPT多核苷酸序列部分剩余的多核 普酸碱基对。这样，可在可选择标记序列插入染色体SPT基因的期望 位点的任一侧，用靶向染色体SPT基因杂交侧翼部分。无论如何，外 源可选择标记序列应在侧翼包含多核苷酸序列、与足够长度的染色体 SPT基因的有义链互补，以便于用靶向染色体SPT基因杂交，获得靶向 载体中的核苷酸与SPT基因的染色体拷贝的至少 一个拷贝之间的期望 的同源重组。
优选，所选择的用来消化靶向栽体的SPT多核苷酸序列部分的核 酸内切酶将产生较长的臂和较短的臂，其中较短的臂含至少约300个 碱基对(bp)。在某些情况下，实际上期望删除靶向载体的SPT多核香酸 序列部分的部分乃至所有的一种或多种内含子或外显子。在逸些情况 下，可用合适的限制性内切酶剪切耙向载体的SPT多核苷酸序列部分，因此假如在期望同源重组事件的优选位点处，其中插入的可选择标记
序列的侧翼有至少约200个多核苷酸碱基对与耙向内源性SPT基因的 多核苷酸区域互补，那么可去除合适尺寸和位置的片段。
在最优选的实施方案中，用于结合进SPT靶向载体的靶向载体的 SPT多核苷酸序列部分包含约3.8 kb的删除，该删除包含用于Sptlcl分 裂的外显子7和8，或约357 bp的删除，该删除包含用于Sptlc2分裂的外 显子1 ，其中将这样的删除引入SPT的染色体拷贝将消除从mRNAs到 功能性SPT蛋白的翻译。
用于靶向载体的可选择标记序列可为任何核酸分子，在结合进ES 或生殖细胞、最终杂合分裂动物的基因组DNA之后，该核酸分子为可 探测和/或可检测的。通过传统方法可容易地-险测其在基因组中的表达 或存在或缺乏，如本文所进一步描述。优选，可选择标记序列编码非 天然存在于动物中的多肽。可选择标记序列通常有效连接于它自身的 启动子或另一强启动子，如胸苷激酶(TK)启动子或磷酸甘油激酶(PGK) 启动子，该强启动子来自所插入的细胞中活化的或可容易活化的任何 来源；然而，可选择标记序列不必连接它自身的启动子，因为可使用 待突变基因的启动子将其转录。另外，可选择标记序列通常具有连接 其3'末端的聚腺苷酸序列；该序列用以终止可选择标记序列的转录。 优选的可选择标记序列为任何抗生素抗性基因如neo(新霉素抗性基 因)，或细菌基因如P-gal((3-半乳糖苷酶)。
在已用合适的限制酶消化靶向载体的SPT多核普酸序列部分之 后，可使用技术人员熟知的和Sambrook等，同上描述的方法将可选择 标记序列分子与靶向载体的SPT多核普酸序列部分连接。在某些情况 下，优选相对于SPT核酸序列反向或反义插入可选择标记序列；优选 反向插入，其中可选择标记序列可有效连接至特别强的启动子。
待连接的DNA分子末端必须为相容的；这可通过用那些产生可相 容末端的核酸内切酶剪切所有片段，或者通过在连接之前钝化末端来 获得。可使用本领域熟知的方法进行钝化，例如使用Klenow片段(DNA聚合酶I)填充粘性末端。在连接之后，可通过选择性限制内切酶消化 来筛选连接的结构，以确定哪一个结构在期望的方向包含标记序列。
然后将连接的DNA靶向载体直接转染入胚胎干细胞(见实施例)
或生殖细胞，或者在插入之前首先将它放入合适载体进行扩增。优选
载体为在细菌细胞中迅速扩增的那些载体，如pBluescript II SK载体 (Stratagene，力卩利福尼亚，圣地亚哥)或pGEM7 (Promega公司，威斯康 星州，麦迪逊)。
典型地将SPT靶向载体转染入取自胚胎的千细胞(胚胎干细胞，或 "ES细胞")。ES细胞是能够分化和发育成生物形成和生存所必需的所 有细胞类型的未分化细胞。 一般用来产生杂合分裂动物的ES细胞是与 要产生的杂合分裂动物相同种的动物。因此例如小鼠胚胎干细胞通常 用于产生SPT杂合分裂小鼠。
典型地根据其整合进和变成发育胚胎的生殖细胞系的一部分的 能力，选择使用的胚胎干细胞系，因此产生靶向载体的种系传导。因 此，纟皮认为具有该能力的任何ES细胞系都适用于本文。用于产生杂合 分裂小鼠的优选ES细胞系为鼠ES细胞系E 14。使用技术人员熟知的方 法培养细胞和准备用于DNA插入，例如以下提出的那些方法 Robertson (reratocan:/"owas 5"w6/jow/c 5tem Ce〃&' j尸rarc"ca/ j; praac/2， E. J. Robertson编辑.IRL出版社，华盛顿市，1987年)，Bradley 等(C群em 7b一 /" D，/.編,20: 357-371 (1986年))和Hogan等 (Maw—,a"wg ^ e M3wse五w—o:爿/^oratory Ma"wa/， 冷泉港实验室 出版社，冷泉港，纽约，1986年)。
可使用本领域熟知的各种方法实现将靶向载体插入(也称为"转染 ")ES细胞或生殖细胞，该方法包括例如电穿孔、微粒轰击、显微注射、 病毒转导和^^酸钙处理(见Robertson编辑，同上)。优选的插入方法为 电穿孔。
如果预先已将靶向载体插入圆形载体，可首先将待转染入细胞的 SPT耙向载体线性化。可通过用合适的限制性内切酶消化DNA来实现线性化，选择合适的限制性内切酶以仅在载体序列内而非靶向载体序 列内剪切。
在选择的插入方法的合适条件下将分离的SPT靶向载体添加到 ES细胞或生殖细胞。当将多于一个靶向载体引入细胞时，可同时或相 继引入编码每一个这样的载体的DNA分子。任选可通过添加过量的 SPT靶向载体DNA至细胞，或通过进行连续循环的转染企图在两个内 源性的SPT等位基因上都得到靶向载体的同源重组来产生杂合SPT分 裂ES细胞。
优选，将ES细胞或生殖细胞电穿孔以引入转基因或SPT靶向载 体。使用电穿孔器使细胞和靶向载体DNA暴露于电脉冲，使用时遵循 厂商指导。在电穿孔之后，典型地允许细胞在合适的温育条件下恢复。 然后筛选存在靶向栽体的细胞。
可使用各种方法实现转染细胞的筛选，优选，通过筛选靶向栽体 的可选择标记序列部分的存在。当可选择标记序列为抗生素抗性基因 例如neo时，可在存在否则致死浓度的抗菌素例如卡那霉素时培养细 胞。存活的那些细胞假定整合了靶向载体。如果可选择标记序列不是 抗生素抗性基因，可用设计为仅与标记序列杂交的DNA序列探测ES 细胞基因组DNA的DNA印迹。如果可选择标记序列为编码活性可纟企测 酶(例如，P-半乳糖苷酶或GFP)的基因，可在合适条件下将酶底物添加 至细胞，分析可选择标记序列的酶活性。
