一种大蒜菌质活素粉的制备方法

专利名称：一种大蒜菌质活素粉的制备方法
技术领域：
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种大蒜菌质活素粉的制备方法。
背景技术：
大蒜(Allium sativum L)为百合科葱属多年生草本植物，又名葫，葫蒜，独蒜等， 原产亚洲西部，世界各地均有栽培。从古至今，埃及、中国、日本等就有用大蒜治疗多种疾病 的经验。明代《本草纲目》记载，大蒜有散痛肿、除风邪、杀毒气、去风湿、疗毒癣、健脾胃、止 霍乱、解瘟疫等功效，可治疗数十种疾病。大蒜所含化学成分十分复杂，含有挥发油、多种氨 基酸、维生素、糖及丰富的蛋白质，并含有多种矿物质及微量元素。研究证明大蒜具有卓越 的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、提高机体免疫功能、降糖、解毒等功效。大蒜多方面的药理作用源于它含有丰富的化学成分。其主要成分包括糖类、氨基 酸类、脂质类、维生素、无机盐和微量元素、含硫化合物等。大蒜的主要成分为大蒜辣素(Allicin)，即狭义上所讲的蒜素，其性质极不稳定， 在室温条件下放置两天，不活动性稠液遇碱便失效，加热很易被破坏；另一种成分为大蒜新 素，其化学性质比较稳定。大蒜辣素和大蒜新素等含硫化合物总称为大蒜素或大蒜精油。天然大蒜素是大蒜破碎后，在蒜氨酸酶(alliinase，EC4. 4. 1.4)的催化作用下 裂解生成。Gleitz J等认为在新鲜的大蒜中，没有游离的大蒜素，只有它的前体物质—— 蒜氨酸(alliin)，约占大蒜总鲜重的0. 25% ；蒜氨酸以稳定无臭的形式存在于大蒜中，当 大蒜加工或受到物理机械破碎后，蒜氨酸酶就会和蒜氨酸相遇，在磷酸吡哆醛(Pyridoxia Phoshate)辅酶参与下发生反应，生成具有强烈辛辣味的挥发性物质一大蒜素。大蒜素不稳 定，遇光、热或有机溶剂会降解成各种含硫有机物，形成大蒜的特殊气味。大蒜素的分解有 几种途径，其一是蒜素自我分解成两种异构环化合物，无酶的情况下降解形成单硫、二硫、 三硫及硫氧化物，热分解形成烯丙基次磺酸和烯丙基硫醚。后者常温下发生Diels-Alder 反应聚合成二硫杂一环己烯化合物。在大蒜素形成过程中，蒜氨酸和蒜氨酸酶起着重要作 用。大量研究表明，天然大蒜素有独特的药理活性。Miron T报道大蒜素容易透过磷脂 膜和血红细胞膜进入细胞内，从而与一些截留巯基化合物(如谷胱苷肽、2-氮-5-羟基苯 甲酸酯)相互作用，达到其药用价值。Hyim J K也报道了天然大蒜素的生理学活性抗肿 瘤、降低胆固醇、抗血小板聚集、保肝、预防心血管疾病、降血压和血脂、抗衰老及记忆力下 降、抗微生物活性(如革兰氏阴性和阳性细菌及真菌)。Nagourney R A和Singh S S等再 也实了天然大蒜素的以上药理活性。当前，饲料工业中使用市场供应的大蒜素，一般系由人工合成的大蒜油为原料制 成的预混料(指大蒜油吸附在一定的载体上形成的预混料)，呈白色流动性的细小粉末。而 天然大蒜油存在于大蒜中，需经过提取才能得到。人工合成的大蒜油其一缺少天然大蒜中 许多生物活性物质的作用；其二，大蒜油在合成生产过程中的得率为85% 92%，其余部 分为氯丙烯；由于氯丙稀的残留，使产品有过于刺激的气味。