苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的制作方法

专利名称：：苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的制作方法苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白本申请是中国专利申请00817997.2的分案申请，原申请的申请日是2000年12月19日，发明名称是"苏云金芽孢杆菌(BACILLUSTHURINGIENSIS)的杀虫蛋白"。引言本发明涉及编码苏云金芽孢杆菌(5ac/"^^MW"g,'erts/s)产生的杀虫蛋白的新的DNA序列。具体地说，本发明提供了编码被命名为Cry9Fa、CrylJd和CrylBf的蛋白的新的DNA序列，其有益于保护植物免受昆虫侵害。此处也包括用至少一种该新分离基因转化的微生物和植物，这样它们通过表达杀虫蛋白而赋予昆虫抗性。
背景技术：
：(i)发明领域Bt或苏云金芽孢杆菌因其对昆虫害虫的特异毒性而广为所知，并被用于控制植物的昆虫害虫几乎达一个世纪之久。最近几年，已经有了表达Bt蛋白的转基因植物，其已被发现能成功控制昆虫对植物的损害(如Vaeck等，1987)。尽管许多Bt晶体蛋白基因已经得到分离，但是对于编码杀虫蛋白的新基因的搜索仍在继续。实际上，与化学杀虫剂相比，Bt杀虫晶体蛋白的靶标昆虫范围公知为相对较窄。而且，对相同靶标昆虫种类具有多重毒性活性使得可使用具有不同作用方式的蛋白成为可能，从而可以防止或延緩昆虫抗性的发展。(ii)相关技术描述先前，CrylB-、CrylJ-和Cry9蛋白的几种类型已得到鉴定(见Crickmore等，1998,全部详情并入此文以作参考)。新的CrylBf蛋白与CrylBe蛋白的序列同一性最为接近(Payne等，1998，美国专利5，723，758)，但前者毒性蛋白片段的氨基^列与CrylBe蛋白毒性片段的氨基酸序列相比，仍有约14。/。的差异。与CrylJd的毒性片段序列同一性最接近的为CrylJcl蛋白的毒性片段(美国专利5，723，758),但这两个蛋白毒性片段的氨基,列仍有约18%的差异。如Midoh等人(PCT专利公开WO98/26073)和Narva等人(PCT专利公开WO98/00546)所述，与Cry9Fa的毒性片段序列同一性最接近的为Cry9Eal蛋白的毒性片段，但Cry9Fa和Cry9Ea蛋白的毒性片段仍有约21%的氨基酸序列差异。发明概述本发明提供了DNA序列，其编码的蛋白包含选自下列的氨基酸序列a)由保藏在BCCM-LMBP,保藏号为LMBP3986的crylBf基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片段的氨基酸序列，b)由保藏在BCCM-LMBP，保藏号为LMBP3983的crylJd基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片段的氨基,列，以及c)由保藏在BCCM-LMBP，保藏号为LMBP3984的cry9Fa基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片段的氨基酸序列。本发明特别优选编码含有下列氨基酸序列的蛋白的DNA序列SEQII)No.2蛋白的杀虫片段的氨基,列、SEQIDNo.4蛋白的杀虫片段的氨基酸序列和SEQIDNo.6蛋白的杀虫片段的氨基^列；或者可选编码含有下列氨基,列的蛋白的DNA序列SEQIDNo.2的氨基,列、SEQIDNo.4的氨基醋列、SEQIDNo,6的氨基,列；或者含有SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、或SEQIDNo.5DNA序列的DNA序列。此外，本发明提供了这样的DNA序列，其至少编码新分离蛋白的下列部分SEQIDNo.2从第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列、SEQIDNo.4从第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基,列、SEQIDNo.6从第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列。此外，本发明提供了含有人工DNA序列的上述DNA序列，该人工I)NA序列具有不同于天然存在的DNA序列中的密码子使用，但却编码相同的蛋白或其杀虫片段。更进一步地，本发明提供了包含选自下列氨基酸序列的蛋白a)由保藏在BCCM-LMBP,保藏号为LMBP3986的crylBf基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片段的氨基*列，b)由保藏在BCCM-LMBP,保藏号为LMBP3983的crylJd基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片段的氨基酸序列，c)由保藏在BCCM-LMBP，保藏号为LMBP3984的cry9Fa基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片段的氨基酸序列。此处尤其优选包含选自下列氨基^列的蛋白SEQIDNo.2蛋白的杀虫片段的氨基酸序列、SEQIDNo.4蛋白的杀虫片段的氨基酸序列和SEQIDNo.6蛋白的杀虫片段的氨基^列；或者包含选自下列氨基#列的蛋白SEQIDNo.2从第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列、SEQIDNo.4从第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列、SEQIDNo.6从第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列；或者含有SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、或SEQIDNo.6氨基酸序列的蛋白。