耙向载体可整合进ES细胞或生殖细胞基因组中的几个位置，由于 随机插入事件的发生，在每一细胞的基因组中靶向载体可整合进不同 的位置。期望的插入位置为消除功能性SPT蛋白表达的SPT内源基因序 列区域之内。典型地，实际上吸收靶向载体的少于约1%至约10%的细 胞将在期望的位置整合靶向载体。为了确认适当整合靶向载体的那些 细胞，使用标准方法如Sambrook等，同上描述的那些方法从细胞中提 取染色体DNA。然后可用设计选择性杂交至用特定限制酶消化的靶向 载体的一个或多个探针在DNA印迹上探测提取的DNA。备选地或另外地，可通过PCR用特别设计为扩增DNA序列的探针扩增特定的基因组 DNAJf列，因此仅有在适当位置包含靶向载体的那些细胞产生适当尺 寸的DNA片,史。见下面的实施例。在已鉴定在适当位置包含乾向载体的合适ES细胞之后，将转化的 ES纟田月包力口入胚月台。可用各种方法实现加入。优选的ES细胞加入方法为 通过显微注射进入胚泡发育阶段的胚胎。对于显微注射，典型地将约 10-30个细胞收集进微量吸管，注射进入胚泡以将ES细胞整合进入发 育中的胚泡。胚泡的合适发育阶段为种属依赖性的，然而对于小鼠为约3.5天。 可通过灌注怀孕雌性的子宫来获得胚泡。技术人员已知实现这个的合 适方法，例如Bradley提出的方法(Robertson, ed.,同上)。虽然正确的发育年龄/阶段的任何胚泡都适于使用，优选胚泡为雄 性并具有编码基因，该基因编码的毛色或其它表型标记不同于靶向ES 细胞基因所编码的毛色或其它表型标记。这样，通过寻找花斑病毛色 或其它表型标记(表明ES细胞结合入发育胚胎)，可容易地筛选存在靶 向载体的后代。因此，例如，如果靶向ES细胞系携带白色基因，那么 选择的胚胎优选携带黑色或褐色基因。在掺入ES细胞之后，将转染的胚胎植入假妊娠宿主的子宫。虽然 可使用任何假妊娠宿主，但优选典型地根据其良好的生育和繁殖能力 和照顾其仔畜的能力选择的宿主。通过与切除输精管的雄性同类交配来典型地制备这样的假妊娠宿主。对于成功的植入，宿主母体的々i妊 娠阶段是重要的，它具有种属依赖性。对于小鼠，这个阶段为约2-3 天的假妊娠。作为将靶向载体转染入胚胎干细胞的备选方法，可将靶向载体转 染入动物生殖细胞即卵母细胞例如鼠生殖细胞。典型地，通过将病毒 载体转染入卵母细胞来使用逆转录病毒栽体以产生转基因生物(Chan 等，尸rac.扁jca"c/. USA 95: 14028-33， 1998年)。也在将外源性 DNA连同精子头部注射进卵母细胞之后产生转基因小鼠(Perry等，Science 2841183, 1999年)。本发明预期例如通过用靶向载体连同合适的转染剂转染、转导、 微粒轰击或电穿孔脊稚动物的生殖细胞，也可在体内和体外(离体)产 生转基因动物。体内方法包括将靶向载体直接注射入动物睾丸。在该 方法中，睾丸内的所有或一些雄性生殖细胞在原位、有效的条件下进 行遗传修饰。体外方法包括从合适供体的生殖腺(即睾丸)或从动物自 身的睾丸获取生殖细胞，使用新的分离或选择方法，在体外将它们转 染或进行遗传改变，然后在合适的条件下将它们返还到供体或不同受 体的雄性脊推动物的精子基本上减少的睾丸中，其中使它们自然地重 新住入精子减少的睾九。体外方法具有以下优点，在返还到同一睾丸 或不同的合适雄性受体的睾丸之前，可通过各种方法筛选转染的生殖 细胞以保证转基因以稳定状态结合入基因组。此外，在筛选和细胞分 类之后，仅可返还群体富集的生殖细胞。在本领域中许多参考文献更 加充分地描述了这些方法例如PCT/US98/24238,该文献通过引用结合 到本文中。然后雄性动物与同种的雌性动物交配，然后筛选转基因动物的子代。策略(例如毛色，如上述)的其它表型标记。另外或备选的，对于靶向 载体的存在，使用如上述和在以下实施例中所述的DNA印迹和/或 PCR，可篩选从后代的尾部组织获得的染色体DNA。依照本发明，对SPT靶向载体起正面作用的后代典型地为杂合体， 而SPT基因的纯合分裂是致命性的。自然地，该方法的成功需要所使 用的技术产生用于不同长度检测的多核苷酸产物，该长度取决于靶向 载体是否已结合进SPT基因座的染色体拷贝。例如如果使用如上述的 DNA印迹技术进行基因组分析，用于预测含野生型SPT基因的细胞对 照含重组体SPT基因的细胞的核酸内切酶消化的限制性片段，必须有 能够在电泳凝胶上检测的长度差异的量。这样，加入了耙向载体的杂合的转基因动物将产生与探针杂交的不同长度的两个片段。本领域的那些技术人员可容易地理解虽然本文描述的突变已插 入亲代动物例如小鼠的生殖细胞，但本发明的转基因动物的分裂的 SPT基因最终将存在于子代及其后代的生殖细胞中。另外，遗传物质 也存在于生殖细胞之外的子代细胞即体细胞中。也可使用鉴别和表征SPT杂合分裂突变后代的其它方法。例如， RNA印迹可用于探测从后代的各种组织获得的mRNA，探测编码突变 的SPT基因、编码可选择标记序列或编码两者的转录物的存在或不存 在。另外，通过用抗SPT蛋白的抗体或抗可选择标记序列蛋白产物的 抗体，探测蛋白质印迹，蛋白质印迹可用于评价这些后代的各种组织 中的SPT多肽产物的表达水平。本发明也预期通过任何方法从本文描述的杂合分裂突变动物获 得体细胞或生殖细胞系。关于生殖细胞，可通过常规方法收获、分离 选择、去除、提取这样的细胞，或通过常规方法另外从本发明的无效 突变啮齿动物获得这样的细胞。关于体细胞，这些细胞可用于发育或 维持细胞系。可使用在本领域中已知的方法诱导出、获得、去除、体 内解剖或另外从本发明的无效突变体分离和维持这样的细胞系。本发明的另 一个实施方案涉及用于检验由Sptlcl或Sptlc2基因的 杂合缺乏引起的表型后果的体内动物^^莫型，其中该动物模型为具有编 码丝氨酸棕榈酰-CoA转移酶(SPT)亚单位的至少一个内源基因的杂合 分裂的哺乳动物。因为SPT涉及各种生物的、医学的或生理学的过程 或现象，包括但不限于动脉粥样化形成、动脉粥样硬化，细胞生长、 分化和凋亡的调节或遗传性感觉神经病，所以具有Sptlcl或Sptlc2基因 的杂合缺乏的动物才莫型用于研究上述过程/现象的机制和/或病因学。 在特定的实施方案中，本发明的具有Sptlcl或Sptlc2基因的杂合缺乏的 动物模型将用作哺乳动物体内筛选模型，以研究这些及其它的过程/ 现象。"动物^t型"指在其解剖、生理或对用于医学研究的病原体的反应方面十分像人的动物，所述医学研究用于研究正在谈论的生理或病理环境。依照本发明，动物;漠型可为旨在理解生物机制例如神经鞘脂代 谢的探索性模型，或旨在或多或少理解复杂的生物问题的解释性模 型。本发明的"动物模型"的范围也包含预测模型，其中使用该动物模 型的目的为发现和量化治疗的影响，不管是治愈疾病或评价化合物的 毒性。在本发明的特定实施方案中，提供用于研究动脉粥样硬化的动 物模型，其中该动物具有Sptlcl或Sptlc2基因的杂合缺乏。在本发明的 另一特定的实施方案中，提供用于动脉粥样硬化的预防或治疗/补救的 预测的动物^t型，其中该动物具有Sptlc 1和Sptlc2基因中的至少 一个的 过度表达。在还另一特定的实施方案中，本发明涉及通过检测Spclcl 和/或Spclc2的突变而诊断动脉粥样硬化或患动脉粥样硬化的风险的 方法。本发明也预期通过检测Spclcl和/或Spclc2的突变而诊断代谢综 合征或胰岛素抗性、糖尿病和肥胖症或患这样的病症或疾病的风险的 方法。"