氯丙烯为强刺激性无色液体，易致癌，该物质对皮肤、黏膜、呼吸道有强烈的刺激性；长期接触可能对中枢神经系统、肾、 肺造成损害，可导致四肢麻木和残废；制成饲料也常常会引起畜禽拒食现象；其三，每合成 一吨大蒜素制剂，同时产出大量废水，存在严重排放污染环境等问题…。天然植物源大蒜素是近年发展起来的一种多功能、高效中草药绿色添加剂。大量 研究表明天然大蒜素的作用广泛、效果显著、无残留、无抗药性，不产生致畸、致癌、致突变 性，对提高动物采食量、促进生长、改善动物产品肉质和风味及预防疾病等方面有良好的应 用效果。天然植物源大蒜素具有以下方面的作用1、防止饲料霉变天然大蒜素可破坏霉菌的巯基酶，阻止霉菌的新陈代谢。因而能有效地杀灭黄曲 霉、黑曲霉、烟曲霉等霉菌，有明显的防霉作用。将大蒜素拌于料中，可防止饲料霉变。同 时，它所含的挥发性含硫化合物，能散发出特殊的气味，能驱赶蝇、螨、蚊、虫，防止饲料虫蚀 和变质。2、诱食、提高采食量天然大蒜素的特殊香味对多数动物有强烈的吸引作用，尤其是鱼类和禽类。因此 可作为诱食剂，吸引动物采食。浓烈的蒜香味还能有效地掩盖饲料中菜籽粕、肉骨粉等一些 原料的不良气味以提高饲料的适口性，增进动物的采食。天然大蒜素能显著增加动物胃液 分泌，增强胃肠蠕动，刺激动物食欲，提高动物采食量。3、杀菌防病作用大蒜素中的二硫醚和三硫醚化合物能够透过致病菌的细胞膜而进入细胞质中，使 细菌缺乏半胱氨酸不能进行生物氧化作用，从而破坏致病菌的正常新陈代谢，而且还能使 细菌巯基失活而抑制细菌的生长繁殖。大蒜素对引起畜牧疾病的大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓 杆菌等均有良好的抑制和杀灭作用，对大肠杆菌、葡萄球菌和沙门氏菌的最小抑制浓度分 别为80mg/kg、80mg/kg和40mg/kg。大蒜素还能有效杀灭荧光极毛杆菌、鱼害粘球菌、鳗弧 菌、气单泡菌、鲁耶尔森氏菌等，是目前畜牧病防治的较好药物之一。因此，天然大蒜素可替 代日粮中的抗生素，抵抗动物疾病，提高成活率。4、促生长、提高饲料利用率大量研究表明，天然大蒜素能够增加动物的采食量，防治动物多种疾病(包括肿 瘤)，提高动物的免疫能力，改善动物各系统组织的功能，促进动物肠胃的蠕动，同时调节动 物体内各种酶的分泌，从而提高饲料利用率和动物增重，降低料肉比。5、改善畜禽产 品品质天然大蒜素中的硫醚化合物含有C3H5-S(O)-基团，可以增强鸡肉、鸡蛋中的香味 成份，使鸡蛋、鸡肉更鲜。据研究报道，鸡肉香味成份主要是靠C3H5-S(O)-基团。黄玉德等 试验表明，采食大蒜素的奶牛所产的奶中含有一定量的三硫醚和二硫醚，能抑制大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌等有害菌的生长，而对有益菌如干酪乳杆菌有促进作用，所 产的奶保质期长，味道更鲜。植物源大蒜素是一种安全、高效的生物活性物质，具有较强抑制致病菌，提高免疫 力，促进生长代谢的显著作用。目前该类产品主要作为食品添加剂应用，成本高、价格贵，无 法大规模应用于饲料业，而国内外尚没有饲料级植物源大蒜素工厂规模化生产的工艺与产品。反刍动物瘤胃正常菌群主要是一类厌氧性细菌，也是宿主动物重要的优质微生物 蛋白源，同时还含有多糖、核酸以及丰富的生物活性物质，通过皱胃盐酸灭活后进入小肠， 经消化分解后将以可吸收形式的多种养份被畜体代谢利用。有益菌代谢产物一菌质具有 安全、高效的生物活性物质，可作为高品质的功能性饲料添加剂，同时也可利用菌质中特定 的活性物质转化制备其它多种功能性饲料添加剂。目前国内外尚没有利用特定瘤胃细菌菌 质以及菌质中的相应活性物质、富氧高效转化植物源大蒜素的工艺及产品。