此处，本发明也提供了含有在植物表达启动子控制下的上述DNA的嵌合基因和由转化而含有那些嵌合基因的植物细胞、植林或种子，其中所述植物细胞、植抹或种子尤其选自玉米、棉花、水稻、油菜籽、芸苔、茄子、大豆、土豆、向日葵、西红柿、甘蔗、茶叶、豌豆、烟草、草莓、苜蓿、黄瓜、西瓜、胡#1、燕麦、大麦、小麦、天竺牡丹、剑兰、菊花、甜菜、高粱、紫花苜蓿和花生。按本发明所述，该嵌合基因整合入植物细胞的染色体DNA或叶绿体DNA。另外，本发明也提供了由转化而含有任何上述DNA序列的、尤其是选自土;裏杆菌属(Agrobacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)或芽孢杆菌属(Bacillus)的孩t生物。此处也提供了一种控制昆虫的方法和使植物抗昆虫的方法，其中所述控制昆虫的方法包括在宿主细胞、尤其是植物细胞中表达任何上述DNA序列，并使昆虫和所述宿主细胞相接触；其中所述使植物抗昆虫的方法包括用任何上述DNA序列或嵌合基因转化植物细胞，并从此类抗昆虫细胞再生出转化植林。优选实施方案详述按本发明所述，编码新Bt毒素的DNA序列已被分离得到并得以描述。这些新基因被命名为crylBf、crylJd和cry9Fa，其编码的蛋白为CrylBf、CrylJd和Cry9Fa.。按本发明所述，"CrylBf蛋白"指含有SEQIDNo.2氨基財列的、保留杀虫活性的最小蛋白片段的任何蛋白，尤其是含有SEQIDNo.2中第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列的任何蛋白，包括但不限于具有SEQIDNo.2氨基酸序列的完整蛋白。这包括含有该最小毒性蛋白片段的杂合或嵌合蛋白，也包括至少含有SEQIDNo.2毒性片段三个功能结构域中之一的蛋白。此处所用术语"含有序列X的DNA/蛋白"是指至少包括或含有此序列X的DNA或蛋白，从而在5，(或N-末端)和/或3，(或C-末端)末端可包括其它核苦酸或氨基酸序列，如EP0193259公开的可选择性标记蛋白(的核苷酸序列)。按本发明所述，"Cry9Fa蛋白，，或"Cry9F蛋白"是指含有SEQIDNo.6氨基酸序列的、保留杀虫活性的最小蛋白片段的任何蛋白，尤其是含有SEQIDNo.6中第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列的任何蛋白，包括但不限于具有SEQIDNo.6氨基酸序列的完整蛋白。这包括含有该最小毒性蛋白片段的杂合或嵌合蛋白，也包括至少含有SEQIDNo.6毒性片段三个功能结构域中一个的蛋白。按本发明所述，"CrylJd蛋白"是指含有SEQIDNo.4氨基酸序列的、保留杀虫活性的最小蛋白片段的任何蛋白，尤其是含有SEQIDNo.4中第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列的任何蛋白，包括但不限于具有SEQIDNo.4氨基^f列的完整蛋白。这包括含有该最小毒性蛋白片段的杂合或嵌合蛋白，也包括至少含有SEQIDNo.4毒性片段三个功能结构域中一个的蛋白。此处所用术语"crylBfDNA"、"cry9FaDNA"或"crylJdDNA"分别是指编码如上所述的CrylBf、Cry9Fa或CrylJd蛋白的任何DNA序列。这包括编码如上所述的新分离蛋白或其杀虫片段的天然存在的、人工的或合成的DNA序列。此处也包括与所保藏的基因组DNA序列或序列列表中所提供序列的编码区足够相似的、编码杀虫蛋白的DNA序列，从而使它们可以(即有能力)与这些DNA序列在严格杂交条件下进行杂交。此处所用的严格杂交条件具体是指下列条件将相关基因组DNA序列固定在滤膜上，并将该滤膜在42。C、50%曱酰胺、5%SSPE、2xl)enhardt，s试剂和0.1%SDS中预杂交1到2小时，或在68。C、6xSSC、2xDenhardt，s试剂和0.1%SDS中预杂交1到2小时。然后直接向预杂交液中加入变性的标记探针并在上述适当的温度下温育16到24小时。温育之后，于室温在lxSSC、0.1%SDS中洗涤滤膜20分钟，然后于68。C在0.2xSSC和0.1%SDS中洗涤三次，每次20分钟。使用增感屏于-70°C将此滤膜曝光于X-射线胶片(KodakXAR-2或等同物)24到48小时，以进行放射自显影。当然，在此步中可以使用等同的M和参数而仍保持所需的严格杂交条件。这样的等同条件之一包括将相关基因组DNA序列固定在滤膜上，并将该滤膜在42°C、50%甲酰胺、5%SSPE、2xDenhardt，s试剂和0.1%SDS中预杂交1到2小时，或在68。C、6xSSC、2xDenhardt，s试剂和0.1%SDS中预杂交1到2小时。然后直接向预杂交液中加入变性的(地高辛或放射性)标记探针，并在上述适当的温度下温育16到24小时。温育之后，于室温在2xSSC、0.1%SDS中洗涤滤膜30分钟，然后于68。C在0.5xSSC和0.1%SDS中洗涤两次，每次30分钟。使用增感屏于-70。C将此滤膜曝光于X-射线胶片(KodakXAR-2或等同物)24到48小时，以进行放射自显影。此处所用的蛋白的"杀虫活性"是指当用蛋白喂铜昆虫时，该蛋白有杀死昆虫的能力，其中所述蛋白优选通过在重组宿主(如植物)中进行表达。此处所用的蛋白的"昆虫控制量"是指在植物上喂铜昆虫时，足以将昆虫对植物的损害限制在可商业用水平的蛋白量，其例如通过杀死昆虫或通过抑制昆虫的发育或成长从而使它们对植物有较少的损害且对植物产量不产生明显的副作用。按本发明所述，将昆虫控制量、优选杀虫量的本发明的新Cry蛋白与易受该蛋白影响的昆虫接触。此处所用的"Cry蛋白"或"本发明的Cry蛋白"是指按本发明所述所分离的并被鉴定为CrylBf、Cry9Fa或CrylJd蛋白的任何一个新的蛋白。此处所用的Cry蛋白可以是全长蛋白(也叫做原毒素)，或是稍微或完全(如N端和C端截短)截短了的形式，只要其保留了杀虫活性，或者可以是杂合或融合蛋白形式的不同蛋白或蛋白部分的组合物。"Cry原毒素"是指如同由天然存在的BtDNA序列编码的全长晶体蛋白，"Cry毒素，，是指其杀虫片段，尤其指其最小的毒性片段，用SDS-PAGE电泳测定的一般分子量范围为约60到约80kD。此处所用的"cry基因"或"cryDNA"是指编码本发明所述的Cry蛋白的DNA序列，指上述crylBf、cry9Fa和crylJdDNA序列的任何一个。