治疗有效量"指治疗病症或疾病特别是动脉粥样硬化所需要的剂量。术语"治疗"或"治疗"是指病原体或异常的酶/蛋白质活性的有效 抑制、中和抑制或停止，使得预防或延緩发作，延緩发展或改善系统 的、局部的和组织或器官的损害，和由病原体或异常的酶/蛋白质水平 引起的障碍、病症或疾病的症状。"受试者"是指任何哺乳动物，优选人。"诊断"指检测、鉴别或识别病症或疾病或患疾病或病症例如动脉 粥样硬化的风险。"病因"指疾病或病症的原因；相关或基于的原因；或促进疾病或 病症的原因。"非病因"指在调查或诊断下不是病症或疾病的病因。依照本发明，可分析Sptlc 1 +/-或Sptlc2+A动物例如'J 、鼠的各种标 记，包括血浆Cer水平、血浆和肝脏S1P水平、血浆LysoSM水平、血 浆Sph水平和血浆SM和PC水平。本文仅描述这些标记的事实不应理解病症/过程或现象。相反，仅以举例的方式提供这些标记；对本领域的 那些技术人员来讲本发明的广泛的研究和治疗效用是显而易见的，并 明确包括在本发明的范围内。仅作为实例，本发明的Sptlcl+Z-或 Sptlc2+Z-小鼠也可用于研究癌发生、尼曼-匹克病、代谢综合征或胰岛 素抗性、糖尿病和肥胖症。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合到SPT亚单位的配体/ 抑制剂分子。
本发明考虑的配体/抑制剂分子可为但不限于小分子或大分子或 化合物。例如，本发明包括可特异性结合到SPT亚单位的蛋白质/肽或 DNA/RNA分子。多球壳素和环丝氨酸为可特异性结合到SPT或其亚单 位的分子的两个实例。
在特定的实施方案中，本发明涉及制备用于治疗动脉粥样硬化的 动物模型和使用该动物模型筛选用于治疗动脉粥样硬化的药物的方 法。
本发明考虑的动脉粥样硬化动物模型可为现有的动脉粥样硬化 动物模型，例如载脂蛋白E缺乏的小鼠，或可通过例如用栽脂蛋白E缺 乏的背景制备具有Sptlc 1和/或Sptlc2基因过度表达或基因缺乏的转基 因小鼠来制备。
可通过适当地给予这样制备的动脉粥样硬化的动物模型试验药 物例如上述的配体/抑制剂，通过检验试验药物对it型动物的效果(例 如存活率)，来进行用于治疗动脉粥样硬化的药物的筛选。
无意被任何特定的理论限制，认为本发明的用于动脉粥样硬化 的治疗药物通过抑制与动脉粥样硬化的病因学和/或病理学发展紧密 相关的Sptlcl和/或Sptlc2的过度表达而发挥治疗效果。
因为认为增加的SPT活性导致动脉粥样硬化，因此认为如本发 明所预期的通过抑制Sptlcl和/或Sptlc2基因表达而防止SPT活性的增 加也可用作用于动脉粥样硬化的预防方法。在另一个实施方案中，本发明涉及预防或治疗动脉粥样硬化的方 法，该方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的对至少一个丝氨酸
棕榈酰-CoA转移酶(SPT)亚单位特异性的配体/抑制剂。
在还另一个实施方案中，本发明涉及用于预防动脉粥样硬化的方 法，该方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的多球壳素，其中给 药途径为静脉内、皮下、肌内或腹膜内。
在还另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗动脉粥样硬化的方 法，该方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的多球壳素，其中给 药途径为静脉内、皮下、肌内或腹膜内。
依照本发明，给予多球壳素引起血浆鞘磷脂(SM)、神经酰胺(Cer)、 鞘氨醇(Sph)和鞘氨醇-l-磷酸酯(SlP)水平下降。依照本发明，服用多 球壳素也引起血浆磷脂酰胆碱(PC)水平增加和在普通食物和高脂肪、 高胆固醇食物的载脂蛋白E剔除(载脂蛋白E KO)小鼠中的动脉粥样硬 化损害减少。见实施例3。
在还另一个实施方案中，本发明提供用于研究代谢综合征或胰岛 素抗性、肥胖症和糖尿病的动物模型，其中模型动物的基因组包含编 码丝氨酸椋榈酰-CoA转移酶(SPT)亚单位的至少一个内源基因的杂合 分裂。
通过以下非限制性实施例进一步阐述本发明。 实施例1
制备用于研究动脉粥样硬化的动物模型 Sptlcl的基因置换载体构建
将包含来自小鼠129X基因组库的Sptlcl外显子7-10的12 kb小鼠基 因组的DNA片段用于靶向载体的构建(
图1)。用PacI-线性化的靶向载体 电穿孔、并用G418选择性地筛选胚胎干细胞(ES)。将DNA印迹分析和 PCR用于筛选靶向的ES细胞。用ECoRV消化基因组DNA，和仅3'至靶 向载体的350-bp DNA片段(图2)用作DNA印迹的探针。野生型(WT)包含7.2kb片段，而重组体包含5.5 kb片段而没有外显 子7或8(
图1B)。用引物对SrSA5和Neo2来4妙CR。引物SrSA5位于短臂 的外部，具有序列5'-TCAGAGATTCTCCATTGCCACTG-3'(SEQ ID NO: 1)。引物Neo2位于neo基因盒的5'-启动子区域，具有序列 5'-TGCTGTCCATCTGCACGAGA-3'(SEQ ID NO: 2)。阳性克隆引起l .0 kbPCR片段。将正确靶向的ES细胞系微量注射入C57BL/6J胚泡。产生 嵌合子小鼠，并提供分裂的Sptlcl基因的种系传递。
Sptlc2的基因置换栽体构建
Sptlc2基因打靶的总体策略是用新霉素抗性基因取代外显子1 (图 2)。因为外显子1包含翻译起始密码子ATG，期望外显子l的删除产生 无效的Sptlc2'J、鼠模型。通过筛选小鼠基因组库来克隆Sptlc2的基团片 段。该克隆包含小鼠Sptlc2基因的7.5 kb的5'側翼区外显子l和4.5 kb的 内含子l，该克隆用于基因靶向载体的构建(图2)。用PacI-线性化靶向 载体电穿孔ES细胞，并用G418选择性地筛选ES细胞。DNA印迹分析 和PCR用于筛选靶向的ES细胞。
用Ncol和Sphl消化基因组DNA，并且仅3'至耙向载体的300-bp DNA片段(图2)用作DNA印迹的探针。WT包含6.2 kb片段，而重组体 包含3.1 kb片段而没有外显子l(图2B)。两个引物(SPTSAl和Neol)，其 中 一 个位于耙向载体的外部，具有序列 5'-CAGGACTCATGACAACTTACC曙3' (SEQ ID NO: 3)，另 一个在新霉 素抗性基因的 5'末端处， 具有序列 5'-TGCGAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGC-3' (SEQ ID NO: 4)(图 2)，用于进行PCR。阳性克隆引起0.8 kb PCR片段。将正确靶向的ES 细胞系微量注射入C57BL/6J胚泡中。产生嵌合子小鼠，并提供分裂的 Sptlc2基因的种系传递。