此处所用的Cry蛋白的"最小毒性片段"是指可以通过胰蛋白酶或糜蛋白酶消化溶解了的全长晶体蛋白获得的保留有毒性的片段，或由Cry蛋白的DNA片段编码的毒性蛋白片段。与原毒素相比，该蛋白通常有一个短的N末端和长的C末端截短。虽然对于重组表达来说，开始于或大约开始于原始的第l位氨基酸的毒性片段是本发明所述的优选实施方案，但是我们也应该注意到除了C末端截短以外，一些N末端氨基酸也可以缺失而保留该蛋白的杀虫特点。最小毒性片段的N末端可以以本领域的常规技术，通过胰蛋白酶或糜蛋白酶处理的可溶性晶体蛋白的N末端氨基*列测定方^更地进行测定。编码本发明Cry蛋白的DNA可以以传统方法从1999年11月25日保藏在BCCM-LMBP，保藏号为LMBP3983、LMBP3984、LMBP3985和LMBP3986的大肠杆菌(E.coli)菌林中分离得到。所编码的Cry蛋白可以用来以传统方法制备特异性单克隆或多克隆抗体(HMte等，1988)。其毒素形式可以通过Cry原毒素的蛋白酶(如胰蛋白酶)水解获得。编码该Cry蛋白的DNA序列可以以常规方法从各自菌林中分离得到或者可以基于被编码的氨基酸序列进行合成。通过用限制酶消化分离自Bt菌株的总DNA对编码本发明Cry蛋白的DNA序列进行了鉴定；使DNA片段化，从而产生5到10Kb的DNA片段；将这些片段连入克隆载体；用克隆载体转化大肠杆菌，再用从已知的Bt晶体蛋白基因构建的DNA探针或用基于特异性PCR片段(使用与已知的Bt晶体蛋白基因相对应的引物，由BtDNA产生)的DNA探针筛选克隆载体转化的大肠杆菌。而且，在本发明中使用的DNA序列可以通过合成制得。实际上，由于遗传密码的简并性，一些氨基酸密码子可以用其它的密码子进行替换而不改变该蛋白的氨基^列。此外，一些氨基酸可以用其它的等同氨基酸代替而对该蛋白的杀虫活性没有明显的改变。而且，与那些负责结合和毒性的区域的改变不同，在此分子区内氨基酸序列或组成的改变很少有可能引起该蛋白杀虫活性的差异。该基因的这些等同物包括在严格条件下与Cry毒素或SEQID.No,2、4或6的原毒素的DNA序列杂交并编码与本发明(蛋白)毒素具有相同杀虫特性的蛋白的DNA序列，或者编码与该蛋白毒素形式(如在Schnepf等人、1998中所述的，从N端到保守序列框5以外2个氨基酸处)或与本发明CrylBf、Cry9FA或CrylJd蛋白的原毒素形式具有至少85%、优选90%、最优选95。/。氨基酸序列同一性蛋白的DNA序列，序列同一性测定使用威斯康星GCG软件包的GAP程序(美国威斯康星州麦迪逊，10.0版；在GAP程序中使用GCG的默认值；为进行氨基酸序列比较，使用了blosum62记分模型)。当然，根椐具体目的的不同，可以构建出任何其它的密码子使用不同而编码基本上有着相同杀虫活性的相同蛋白或相似蛋白的DNA序列。这已经在原核和真核表达系统中有述，其中将密码子使用变成在外源宿主中进行基因表达时宿主细胞所偏好的密码子(Bennetzen&Hall，1982;Itakura，1977)。此外，已知Bt晶体蛋白基因对真核密码子没有偏好，并非常富含AT(Adang等，1985，Schnepf等,1985)。密码子使用表可在文献(Wada等，19卯；Murray等，1989)中以及在主要的DNA序列数据库(如德国海德堡的EMBL)中找到。因此，可以构建合成的DNA序列从而产生相同的或基本上相同的蛋白。很明显，一旦知道了本发明Cry蛋白的氨基*列就可以设计出几种不同的DNA序列。这些其它的DNA序列包括合成的或半合成的DNA序列，它们为了使基因中的某些位点失活已经发生了改变，例如在PCT公开WO91/16432和WO93/09218中描述的，选择性地失活存在于天然序列中的某些隐性调节或加工元件，或使总体密码子使用适合更相关宿主生物体的密码子使用，优选可在宿主生物体表达的密码子使用。在构建这些基因时，虽然只要该蛋白的毒性不受到负面的影响就可以对氨基酸进行截短或次要的替换或添加，但是还是应该最大程度的保持所编码的氨基酸序列。通常可以通过PCR介导的突变对DNA序列进行上述的小的修饰(Ho等，1989,White等，1989)。在提到蛋白时的术语"基本上相同，，是指包括有些氨基酸不同或有一些氨基酸添加(如融合蛋白，参见Vaeck等，1987)或缺失(如N端或C端截短)的蛋白，只要该蛋白在其杀虫活性上没有明显的差异就行。此处所用的术语Cry毒素的"功能结构域"是指具有特定结构的、该毒素的任何部分或结构域，其可被转移到另一种(Cry)蛋白上，以产生一种新的、具有本发明Cry毒素至少一种功能特性(如结合和/或毒性特性)的杂合蛋白(Ge等，1991)。这些部分以本发明Cry蛋白的结合和/或毒性特性构成该杂合Bt蛋白的基本特征。这样的杂合蛋白可以有较大的宿主范围，改良的毒性和/或可用于防止昆虫抗性发展的策略中(欧洲专利公开("EP，，)408403;Visser等，1993)。可将由本发明Bt菌抹的总DNA制备的5到10Kb的片段连入适当的表达载体并转化大肠杆菌，然后可以通过常规的菌落免疫探测法(French等，1986)用抗Cry蛋白的单克隆或多克隆抗体筛选表达该毒素的克隆，或通过与DNA探针杂交筛选克隆。而且，可将由本发明Bt菌抹的总DNA制备的5到10Kb的片段或其被克隆和/或亚克隆到大肠杆菌中的片段，连入适当的Bt穿梭载体(Lereclus等，1992)并转化进入晶体缺失的Bt突变体。然后筛选产生晶体(镜检)或晶体蛋白(SDS-PAGE检测)的克隆。编码本发明Cry蛋白的基因可以以常规方法测序(Maxam和Gilbert,1980;Sanger,1977)以得到其DNA序列。序列比较表明这些基因与以前描述的、编码具有抗鳞翅类活性的原毒素和毒素(H6fte和Whiteley，1989;Crickmore等，1998)不同；而且可在h加〃eDunix.biols.susx.ac.uk/Home/NeilCrickmore/Bt/index.html上找到1999年11月15日和2000年10月16日Bt命名网站的升级与Crickmore等(1998)的公开相对应。编码新鉴定的Cry蛋白原毒素形式的有效杀虫区段的这些DNA序列的有效杀虫部分，在对该基因进行序列分析之后，可以按常规方法制得。在这些片段中，优选保留至少到达Bt蛋白保守序列框5的C端末端(Hofte&Whiteley，1989;Schnepf等1998)，优选到达保守序列框5C端2个氨基酸的序列。这些Cry蛋白的氨基*列可由分离的DNA序列得以确定。编码该Cry蛋白的DNA序列的"有效杀虫部分，，，在此也指"截短基因，，或"截短DNA"，是指编码一段多肽的DNA序列，该多肽比Cry蛋白原毒素形式的氨基酸要少但可以杀虫。为了在大肠杆菌中、在其它Bt菌林中或在植物中表达编码本发明Cry蛋白的全长DNA序列或其有效杀虫部分，在该DNA序列两侧可以引入适当的限制酶切位点。这可以使用已知工艺，通过定点突变来进行(Stanssens等，1989;White等，1989)。为在植物中提高表达，可以对本发明cry基因或cry基因的有效杀虫部分的密码子使用进行修饰以形成与PCT公开WO91/16432和衡93/09218;EP0358962和EP0359472等同的、修饰的或人工基因或部分基因；或将Bt基因或部分基因插入叶绿体基因组中并使用叶绿体活性启动子进行表达(如McBride等，1995)。为在单子叶植物例如玉米中获得增强表达，也可以将单子叶内含子加到嵌合基因中，并且可以以翻译中性方式，通过内含子定点插入和/或通过引入密码子使用的改变(例如将密码子使用调整至特定植物的最优密码子使用(Murray等，1989)而不明显改变所编码的氨基酸序列)，进一步改变本发明cry基因或其杀虫部分的DNA序列，以对可能出现在部分基因中的DNA抑制序列进行修饰。此外，本发明Cry蛋白的结合特性可通过本领域已知方法进行评价(VanRie等，1990)，以确定是否本发明的Cry蛋白结合至昆虫的中肠位点，这与由其它已知的Cry蛋白或Bt蛋白所识别的位点不同。在相关易感昆虫中，有着不同结合位点的Bt毒素对于取代已知的、昆虫可能已经对其产生抗性的Bt毒性是非常有价值的，或者对于与具有不同的、防止或延緩昆虫对Bt毒素抗性作用模式的Bt毒素的联合使用是非常有价值的，尤其是在植物中进行表达的时候。由于此新分离得到的Bt毒素的这些特点，使其在改造植物(例如单子叶植物如玉米或水稻及蔬菜如芸苔种植物)以保护这些植物免受昆虫侵害方面十分有用。编码Cry原毒素有效杀虫区段的cry基因的有效杀虫部分或其等同物(优选cry嵌合基因)可以以常规方法稳定插入单一植物细胞的核基因抹。在这点上，可用在根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中的含有cry基因有效杀虫部分的卸曱Ti质粒转化植物细胞，然后使用例如在EP0116718、EP0270822、PCT公开WO84/02913和公开的欧洲专利申请("EP")0242246和在Gould等(1991)中描述的方法，由该转化的植物细胞再生出转化植林。每种优选的Ti质粒载体都在Ti质粒T-DNA的边界序列之间含有cry基因有效杀虫部分，或至少位于其边界序列的左边或右边。当然，也可以用其它类型的载体转化植物细胞，所用转化方法例如使用直接的基因转移(例如在EP0233247中所述)、花粉介导的转化(例如在EP0270356、PCT公开WO85/01856和美国专利4,684,611中所述)、植物RNA病毒介导的转化(例如在EP0067553和美国专利4,407,956中所述)、脂质体介导的转化(例如在美国专利4,536,475中所述)和其它方法例如最近所迷的转化玉米的某些特定品系(Fromm等，19卯；Gordon-Kamm等，1990)和水稻的某些特定品系(Shimamoto等，1989;Datta等，19卯)的方法和最近所述的通常转化单子叶植物的方法(PCTz^开WO92/09696)。所得的转化植林可用于常规的植物育种方法，用于生产更多的具有同样特性的植林或用于将该cry基因有效杀虫部分导入其它相同或相关植物品种中。从转化植林获得的种子含有作为稳定的基因组插入物的cry基因有效杀虫部分。转化植林的细胞可以以常规方法进行培养以生产Cry原毒素(优选Cry毒素)的有效杀虫区段，可以对其进行回收以用于常规的抗鳞翅类杀虫组合物中(美国专利5,254,799)。按本发明所述，本发明的植物或种子可通过例如在一块通常有虫害的地里播种或种植,以获得对昆虫的抗性。因此，按照本发明，通过在一块地里，优选在通常存在或预期存在吃该类植物的害虫(其水平为对植物造成了经济上的损害)出现的地里播种或种植产生本发明Cry蛋白的本发明的种子植物，提供了获得昆虫抗性的方法和获得提高的产量或减少虫害的方法。将cry基因有效杀虫部分，优选截短cry基因，插入植物细胞基因组，使插入的基因位于可指导该基因部分在此植物细胞中进行表达的启动子的下游(即3，)及其控制之下。优选通过在植物细胞基因组中，具体说来就是在核基因组或叶绿体基因组中，插入cry嵌合基因来完成。优选的启动子包括分离物CM1841(Gardner等，1981)、CabbB-S(Franck等，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S组成型强启动子(即"35S启动子")；遍在蛋白家族的启动子(例如Christensen等，1992的玉米遍在蛋白启动子，也可参见Cornejo等，1993),gos2启动子(dePater等，1992)，emu启动子(Last等，19卯)，水稻的肌动蛋白启动子例如Zhang等(1991)描述的启动子；和分别驱动l，和2'基因表达的、T-DNA的TR1'启动子和TR2'启动子(即分别的"TR1启动子"和"TR2启动子")(Velten等，1984)。另外，启动子可以为非组成型的、但其对植物的一种或多种组织或器官(如叶和/或#0具特异性，从而使插入的cry基因部分仅在特定组织或器官的细胞中进行表达。例如，通过将有效杀虫基因部分置于光诱导启动子(例如在美国专利5,254,799中公开的，植林本身的或另一植林例如豌豆的核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子)的控制之下，使该cry基因有效杀虫部分可选择性地在植物(例如玉米、棉花)的叶子中进行表达。再一种选择为使用诱导表达启动子(例如通过温度、愈伤或化学因子诱导)。