用于该研究的动物和食物嵌合体的雄性与C57BL/6雌性交配，将产生的包含分裂等位基因 的F1代动物与产生的F2代小鼠杂交。用C57BL/6小鼠回交这些小鼠5 代。所有表型特征在于在同一代内都具有野生型(+/+)和杂合子(+/-), 所有动物为10到12周龄。用Purina啮齿动物食物(第5001号)饲养动物 (ResearchDiets有限公司，美国，新泽西州，新不伦瑞克省)。
Sptlcl和Sptlc2的表达及SPT活性
用TriZol(Invitrogen)从肝脏分离全部的RNA。用ABI棱镜7000HT 序列检测系统(Applied Biosystems)上的实时聚合酶链反应(PCR)测量 Sptlcl和Sptlc2的mRNA水平。使用以下的引物和^:针组
Sptlcl
正向引物5'AGGGTTCTATGGCACATTTGATG3' (SEQ ID NO:
5),
反向引物5'TGGCTTCTTCGGTCTTCATAAAC3' (SEQ ID NO: 6)， 探针5'ATCTGGATTTAGAAGAGCGCCTGGCAA3' (SEQ ID NO:
7);
Sptlc2
正向引物5'CAAAGAGCTTCGGTGCTTCAG3' (SEQ ID NO: 8), 反向引物5'GAATGTGTGCGCAGGTAGTCTATC3' (SEQ ID NO:
9) ,
探针5'AGGATACATCGGAGGCAAGAAGGAGC3' (SEQ ID NO:
10) 。
以与(3肌动蛋白mRNA的比率来表示每个mRNA水平。匀化缺乏 Sptlcl和Sptlc2的小鼠以及野生型小鼠的肝脏组织。如前述(15)，用311-丝氨酸和棕榈酰辅酶A作为底物来测定SPT的活性。
鞘磷脂合酶与鞘磷脂酶
如前述(16、 17)测定鞘磷脂合酶和鞘磷脂酶的活性。小鼠肝脏Sptlcl和Sptlc2的蛋白质印迹
使用小鼠肝匀浆(200 iLig蛋白质)，在3-20。/。的SDS聚丙烯酰胺梯 度凝胶上进行SDS-PAGE，将分离的蛋白转移到硝基纤维素膜。使用 多克隆抗小鼠Sptlcl抗体(BD Biosciences Pharmingen)来进行Sptlcl的 蛋白质印迹分析。依照小鼠Sptlc2肽序列kysrhrlvplldrpfdettyeeted (536-560氨基酸残基)，使用Proteintech Group有限公司生产的多克隆抗 小鼠Sptlc2抗体来进行Sptlc2的分析。将小鼠IgG(Novus Biologicals)的 辣根过氧化物酶缀合的兔多克隆抗体用作Sptlcl的次级抗体，而将兔 IgG(Novus Biologicals)的辣根过氧化物酶缀合的山羊多克隆抗体用于 Sptlc2 。将SuperSignal West检测试剂盒(Pierce)用于检测步骤。将 GAPDH用作负荷控制。用Image-Pro Plus 4.5版软件(Media Cybernetics 有限^^司)来测量各个带的最高强度，并用于分析。
脂质和脂蛋白测定
对于小体积的小鼠血浆，用HDL胆固醇试剂(Sigma Chemical公司) 从包含脂蛋白的载脂蛋白B中分离出HDL。用酶的方法(Wako Pure Chemical Industries有限公司，日本大阪)测定血浆中的总胆固醇和磷脂 和HDL。用superose6B柱，通过快速蛋白液相色谱(FPLC)获得脂蛋白 曲线。
质谱仪(MS)的神经鞘脂分析
如前述(18)，进行血浆和肝脏的S1P、 Cer、鞘氨醇(Sph)以及鞘磷 脂(SM)类物质的分析。
统计分析
用Student t检验测试组间的差异。数据表示为平均值士标准差 (SD)。
实施例2Sptlcl和Sptlc2缺乏降低的肝脏Sptlcl和Sptlc2的mRNA、质量和
活性水平
用neo基因替代外显子7和8(图lA)，使用正向选择，靶向小鼠 Sptlcl基因。为了筛选同源要素，用EcoRV消化ES细胞的基因组DNA。 使用在内含子6内和靶向序列之外的350 bp片段，分析DNA印迹(图 1B), 150个ES细胞克隆中的5个显示同源结合。将5.5-kb信号添加至内 源性的7.2-kb信号显示在Sptlcl基因座位点特异性结合(图lB)。将正确 靶向的细胞注射入C57BL/6J宿主胚泡。产生6个嵌合体(3个雄性、3个 雌性)，所有这些雄性嵌合体通过种系传播分裂的Sptlcl等位基因。杂 交得到的杂合小鼠。在筛选300子代后，没有发现纯合子的动物。筛 选15天至20天的胚胎，又没有发现纯合子的小鼠。如预期的，这表明 纯合的Sptlcl缺乏引起胚胎的致死。
使用同样的策略靶向Sptlc2基因，用neo基因替代外显子l(含翻译 起始位点)(图2A)。为了篩选同源要素，用SphI和NcoI消化ES细胞的基 因组DNA。使用在内含子l内和靶向序列之外的300bp片段，分析DNA 印迹(图2B), 200个ES细胞克隆中的3个显示同源结合。将3.1-kb信号 添加至内源性的6.2-kb信号显示在Sptlc2基因座位点特异性结合。将正 确靶向的细胞注射入C57BL/6J宿主胚泡。产生5个嵌合体(3个雄性、2 个雌性)，这些雄性嵌合体中的2个通过种系传播分裂的Sptlc2等位基 因。杂交得到的杂合小鼠。在筛选250子代后，没有发现纯合子的动 物。也筛选15天至20天的胚胎，又没有发现纯合子的小鼠，表明完全 的Sptlc2缺乏也引起胚胎致死。
实时PCR分析表明与WT小鼠相比，在杂合的Sptlcl缺乏的 (Sptlcl+。小鼠肝脏中的Sptlcl mRNA减少了44y。(图3A)。此外，在 Sptlcl+/_小鼠中，肝脏SPT活性和Sptlcl蛋白质质量分别减少了 45%和 50% (图4 A和图5A)。实时PCR分析也显示在Sptlc2+〃小鼠的肝脏中 的Sptlc2 mRNA比WT小鼠少约57。/。(图3B)。因此，Sptlc2+/—小鼠肝脏 的SPT活性比WT小鼠少60%， Sptlc2仏小鼠肝脏的Sptlc2质量比WT小鼠少70% (图4B和图5 B)。此外，惊奇地发现在Sptlc2+〃小鼠肝脏中 的Sptlcl质量减少了70。/。(图5A),而在Sptlcl+小鼠肝脏中的Sptlc2质 量减少了53。/。(图5B)。这表明Sptlcl和Sptlc2必须相互作用，否则是不 稳定的。
血浆脂蛋白分析
如表1所示，通过沉淀(Sptlc 1+/ —小鼠对野生型同窝出生仔鼠、 Sptlc2+/—小鼠对野生型同窝出生仔鼠)的血浆脂蛋白分析显示杂合的 Sptlcl和Sptlc2缺乏对磷脂、胆固醇或甘油三酸酯均无显著的影响。快 速蛋白液相色谱(FPLC)证实了这些结果。
血浆神经鞘脂分析