将cry基因的有效杀虫部分插入植物基因组中，使插入的基因部分处于适合的3'末端转录调节信号(即转录本形成和多聚腺苷酸化信号)的上游。优选通过在植物细胞基因组中插入该cry嵌合基因来进行。优选的多聚腺普酸化和转录本形成信号包括章鱼碱合成酶基因的那些信号(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell,1985)的那些信号,它们在被转化的植物细胞中作为3'非翻译DNA序列存在。可任选地将cry基因有效杀虫部分插入到植物基因組中作为与选择标记基因(例如编码卡那霉素抗性的neo基因(EP0242236))处于同一启动子控制之下的杂合基因(美国专利5,254,799;Vaeck等，1987)，从而使该植物表达融合蛋白。编码抗鳞翅类蛋白的全部cry基因的或部分cry基因也可用来转化其它细菌，例如具有抗鳞翅类或鞘翅类杀虫活性的苏云金芽孢杆菌。因此，可以生产转化的Bt菌林，其在同广谱鳞翅类或鞘翅类昆虫害虫斗争或同其它鳞翅类昆虫害虫斗争方面是十分有用的。用已掺入合适克隆栽体的本发明全部或部分cry基因转化细菌，例如土壤杆菌属、芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌，可以按常规方法进行，优选4吏用如Mahillon等(1989)和PCT专利公开WO90/06999中所述的常规电穿孔技术。含有本发明cry基因的芽孢杆菌转化菌林可通过常规方法(Dulmage，1981;Bernhard和Utz，1993)进行发酵，以提供高产量的细胞。以提供高产量的细胞。在公知的合适条件下(Dulmage，1981)，这些菌林的每一种都形成孢子以产生高产量的含有Cry原毒素的晶体蛋白。杀虫的，尤其是抗鳞翅类的本发明组合物可以使用用cry基因转化的微生物，或优选其各自的Cry蛋白或Cry原毒素、毒素或有效杀虫原毒素区段作为活性成分，与适当的载体、稀释剂、乳化剂和/或分散剂(例如由Bernhard和Utz，1993所描述的)一起以常规方法进行配制。可以将该杀虫组合物制剂为吸湿粉末、丸粒、颗粒或喷粉，或与水性的或非水性的溶剂以泡沫、凝胶、悬液、浓缩物等等制备为液体制剂。本发明所述的控制昆虫，尤其是鳞翅类昆虫的方法可以包括将本发明杀虫量的Cry蛋白或用cry基因转化的宿主细胞应用(例如喷洒)到要保护的地点(区域)。被保护的地点包括，例如昆虫害虫的栖息地或种植蔬茱或长有蔬菜的区域。为获得Cry原毒素或毒素，表达Cry蛋白的重组宿主细胞可以以常规方式在适当的培养基上进行生长，然后使用常^L的方法，例如酶解或去污剂等等裂解之。然后，可以用标准技术例如色谱、萃取、电泳等等，将该原毒素分离并纯化。然后可以通过该原毒素的胰蛋白酶消化获得毒素。下列实施例例证了本发明，而并非是对本发明或保护的目标进行限制。在实施例、权利要求和叙述中所涉及的序列表如下序列表SEQIDNo.1画CrylBf蛋白和DNA的氨基酸序列和DNA序列。SEQIDNo.2-CrylBf蛋白的氨基酸序列。SEQIDNo.3-CrylJd蛋白和DNA的氨基酸序列和DNA序列。SEQIDNo.4-CrylJd蛋白的氨基酸序列。SEQIDNo.5-Cry9Fa蛋白和DNA的氨基酸序列和DNA序列。SEQIDNo.6画Cry9Fa蛋白的氨基酸序列。SEQIDNo.7-引物CrylB.fw的DNA序列。SEQIDNo.8-引物B.R的DNA序列。SEQIDNo.9-引物B.F的DNA序列。SEQIDNo.10-引物JFW的DNA序列。SEQIDNo.11-引物JRV的DNA序列。SEQIDNo.12-引物9FW的DNA序列。SEQIDNo.13-引物9RV的DNA序列。如果在实施例中没有其它的说明，所有制备和操作重组DNA的方法都按照在Sambrook等，分子克隆-实验室手册，第二版(MolecularCloning-ALaboratoryManual,SecondEdition)，冷泉港实验室出版社，纽约(1989)—书和在Ausubel等(1994)现代分子生物学技术，现代技术(CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols),美国的第一巻和笫二巻中所述的标准方法进行。植物分子生物学工作的标准材料和方法在由R.R.D.Croy所著的植物分子生物学Labfax(PlantMolecularBiologyLabfax)(1993)(由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK))—书中有述。PCR技术方法可在M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White编辑的"PCR技术方法与应用指南"("PCRprotocols:aguidetomethodsandapplications")(AcademicPress,Inc.,1990)—书中找到。实施例实施例1:菌林特征由菲律宾iiocos的SantoTomaslaUnion收集的尘土颗粒样品中分离到菌林BtS02072BG。菌林BtS02739C分离自由菲律宾，SouthTagalog的Lucena市收集的尘土颗粒样品中。每个菌林均可在常规标准培养基上进行培养，优选L培养基(胰蛋白胨3g/l、胰蛋白2g/l、酵母抽提物1.5g/l、5mgMnCl2、0.05MNa2HP04'2H20、0.05MNaH2P04H20,pH6.8及1.5%琼脂)，优选在28。C进行培养。为长期保存，优选将等体积的孢晶悬浮物与等体积的50%甘油混合并于-70°<:保存或将孢晶悬浮物冻干。为使孢子形成，优选在T3培养基上28。C生长72小时，然后于4。C保存。由菌林在成孢期间产生的晶体蛋白被包裹成晶体状。实施例2:抗所选鳞翅类昆虫种的BtS02072BG和BtS02739C菌株的杀虫活性在人工喂养的美洲棉铃虫(好Wcww/fl^fl)、烟芽夜蛾(i/Wo幼/s)、玉米螟(0欲,'"/fl聽6,7fl/Zs)、草地夜蛾(S/Woptem/r"^perrfa)和S^fl/m"w0/ifl^WwVfes的初生幼虫上用由BtS02072BG或BtS02739C得到的孢晶混合物(约109孢晶/1111)进行毒性分析。