利用质谱仪(MS)研究SPT活性的减少是否对血浆神经鞘脂包括 SM、 lysoSM、 Cer、 SlP和Sph的水平有任何的影响。发现在Sptlcl"一 和Sptlc2+^小鼠中的血浆Cer、 SlP和Sph与WT动物相比均显著减少(表 2),而血浆总SM没有变化(表3)。这证明了神经鞘脂生物合成途径的复 杂性。这也值得注意1)在SptlclW—和Sptlc2+小鼠中的LysoSM与WT 相比分别急剧地减少16.4和17.0倍(表3); 2)在小鼠血浆中的主要Cers 为Cer24:0、 Cer24:1、 Cerl8: 0和C16: 0 (表2);和3)在小鼠血浆中的主 要SMs为C16:0、 C24:l、 C24: 0、 C22: 0和C22:1 (表3)。
肝脏神经鞘脂分析
利用质谱仪(MS)研究SPT活性的减少是否对肝脏神经鞘脂包括 SM、 Cer、 SlP和Sph的水平有任何的影响。发现在Sptlcl+一和Sptlc2W _小鼠中的肝脏Cer和Sph与WT动物相比均显著减少，^旦S1P不减少(表 4),同时又惊奇地发现血浆总SM没有变化(表5)。为了研究在鞘磷脂动 态平衡中两种酶即鞘磷脂合酶和神经磷脂酶的可能的联系，测量在 Sptlcl仏和Sptlc2+小鼠中的酶活性,与WT同窝出生仔鼠相比，没有 发现显著的变化。这些结果证明了神经鞘脂生物合成途径的复杂性。本发明首次提供Sptlcl和Sptlc2基因在体内的部分分裂引起l)肝 脏Sptlcl和Sptlc2 mRNA和蛋白质，以及SPT活性水平的显著减少；2) 为了维持它们自身的稳定性，Sptlcl和Sptlc2相互需要；3)在小鼠中的 血浆Cer、 S1P、 Sph和lysoSM的显著减少；4)在小鼠中的肝脏Cer和Sph 的显著减少；和5)与对照相比，血浆SM、总胆固醇、总磷脂或甘油三 酸酯水平无显著的变化。
一些体外的和离体的证据表明Sptlcl和Sptlc2是SPT的两个亚单 位，而操作两个基因将影响神经鞘脂代谢(11-14)。但迄今为止一直缺 乏体内的任何直接的证据。在本发明中，建议用Sptlcl或Sptlc2基因缺 乏的小鼠来评价Sptlcl或Sptlc2与SPT活性之间的关系、以及Sptlcl或 Sptlc2缺乏与神经鞘脂代谢之间的关系。以下的体内证据支持Sptlc 1和 Sptlc2是SPT的两个亚单位的观点1)Sptlcl+厂和Sptlc2+^小鼠均表明在 肝脏中SPT活性显著减少；2)Sptlc2似乎是不稳定的，除非它与Sptlcl 締合，反之亦然；3)在神经鞘脂的代谢方面，Sptlcl或Sptlc2基因的杂 合缺乏均引起相同的表型；和4)纯合的Sptlcl和Sptlc2均为胚胎的致死 因子。
认为SPT是Sptlc 1和Sptlc2的两个亚单位的异源二聚体(19)。然而， 在Sptlc2+〃小鼠中，Sptlcl和Sptlc2蛋白质质量以及SPT活性均比在 Sptlc 1+/ —小鼠中减少得更多(图4和图5 )。由于没有改变在Sptlc2+/ —小鼠 中Sptlcl的mRNA水平或在Sptlcl+一小鼠中Sptlc2的mRNA水平(图3), 蛋白质质量的变化很可能是由于有稳定的亚单位的化学计量。基于该 事实，无意受任何特定理论的限制，认为该酶复合物包含多聚的Sptlcl 和Sptlc2亚单位。
一些非常重要的神经鞘脂分子受Sptlcl或Sptlc2杂合缺乏的调节。 那些神经鞘脂在细胞膜形成、信号转导以及血浆脂蛋白代谢中起着重 要的作用。所有这些功能可能很好地影响动脉粥样硬化的发展。
Sptlc 1或Sptlc2缺乏？ 1起血浆Cer水平的显著降低。Cer是众所周知 的涉及凋亡的第二信使(20)。典型地提高细胞的Cer的策略用于针对使生长停止或促进凋亡的治疗。Charles等发现直接应用于受损的动脉的 Cer类似物可以强烈抗增殖(21)。在体内，C6-Cer涂覆的球嚢导管，通 过阻止ERK和AKT发信号，来防止在兔颈动脉(21)内拉伸诱导的新内 膜增生，从而在拉伤的血管平滑肌细胞内诱导细胞周期停止(22)。
Sptlcl或Sptlc2缺乏引起血浆SlP水平的显著减少。在人体血浆中， 65。/。的S1P与脂蛋白締合，其中HDL是主要的载体(23)。有一些关于血 浆或血清S1P是否是导致动脉粥样硬化的或抗动脉粥样硬化的介体的 争论。在一方面，在人体内皮细胞上，已显示在HDL中的S1P结合到 SlP/Edg受体，基于这个原因，大概在内皮细胞上介导HDL的许多的 抗炎作用(24)。在另一方面，在最近的病例对照研究中，发现血清S1P 是冠脉狭窄的发生和严重性的非常强的预才艮者(25)。
Sptlcl或Sptlc2缺乏引起血浆LysoSM水平急剧降低。LysoSM是在 几个细胞内和细胞间事件中熟知的一个重要第二信使，已参与细胞生 长、分化和凋亡的调节(26)。它增加细胞内的钙浓度和在内皮细胞内 的一氧化氮的产生，引起牛冠状动脉的内皮依赖性血管舒张(27)。 LysoSM也可通过更改心脏斯里兰卡肉桂碱受体的门控动力学来调节 妈从内质网的释放(28)。 LysoSM提高了在培养的人角化细胞的培养基 中的细胞间粘附分子-1的表达水平和坏死因子-a水平(29)。 LysoSM也 可在尼曼-匹克病的病理生理学中发挥作用(30)。
Sptlcl或Sptlc2缺乏引起血浆Sph水平的显著下降。最初发现Sph 和它的N,N-二曱基衍生物(DMS)抑制蛋白激酶C(PKC) (31,32)，作为二 酰基甘油的相似物(33)。最近的净良告显示Sph通过胱冬酶3的激活和 PKC5 KD的释放来特异性促进细胞凋亡(34)。
本发明人以前已报道给予载脂蛋白E KO小鼠的多球壳素(SPT 抑制剂)引起SPT活性的降低、血浆SM的减少和血浆磷脂酰胆碱(PC) 水平的诱导(18)。出人意料地，发现在Sptlcl+一或Sptlc2+r小鼠中血浆 SM或PC水平无显著变化。这可能是由于多球壳素对SM和PC生物合成 的直接或间接的影响。例如，多球壳素可在鞘磷脂合酶(SM生物合成的最后的酶)(16)、神经磷脂酶(17)和CTP:磷酸胆碱胞苷酰转移酶(PC 生物合成的关键酶)(35)的调节中起作用。在3 ^1+/_或5 1102+/-小鼠肝 脏中，没有观察到鞘磷脂合酶和鞘磷脂酶活性的显著改变。此外，已 知多球壳素是有效的免疫抑制剂(36)，所以也可能参与某些细胞因子 或趋化因子的调节的多球壳素又引起SM和PC生物合成途径的改变。
总之和按照本发明，已经确定Sptlcl和Sptlc2负责SPT活性。由 Sptlcl和Sptlc2基因分裂介导的SPT抑制显著降低血浆Cer、 S1P、 Sph 和lysoSM水平，并具有抗动脉粥样硬化的性能。由于SPT抑制对胆固 醇代谢没有影响，SPT活性的抑制将是重要的可供选择的动脉粥样硬 化的治疗方法。
实施例3
多球壳素和动脉粥样硬化 动物和多球壳素治疗