于Costar24孔板按孔分发人工饲料(Vanderzant，1962),以对美洲棉铃虫、烟芽夜蛾和玉米螟进行实验。将50微升孢晶混合物施于饲料表面并在层化气流中干燥。为对美洲棉铃虫、烟芽夜蛾进行实验，在每个孔里放1条幼虫，每个样品用20条幼虫。为对玉米螟进行实验，在每个孔里放2条幼虫，每个样品用24条幼虫。于Costar48孔板按孔分发人工饲料，以对草地夜蛾进行实验。将25微升孢晶混合物施于饲料表面并在层化气流中干燥。在每个孔里放l条幼虫，每个样品用18条幼虫。在第7天计算死亡幼虫和活幼虫。死亡幼虫的百分比如表I所示。表I:晶孢混合物施用于昆虫后死亡幼虫百分比:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例3:新cry基因的特性使用靶向已知的cry基因中保守区的简并引物进行PCR以对BtS02739C基因进行检测。用WizardPCRpreps(Promega)纯化系统对所得的扩增产物进行纯化并将其连入pGEM-T载体(Promega)。将连接混合物以电穿孔法转入大肠杆菌JM101。一次小规厲制备物中至少由40个含有插入片段的转化子组成，并用所选的限制酶进行消化。对所消化的小规模制备DNA进行电泳，然后可以观察到不同的DNA片段类型。对每种类型至少选择一个菌落。制备适当的DNA制备物以对每个所选菌落中质粒的插入片段序列进行测定。所测定的扩增产物序列与公开的cry序列的排列表明菌林BtS02739C含有一个新的crylJ-型基因和新的cry9-型基因。BtS02072BG基因的检测如下。首先，使用菌抹BtS02419J的简并晶体蛋白基因引物进行PCR。使用简并晶体蛋白引物，以所得的扩增产物为模板进行二次PCR。用WizardPCRpreps(Promega)纯化系统对所得的扩增产物进行纯化并将其连入pGEM-T载体(Promega)。将连接产物以电穿孔法转入大肠杆菌XL1Blue。一次小规模制备至少由40个含有插入片段的转化子组成，并用所选的限制酶进行消化。对所消化的小规P漠制备DNA进行电泳，然后可以观察到不同的DNA片段类型。对每种类型至少选择一个菌落。制备适当的DNA制备物以对每个所选菌落中质粒插入片段的序列进行测定。由菌林BtS02419J的克隆扩增产物中，我们发现了一段与crylBel相应片段一致的序列，二者只相差一个核苷酸。然后，选择引物对大量Bt菌林(其中一个是BtS02072BG菌株)中是否存在与已测序的BtS02419J菌林的cry基因片段相似的cry序列进行评测。这些引物序列如下(5'to3'):正向引物crylB.fw:CAGTCCAAACGGGTATAAAC反向引物B.R:CTGCTTCGAAGGTTGCAGTA所测定的扩增产物的序列与公开的cry序列的排列表明菌林BtS02072BG含有一个新的erylB-型基因。实施例4:cry基因的克隆与表达为了从菌林BtS02739C中分离出全长的crylJ-型和cry9-型基因，以及从菌抹BtS02072BG中分离出crylB-型基因，制备了这些菌株的总DNA，并以Sau3A进行部分消化。以蔗糖梯度对所消化的DNA依大小分开，并将5Kb到10Kb片段连入以BamHl消化并以TsAP(温敏碱性磷酸酶)处理过的克隆载体pUC19(Yannisch-Perron等，1985)中。将连接混合物以电穿孔法转入大肠杆菌XL1-Blue或大肠杆菌JM109细胞。将转化子铺于含Xgal和IPTG的LB-triacillin平板上并挑取白色菌落进行滤膜杂交实验。然后用合适的DIG标记探针筛选含栽体的重組大肠杆菌克隆。这些探针按以下方法制得。首先，用来自重组大肠杆菌克隆作为模板细胞(其包含具有特定cry基因片段的质粒)进行PCR，预先使用表II所示的恰当引物进行扩增。表II:用于分离新&DNA序列(Y^C或T，S-G或C)的引物:菌林基因引物扩增片段的长度引物序列2739CcrylJ-型JFW365bpGCAGCTAATGCTACCACATCJTRVGTGGCGGTATGCTGACTAATcry9-型9FW576GYTTTTATTCGCCCGCCACA9RVCGACAGTAGSACCCACTACT2072BGcrylB-型B.F922CAGCGTATTAAGTCGATGGAB.RCTGCTTCGAAGGTTGCAGTA将所得的扩增产物进行凝胶纯化，并以它为模板用DIG标记的dNTP进行二次PCR反应。将适当量的该扩增产物用于杂交反应。用crylJ-型探针和cry9-型探针的混合物进行菌林BtS02739C的菌落杂交。然后将阳性克隆与每个探针分别杂交。菌林BtS02072BG的菌落杂交用crylB-型探针进行。在鉴定出一个含全长cry基因质粒的阳性克隆后，使用染料终止子标记法及PerkinElmerABIPrism-377DNA测序仪对该cry基因两条链的序列进行测定。根据DNA测序的结果对这些基因命名如下BtS02739C的crylJ-型和cry9-型基因被分别命名为crylJd和cry9Fa，BtS02072BG的crylB-型基因被命名为crylBf。所分离的crylJd、cry9Fa和crylBf基因的基因组序列及其编码的蛋白的序列也在本发明序列表中列出。这些序列与已知的CryDNA或蛋白序列的比较表明，这些序列是新的并有相当多的核苷酸和氨基酸与已知的Bt基因及蛋白不同。使用10.0版的WisconsinGCG软件包(美国，威斯康星麦迪逊)的GAP程序确定最相似基因和蛋白编码区(原毒素和毒素两种形式)的序列同一性，表III-V为其概述。在GAP程序中使用GCG的默认值。对核苷酸序列比较而言，使用的是nwsgapdna计分模型，对氨基酸序列比较而言，使用blosum62计分模型。在表III-V中使用的毒素形式是指起始于Sdmepf等(1998)等所定义的保守序列框5的第一个氨基酸并结束于最后一个氨基酸(通常为脯氨酸)后两个氨基酸处的蛋白。原毒素形式是指Bt蛋白/基因的整个蛋白或其編码区。表III:c/y/必/ZCrylBf的序列同一性:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表IV:cry9F"/Cry9Fa的序列同一性:<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>这些新分离基因的基因组克隆已保藏于BCCMTM-LMBP(比利时微生物协调保藏中心分子生物学实验室质粒保藏中心，根特大学K.L.莱德汉克大街35B-9000,根特，比利时(BelgianCoordinatedCollectionsofMicroorganisms-LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie-PIasmidencollectie，UniversityofGent，K.L.Ledeganckstraat35，B-9000Gent,Belgium)),保藏号为LMBP3983-含pUC2739C/lJdl质粒(其中含有crylJd基因)的大肠杆菌JM109,1999年11月25日保藏(该基因可以通过用Xhol和Smal消化该质粒，分离得到约8.4kb的DNA片段)；LMBP3984-含pUC2739C/9Fal质粒(其中含有cry9Fa基因)的大肠杆菌JM109,1999年11月25日保藏(该基因可以通过用Sacl和Pstl消化该质粒，分离得到约8kb的DNA片段)；以及LMBP3986-含pUC2072BG/lBfl质粒(其中含有crylBf基因)的大肠杆菌XLlBlue，1999年11月25日保藏(该基因可以通过用Sacl和Sail消化该质粒，分离得到约7kb的DNA片段)。实施例5:cry基因的杀虫活性将含cry9Fa基因的插入片段亚克隆于适当的穿梭载体中并通过常规方法将所得的质粒pSL2739C/9Fal转入晶体缺陷的Bt菌林中。将由该重组Bt菌林结孢培养物所产生的晶体蛋白在烟芽夜蛾和玉米螟的新生幼虫上以约10"商度/ml的浓度进行检测。对玉米螟幼虫，观察到100%死亡率，而对烟芽夜蛾幼虫，死亡率为72。/。，而用晶体缺陷的对照菌株进行处理以后，幼虫全都存活。将含crylBf基因的插入片段亚克隆于适当的穿梭载体中并通过常规方法将所得的质粒pSL2072BG/lBf转入晶体缺陷的Bt菌林中。将由该重组Bt菌林结孢培养物所产生的晶体蛋白在5^fl附ZawortflgWwVfes、烟芽夜蛾、美洲棉铃虫和玉米螟幼虫上以不同浓度进行检测。在烟芽夜蛾、玉米螟和5^sfl附Zflmm^w》^^幼虫上观察到了CrylBf毒素有相当高的死亡率，而对美洲棉铃虫的毒性较低。用晶体缺陷的对照菌林进行处理以后，幼虫全部存活。将含crylJd基因的插入片段亚克隆于适当的穿梭栽体中并通过常规方法将所得的质粒pGI2739C/lJd转入晶体缺陷的Bt菌林中。将由该重组Bt菌林结孢培养物所产生的晶体蛋白在烟芽夜蛾幼虫上以不同浓度进行检测，观察到了CrylBf毒素明显的致死性。用晶体缺陷的对照菌株进行处理以后，幼虫全部存活。实施例6:在转化植物中生产新的Cry蛋白。使用CaMV35S(Hull和Howell，1987)和遍在蛋白(Christensen等，1992)启动子，按EP0193259和公开的PCT专利申请WO94/12264中所描述的方法制得编码CrylBf、CrylJd和Cry9Fa蛋白截短形式的嵌合基因。如在/>开的PCT专利申请WO94/12264中所述，开放阅读框架的密码子使用与宿主植物的相适应为优选，以使表达效率最佳。用所得的嵌合基因转化水稻、棉花和玉米细胞。如在WO92/09696或美国专利5，641，664中所述(并入本文以作参考)，使用愈伤的和酶降解的胚芽愈伤组织，通过土壤杆菌介导的转化(Ishida等，1996,和美国专利5,591,616)或通过电穿孔法都可以对玉米细胞进行稳定转化。通过土壤杆菌介导的转化(Umbeck等，1987，生物/技术(Bio/Technology)5，263-266;美国专利；5,004,863,并入本文以作参考)可以对玉米细胞进行稳定转化。用公开的PCT专利申请WO92/09696中所描述的方法可对水稻细胞进行稳定转化。通过ELISA、Northern和Southern印迹及杀虫效果选择再生的转化玉米、棉花和水稻植林。与未转化的对照植林相比，含嵌合基因的后代植抹表现出增强的昆虫抵抗力，其具有适当的昆虫抵抗力分离和转化表型。蛋白与RNA测定表明增强的昆虫抵抗力与新Cry蛋白在植株中的较高表达相关。参考文献Adang等(1985)，基因(Gene)36，289。Be腿tzen&Hall，(1982),生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，257，3026-3031。Berhard,K.和Utz，R.，在苏云金芽孢杆菌，一种环境生物杀虫剂理论与实践(Bacillusthuringiensis,AnEnvironmentalBiopesticide:TheoryandPractice)—书中的"实验和商业用途的苏云金芽孢杆菌杀虫剂的生产"("ProductionofBacillusthuringiensisinsecticidesforexperimentalandcommercialuses"),255-267页，Entwistle，P.F.、Cory，J.S.、Bailey,M.J.和Higgs，S.主编，JohnWiley和Sons,纽约(1993)。Christensen等(1992)植物分子生物学(Plantmol.Biol.)18，675-689。Cor—等(1993)植物分子生物学23，567-581。Crickmore等(1998)微生物分子生物学评论(Microbiol.Mol.BiolRev.)62(3)，807-13。DattaS.、PeterhansA.、DattaK.和PotrykusI.,生物"支术8，736-740(19卯)。Dulmage,H.T.，在作物生产中的生物学控制(BiologicalControlinCropProduction)—书中的"用于昆虫的生物学控制的细菌生产"("ProductionofBacteriaforBiologicalControlofInsects"),Paparizas，D.C.主编，OsmunPublishers,Totowa，N.J.，美国，129-141页(1981)。Finney，概率分析(ProbitAnalysis),第三版，剑桥大学出版社(1971)。