从The Jackson Laboratory (缅因州，巴港)购买八周龄的栽脂蛋白E KO小鼠。持续八周每隔一天经腹膜内注射多球壳素(0.3毫克/千克) (Biomol Research Laboratories有限公司)或磷酸盐緩冲水溶液。动物喂 食Purina啮齿动物食物(目录号5001)或高脂肪、高胆固醇食物(20%乳脂 和0.15%胆固醇；威斯康辛州，麦迪逊市，Harlan Teklad)。
脂质和脂蛋白测量
采集禁食血浆用于快速蛋白液相色语(FPLC)分离和脂质测量。由 酶法分析在血浆中的总胆固醇、磷脂和甘油三酸酯及脂蛋白(Wako Pure Chemical Industries有限公司，日本大P反)。如前所述测量血桨鞘磷 脂(JBC 13)。从总磷脂浓度减去SM得到PC浓度。也如前述使用 SDS-PAGE进行载脂蛋白分析(JBC 14)。
质谱分析神经鞘脂
在南卡罗来纳医科大学，生物化学与分子生物学系，在一次一付医疗费的基础上，在以多重反应监测、阳性离子化模式操作的Thermo Finnigan TSQ 7000三节四极质谱仪上检测血浆鞘氨醇基、鞘脂 (sphingoid)基-l-磷酸酯和神经酰胺类物质。简而言之，用内标(ICn基 D國赤-鞘氨醇(17C画Sph)、 C7鞘氨醇-1画磷酸酯(17C画S1P)、 N-棕榈酰陽D画 赤-C3鞘氨醇(13C-Cer)和十七酰-D-赤-鞘氨醇(C17-Cer))强化250 ^L的 小鼠血浆和用乙酸乙酯/异丙醇/水(60: 30: 10) (v/v)溶剂系统萃取。蒸 发和在IOO iliL的甲醇中溶解后，将样品注入到测量器/TSQ 7000液相色 谱/质谱系统，并用l mM甲醇的曱酸铵溶液、2mM甲酸铵水溶液流动 相系统，从BDSHypersilC8、 150x3.2-mm、 3卞m粒度的柱梯度洗脱。 用Xcalibur软件系统收集和处理与目标分析物和内标对应的峰。定量 分析基于由掺加具有已知量的目标分析物合成标准品和等量的内标 的人工基质产生的校准曲线。目标分析物/内标峰面积比对分析物浓度 作图。使用线性回归模型，将样品的目标分析物/内标峰面积比类似地 归一化至它们各自的内标，与校准曲线相比较。
动脉粥样硬化
在多球壳素治疗期的末期，处死小鼠，去掉心脏和近端主动脉以 及整个主动脉，解剖，拍照。按照以前所述进行主动脉根(root)测定和 enface测定(JBC 15， 16)。
统计分析
用Student t检验测试组间差异。数据表示为平均值士S.D.。 p值〈 0.05^皮认为具有显著性差异。
在本发明中，利用两组8周龄的载脂蛋白EK0小鼠。持续八周每 隔一天，分别向第1组(11= 7)和第2组(11=7)动物注射100 pl的多球壳素 (0.3 mg/kg)或磷酸盐緩冲水溶液。正如预期，多球壳素处理的小鼠的 肝脏中SPT活性比对照组少50。/。。
如在表6中所示，给予多球壳素后，血浆SM水平显著降低(54。/c)) (p< 0.001)，血浆PC水平显著增加(91o/。)(p〈 0.0001)，而总胆固醇和甘油 三酸酯水平无显著变化。应强调，与对照组相比，在多球壳素处理的 组中PC/SM比率显著地增加(3170/。) (p < 0.0001)，表明脂蛋白成分改 变。
为了研究在多球壳素治疗或没有多球壳素治疗时在脂蛋白中的 脂质分布，利用FPLC细分脂蛋白，测量在各组分中的SM、 PL和胆固 醇。结果发现多球壳素显著降低SM和增加PC水平，但对胆固醇没有 显著影响(图6)。 SDS-PAGE显示载脂蛋白包括栽脂蛋白B100、载脂蛋 白B48和载脂蛋白A-I的水平没有显著的变化。
利用质谱仪研究多球壳素治疗是否对其它神经鞘脂包括Cer、 Sph 和S1P的水平有任何影响。在多球壳素治疗后，Cer、 Sph和SlP显著减 少(表7),表明多球壳素治疗不仅影响血浆SM水平，而且影响在信号 转导中的三个重要的第二信使Cer、 Sph和SlP的水平。以下两个发现 也值得注意。l)在载脂蛋白E KO小鼠血浆中的主要的神经酰胺是 Cer24:0、 Cer24: 1、 Cerl8: 0和C16: 0(表7); 2)在载脂蛋白E KO小鼠中 的SlP和Sph浓度为~200 nM(表7)。
为了进一步评价多球壳素对血脂水平的影响，用高脂肪、高胆固 醇(西式)食物喂养有或没有多球壳素治疗的2月龄小鼠8周。如表8所 示，血浆SM水平显著地减少(59。/。)，然而在给予多^^壳素之后，血浆 PC水平和PC/SM比率显著地增力口(分别为100。/。和380。/。) (p < 0.0001)。 总胆固醇和甘油三酸酯水平没有显著改变，FPLC处理产生相同的结果 (图7)。并且，SDS-PAGE显示载脂蛋白包括载脂蛋白BIOO、载脂蛋 白B48和载脂蛋白A-I的水平没有显著的改变。也测量其它的神经鞘脂 水平，并发现在多球壳素治疗之后Cer、 Sph和SlP显著地减少(表9)。 当使用高脂肪、高胆固醇食物时，观察到深远的多球壳素影响。
据才良道多球壳素治疗(l mg/kg但不是0.3 mg/kg)减少在小鼠中的 T淋巴细胞数量(17)。在本实施例中，利用FAS评价多球壳素对循环中 T细胞计数的影响，没有发现任何差异。为了评价多球壳素对动脉粥样化形成的影响，解剖小鼠主动脉并 拍照。也测量近端的和全部的主动脉损害区域。以普通食物喂食给予
多^^壳素2个月的动物后，发现减少了主动脉的损害(图8A)。也发现 与对照组相比，近端主动脉的损害面积平均减少42%&<0.01),全部 的主动脉损害面积平均减少36。/o(p〈0.01)(图8B和图8C)。以西式食物 喂食给予多球壳素2个月的动物后，也发现减少了主动脉的损害(图 3A)。与对照组相比，近端主动脉的损害面积平均减少39%&<0.01)， 全部的主动脉损害面积平均减少37。/。(p〈0.01)(图8D和图8E)。这些结 果显示多球壳素具有重要的抗动脉粥样硬化的性质。
在本发明中，首次证明在载脂蛋白E KO小鼠中经腹膜内给予多球 壳素，引起以下情况l)在血浆中SM、 Cer、 SlP和Sph水平显著地减少； 2)在血浆中PC水平显著地增加，因此增加PC/SM的比率；和3)动脉粥 样硬化的损害显著减少。
多球壳素体内释放的两种方法包括腹膜内注射和口服。由于显示 后一种方法造成严重的胃肠毒性(JBC18)，并在高脂肪、高胆固醇负载 试验期间可能影响胆固醇的吸收，所以本实施例选择了前一种方法， 正如其它研究者一样(JBC19,20)。确实，腹膜内注射多球壳素没有改 变普通食物或高脂肪食物喂食小鼠的血浆胆固醇水平(表6和表8)。在 最近的寺良告中，Park等指出口服多球壳素引起血浆胆固醇和SM水平 的显著减少，因而引起高胆固醇饮食的载脂蛋白EKO小鼠动脉粥样硬 化损害的显著减少(JBC 21)。无意受任何特定机制的限制，根据血浆 胆固醇水平，相信那个研究和本发明的不同结果可能是由于多球壳素 释放的不同方法所致。
多^求壳素治疗之后明显诱导血浆PC水平(表I和表m)。该结果与先 前的报导一致，表明给予L-环丝氨酸(SPT的另一抑制剂)刺激CTP:磷 酸胆碱胞苷酰转移酶(CT: PC生物合成的关键酶)的活性74。/。 (JBC 22)。 无意受任何特定机制的限制，认为该作用可能是由于Sph的减少所致 (表II和表IV)，其为CT活性的特异性抑制剂(JBC 23)。有一些问题关于为什么多球壳素治疗在载脂蛋白E-缺乏的小鼠
中引起较少的动脉粥样硬化损害。无意受任何特定机制的限制，认为
SM的减少和在非HDL粒子中的PC含量的增加是机制之一。现在确凿 的证据证明了脂蛋白SM和动脉SMase在动脉粥样硬化形成中的作用。 被转运入动脉壁内在动脉粥样硬化性脂蛋白上的SM，作用于动脉壁 SMase，导致Cer含量增加和促进脂蛋白聚集(JBC 24)。与血浆LDL相 比较，从人体动脉粥样硬化损害部位提取的LDL高度富含SM (JBC 25, 26)。而且，聚集从新鲜人体损害部位提取的相当部分的LDL，该LDL 具有高含量的Cer,表明LDL已被SMase修饰，导致了聚集(JBC 24)。 在易感动脉粥样硬化的动物才莫型中，血浆SM的绝对和相对浓度均增加 (JBC 26-28)。体外操作已显示SM的相对浓度是对SMase诱导的聚集 的易感性的重要决定因素(JBC 24, 26， 29)。先前在病例对照研究中显 示血浆SM水平是冠心病的非依赖性危险因素(JBC 13)，在另一个更 大的、更均匀的病例对照试验中证明了该结果。
无意受任何特定机制的限制，认为在多球壳素治疗后的载脂蛋白 E KO小鼠中，血浆Cer水平的减少可能是减少动脉粥样硬化的另一种 机制。然而，该假设似乎在现有的报告中存在争论。众所周知，Cer 是涉及凋亡的第二信使(JBC30)。典型地提升细胞Cer的策略用于针对 停止增长或促进凋亡的治疗。Charles等发现直接应用于受损动脉的 Cer类似物，可以强烈地抗增殖(JBC31)。培养的血管平滑肌细胞的增 殖似乎涉及细胞外的信号调节激酶(ERK)和AKT激酶级联，以被Cer 抑制(JBC 32)。在体内，通过使ERK和AKT信号失活，在兔颈动脉内 C6-Cer涂层的球嚢导管防止拉伸诱导的新内膜增生(JBC 31),从而诱 导细胞周期停止在拉伸损伤的血管平滑肌细胞内(JBC 31)。基于已公 开的才良告，预期在多^求壳素治疗的载脂蛋白EKO小鼠中比在对照组中 有更多的动脉粥样硬化损害，但依照本发明发现了相反的结果(图8)。
无意受任何特定机制的限制，认为在多球壳素治疗后的载脂蛋白 EKO小鼠中，血浆S1P水平的减少是减少动脉粥样硬化形成的另一种机制。在人体血浆中，65。/。的S1P与脂蛋白締合，其中HDL为主要的 载体(JBC33)。在一方面，已显示HDL中的S1P结合到人内皮细胞上的 SlP/Edg受体，由于这个原因，可能在内皮细胞上介导HDL的许多抗 炎作用(JBC 34)。在另一方面，在最近的病例对照研究中发现血清 S1P为冠脉狭窄发生和严重程度的非常强烈的预才艮者(JBC 35)。应该指 出在载脂蛋白E KO小鼠中SlP浓度》00 nM(表II)，而在内皮细胞上 激活S1P受体所需的数量为 100 nM (JBC 34, 36)。因此在小鼠模型中， 由多球壳素治疗将S1P减少到〈100 nM (表II)可能与动脉粥样硬化发展 具有病理相关性。
据报道，多球壳素治疗(l mg/kg但不是0.3 mg/kg)降低在小鼠中的 T淋巴细胞数量(JBC 37)。利用藻红蛋白标记的抗CD3抗体和流式细胞 计来评价多球壳素对在循环中的T细胞数量的影响，发现无差异，证 实给予0.3 mg/kg多球壳素对T细胞数量无影响(JBC 37)。
总之和依照本发明，已经证明由多球壳素介导的SPT抑制显著减 少血浆SM、 Cer、 SlP和Sph的水平，具有抗动脉粥样硬化的性质。因 为治疗对胆固醇代谢没有影响或很少影响，SPT活性的抑制可为动脉 粥样硬化的重要替代治疗。
表l、在Sptlcl仏、Sptlc2仏和WT小鼠中的预处理参数小鼠 HDL-C 非-HDL"C HDL-PL 非-HDL-PL
甘油三酸酯
(mg/dl) (mg/dl) (mg/dl)(呵/dl) (mg/ml)
Sptlcl+/_ 62土7 29土5 150土11 43土9
对照組 63+9 28 + 6 159+15 47+3
59土3 61+7
Sptlc2+/— 61土2 30土6 148土18 42土5 55土4
对照组 62 + 5 28十7 153+21 42+10 57+9
数
值，平均值士SD。 n=6t
表2. Sptlcl仏、Sptlc2仏和WT小鼠中血浆神经鞘脂测量
C18:lCer C14Cer C16Cer C18Cer C20Cer C24CerC24:lCei: DHSph DHSph-lP 柳 S1P
nM
Sptlc2w- 2土"
10土4* 15土^ 33^7， 646土38* 973土214* 17土:i4 17土211 31土24
9土54 15土58 37土84 742土87* 1051土210* !L8丄3， 1Sj^ 30土3*数值，平均值士SD。 n=6。用不同的小写字母标记的栏在统计学 上是不同的(pO.Ol)。 Cer:神经酰胺；DHSph: 二羟基鞘氨醇； DHSph-lP: 二羟基鞘氨醇-l-磷酸酯；Sph:鞘氨醇；SIP:鞘氨醇-l-磷酸酯。
表3、在Sptlcl仏、Sptlc2仏和WT小鼠中的血浆鞘磷脂测量
C工4SM C1SSM C18SM C18:1SM C20SM C20:1SM C225M C22:1SM C24SM C24:1SM
Sptlci"— 1.2土.74 3,l土." 3.3i,S& 3.3丄.38- 2.2土，6'"之3' 10"a 16土2* 35土2，
Sptlc2""" 1, 4之.53 4"6丄71 3-3j;.54 3.5土-$'3.7土.S,2.4土.4* 13上40 1'0土1* 15土2* 32j;34 70+3 W1，1.5土.5* 45土2* 3,2土.4* 2.4上.2& 3.4土，3' 2.0;t.5' 16土5* 8土315 17土丄* 28j:.2b
数值，平均值士SD,n-6。用不同小写字母标记的栏在统计学上是 不同的(p0.05)。 SM:鞘磷脂。
表4、在Sptlcl仏、Sptlc2仏和WT小鼠中的肝脏神经鞘脂测量C13:lCer Cl4Csjr C16Cer ClBCer C20Cer 'C24Cei: C2"lCer DHSpti Spti SlP
pmol/rag蛋白质
Sptaci"- 8土2' 4之1' 22主3* 25上9* 20上2' 89土9* 112之284 4土1& 26丄53 3=1*
Sptlc2"- 6主31 <1土1* 17土2， 17二34 68土17* 07土2工* 3土14 23土33 3土28
WT 7土24 4土2* 27±3b 36±3b 25土3** 134土186 135土22b 6;t:Lb 33i4b 3ilb