Franck，Guilley,Jonard，Richards和Hirth，细月包(Cel1)21，285-294(1980)。French,B.T.、Maul，H.N.和Maul，G.G.,生物化学年鉴纪事(Anal.Biochem.)156，417-423(1986)。FrommM.、MorrishF.、ArmstrongC.、WilliamsR.、ThomasJ.和KleinT.，生物/技术8，833-839(1990)。Gardner、Howarth、Hahn、Brown-Luedi、Shepard和Messing,核酸研究(NucleieAcidsResearch)9，2871-2887(1981)。GeA.、RiversD.、MilneR.和DeanD.，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)266,17954-17958(1991)。Gielen,J.、DeBeukeleer，M.、Seurinck,J.、Deboeck，F.、DeGreve，H.、Lemmers，M.、VanMontagu,M.和Schell，欧洲分子生物学杂志(EMBOJ)3,835-845(1984)。Gordon画KammW.、SpencerM.、ManganoM.、AdamsT.、DainesR.、StartW.、O'BrienJ.、ChambersS.、AdamsW.、WilletsN.、RiceT.、MackeyC.、KruegerR.、KauschA.和LemauxP.,植物细胞(ThePlantCell)2，603-618(1990)。Gould,J.、Devey，M.，Hasegawa，0.、Ulian，E.C.、Peterson,G.和Smith,R.H.，植物生理学(PlantPhysiol.)95，426-434(1991)。Ho等(1989)，基因77，51-59。H6fteH.、VanRie,J.、Jansens，S.、VanHoutven，A.、Verbruggen,H.和Vaeck，M.，应用与环境孩t生物学(AppliedandEnvironmentalMicrobiology)54，2010-20171988)。H6fteH.和WhiteleyH.R.，孩t生物学评论(MicrobiologicalReview)53，242-255(1989)。Hull和Howell,病毒学(Virology)86，482-4931987)。Ishida等，1996，自然生物技术(NatureBiotechnology)14,745-750。Itakura等(1977)，科学(Scienc)198,1056-1063。Jansens等(1997)作物科学(CropScience)37,1616-1624。Last等(19卯)，应用遗传学原理(Theor.Appl.Genet.)81，581-588。Lereclus，D.、Vallade，M.、Chaufaux,J.、Arantes，O.和Rambaud，S.,生物/技术10,418(1992)。Mahillon等，欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMSMicrobiol.Letters)60，205-210(1989)。Maxam，A.M.和Gilbert,W.，酶学方法(MethodsinEnzymol.)，65，499-560(1980)。McBride等，1995,生物/技术13，362。Murray,E.、Lotzer，J.和Eberle，M.，核酸研究17(2)，477-498(1989)。Sanger等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，74(12),5463-5467(1977)。Schnepf等(1985)，生物化学杂志(JournalofBiologicalChemistry)260，6264。Schnepf等(1998),微生物分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62(3)，775-806。ShimamotoK.、TeradaR.、IzawaT.和FujimotoH.，自然(Nature)338,274-276(1989)。StanssensP.、OpsomerC.、McKeownY.、KramerW.、ZabeauM.和FritzH.J.，核酸研究12,4441-4454(1989)。Vaeck,M.、Reynaerts，A.、服fte,H.、Jansens，IS.、DeBeuckdeer，M.、I)ean，C.、Zabeau,M.、Vanderzant,经济昆虫学杂志(J.Econ.Entomol.)55,140页(1962)。VanMontagu,M.和Leemans，J.，自然327，33-37(1987)。VanRie等，科学247，72(1990)。Velten，J.、Velten,L.、Hain,R.和Schell,J.，欧洲分子生物学杂志(EMBOJ)3，2723-2730(1984)。Velten，J.和Schell，J.核酸研究13,6981-6998(1985)。Visser，B.、Bosch，D.和Hon6e，G.，在苏云金芽孢杆菌，一种环境生物杀虫剂理论与实眾戋(Bacillusthuringiensis，AnEnvironmentalBiopesticide:TheoryandPractice)—书中的"苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的结构域结构研究遗传学方法，，("Domain-StructureStudiesofBacillusthuringiensisCrystalProteins:AGeneticApproach")，，71-88页,Entwistle，P.F.、Cory,J.S.、Bailey,M.J.和Higgs，S.主编、JohnWiley和Sons,纽约(1993)。Wada等(1990),核酸研究18，2367-1411。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