_数值，平均值士SD，1^6。用不同小写字母标记的栏在统计学上 是不同的(pO.Ol)。 Cer:神经酰胺；DHSph: 二鞋基鞘氨醇；Sph:鞘 氨醇；SIP:鞘氨醇-l-磷酸酯
表5、在Sptlcl仏、Sptlc2仏和WT小鼠中的肝脏鞘磷脂测量
C"SM C16SM C18SM C13ilSM C20SM C20:1SM C22SM C22:1SM C24SM
C24:1SM
pmol/mg蛋白质
Sptlcl"' "03上403917S土294 1 3土21* 133土13a 139土26* 1206土332* 8CU土55' 1039之350*
1082土24 SpUc2"' 6土24 1352土2734 157土39* :172土314 211土269 138土441 imj:401a 83i土924 987土211^ la92土2511
WT 5土1， 1389土293*182土34* 152土25* 128土561 1136主239， 761土73* 1042土1933
数值，平均值土SD,1^6。用不同小写字母标记的栏在统计学上是 不同的(p0.05)。 SM:鞘磷脂。表6
在喂食普通食物的载脂蛋白E KO小鼠中给予多球壳素后的血浆 脂质测量
数值为平均值士S.D.。 Choi:胆固醇；TG:甘油三酸酯。
SM PC Choi TG PC/SM
wg/d/ mg/d/ mg/W wg/d/
^照、纟且 71 ±8 209 ±23 591 ±73 65 ± 172.9 ±0.5
多球壳素 33 士 3。 399 ±59。
660 ± 105 75 ± 19 12.1士0.2a
V<0.001，w = 7.
表7
在喂食普通食物的载脂蛋白E KO小鼠中给予多球壳素后的血浆 神经鞘脂测量
数值为平均值士 S.D.。 DHSph: 二羟基鞘氨醇；DHSph-lP: 二羟 基鞘氨醇-l-璘酸酯。
C18:lCer C14Ccr C16Ccr C18Ccr C20Cw C24Ccr C24:lCer DHSph DHSph-lP Sph S1P nM nM dM nMsM nM nM nM nM nM
nM
对JI 、纟且 9 ±2 10±324±2 87±9 "±8 2123±201 1461±209 27±546±12 173±21 226±50
多球壳素2土1112土21 11±3* 51 ±8' 35±9* 1321±22* 854±144' 30土3 9±5' 127±8* 58±9'
ap<0.01，n = 7.
表8
在喂食高脂肪食物的载脂蛋白E KO小鼠中给予多球壳素后的血 浆脂质测量
数值为平均值士S.D.。 Chol:胆固醇；TG:甘油三酸酯。
SM PC Choi TG PC/SM
nig/dl mg/dl mg/dl nag/dl
对照、纟且 114 ±11 397 ±93 1827 ±306 95士19 3.5 ±0.5
多球壳素 47±14a 795 rt97a 1807 ±342 107 ±27 16.9士0.2" ap<0.001,n=7.
表9在喂食高脂肪食物的载脂蛋白E KO小鼠中给予多球壳素后的血 浆神经鞘脂测量
数值为平均值士 S.D.。 DHSph: 二羟基鞘氨醇；DHSph-lP: 二羟 基鞘氨醇-l-磷酸酯。
C18:lCer C14Cer C16Cer C18Cer C20C汰C24Cct C24:lCwDHSph DHSph-lP Sph S1P 'iA^ wjW ;iA/ 'iA/ '!A/ M 'i/V/
对,瞎、纟且61土222±3 95± 19 205±3 100±5.5551±911 2423±277 29±355±12 172±21
21吐55
多球壳素9士r20±2I2±6a36±14" 45±11'1708±426a 1009±134a20±1° 10±2" U4士19'
42士19" 11 p< 0.01, n = 7.
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多球壳素和小鼠动脉粥样硬化10289。
权利要求
1.一种转基因剔除动物，所述动物的基因组包含编码丝氨酸棕榈酰-CoA转移酶(SPT)亚单位的至少一个内源基因的杂合分裂。
2. 权利要求1的转基因剔除动物，所述动物的基因组包含Sptlcl 的杂合分裂。
3. 权利要求1的转基因剔除动物，所述动物的基因组包含Sptlc2 的杂合分裂。
4. 权利要求1-3中任一项的转基因剔除动物，所述动物为小鼠。
5. —种用于研究动脉粥样硬化的动物^^莫型，所迷动物才莫型为具有 编码SPT亚单位的至少一个内源基因杂合分裂的哺乳动物。
6. 权利要求5的动物模型，其中所述动物包含Sptlcl的杂合分裂。
7. 权利要求5的动物才莫型，其中所述动物包含Sptlc2的杂合分裂。
8. 权利要求5-7中任一项的动物模型，其中所述动物为小鼠。
9. 一种筛选用于治疗动脉粥样硬化的药物的方法，所述方法包括 获得或产生动脉粥样硬化的动物模型，给予所述动物Sptlcl和/或 Sptlc2的特异性配体/抑制剂的试验候选分子或化合物，和筛选可治疗 动^c粥样硬化的分子或化合物。
10. —种配体/抑制剂，所述配体/抑制剂由权利要求9的方法获3曰付。
11. 一种预防动脉粥样硬化的方法，所述方法包括给予有需要的 受试者治疗有效量的对至少一个SPT亚单位特异性的配体/抑制剂。
12. —种治疗动脉粥样硬化的方法，所述方法包括给予有需要的 受试者治疗有效量的对至少一个SPT亚单位特异性的配体/抑制剂。
13. —种预防动脉粥样硬化的方法，所述方法包括给予有需要的 受试者治疗有效量的多球壳素，其中经静脉内、皮下、肌内或腹膜内 给予。
14 一种治疗动脉粥样硬化的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的多球壳素，其中经静脉内、皮下、肌内或腹膜内 给予。
15. —种用于研究代谢综合征的动物^f莫型，其中所述才莫型动物的 基因组包含编码丝氨酸棕榈酰-CoA转移酶(SPT)亚单位的至少一个内 源基因杂合分裂。
16. 权利要求15的动物模型，其中所述代谢综合征为胰岛素抗性 综合征、月巴胖症或糖尿病。
全文摘要
本发明提供用于动脉粥样硬化和转基因剔除动物的动物模型。也提供预防和/或治疗动脉粥样硬化的方法。更具体地讲，本发明通过给予有需要的受试者丝氨酸棕榈酰-CoA转移酶(SPT)或其亚单位的抑制剂，提供预防和/或治疗动脉粥样硬化的方法。
文档编号A01K67/027GK101517407SQ200680041317
公开日2009年8月26日 申请日期2006年9月7日 优先权日2005年9月7日
发明者M·R·霍亚蒂, X·江 申请人:纽约州州立大学研究基金会