发明内容
本发明的目的是提供一种大蒜菌质活素粉工厂规模化生产的制备方法，该方法通 过在山羊瘤胃驯化、培育、分离出较好适应大蒜性状，其菌质有助于提高蒜氨酸酶活性的菌 种源；再经体外分离、驯化、培育适合人工瘤胃环境的瘤胃菌种群，同时添加复合蒜氨酸酶 激活剂制备特定菌质，与大蒜泥混合进行富氧氧化反应高效转化大蒜活素制得产品。本发明所采用的技术方案是一种大蒜菌质活素粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)用大蒜氧化物驯化、培育山羊瘤胃特定菌群；(2)采集瘤胃液进行体外分离、驯化、培育得到特定菌种群；(3)将特定菌种群添加基础大蒜泥进行体外厌氧驯化、培育，同时添加复合蒜氨酸 酶激活剂(VB6+Fe2+)，得到特定菌质液；(4)将特定菌质液与大蒜泥混合，在富氧等条件下氧化反应2士0. 2h，反应终点产 物经温敏干燥、粉碎制成大蒜菌质活素粉。上述方法中步骤(1)具体可以是每只羊饲喂体重1.2%的配合精料和经氧化 25士3min的大蒜泥，分早晚两次分别从瘤胃瘘管投喂，自由采食青干草，自由饮水，驯化 25士3 天。上述方法中，步骤(2)具体是采集瘤胃液，经尼龙绢过滤，过滤后瘤胃液与预热 的等体积人工培养液混合加入分液漏斗中，置于39士0. 5°C水浴锅内，立即充入CO2以保证 厌氧环境，温育2士0. 2h后，将分液漏斗下层析出的纤毛虫排除，上层的饲料残渣吸出，中 间部分即为特定菌种群分离液。上述方法中步骤(3)所说的厌氧驯化培育发酵条件具体是将步骤(2)的菌种 群分离液接种到等体积新鲜人工培养液中，每IOOOml人工培养混合菌液中添加营养 底物40士2g，其组成与山羊瘤胃特定菌群活体驯化使用的日粮配合精料一致；基础蒜泥 10士 Ig ；添加的复合蒜氨酸酶激活剂组成与剂量分别为VB660士5mg/L，Fe2+30士5mmol/L ； 在 39. 0士0. 3°C, 2. 66士 1. 33Kpa，ρΗ6· 3士0· 3，培养液稀释率 3士0. 2% /h,当培养料液容 量达一定水平，自动打开溢液阀排空，维持发酵液总量的稳定，培养物料搅拌lmin，静息 14min，适当充入C02、N2的条件下厌氧发酵10士0. 5小时。上述方法中步骤⑷具体是利用在步骤(3)所得发酵特定菌质与经搅碎工 艺所得大蒜泥混合进行富氧氧化反应，相关条件分别为菌质与大蒜泥的液固重量比 1.5 1.0，pH6. 4士0.3，温度30士0.3°C下，采用气动搅拌方式实行充分的富氧反应，其反 应时间2士0. 2h，反应终点物料在75°C以下进行温敏干燥、粉碎、质检、包装制备产品。
在实际生产中，因连续生产的需要，可将经步骤(3)得到的菌质(发酵混合液)取 出部分(如50%)发酵混合液作为工作菌液与大蒜泥混合，进行富氧氧化反应，高效转化大 蒜活素；其余的发酵混合液保留作为菌种液继续进行发酵培养。本发明中所说的人工培养液每IOOOml的组成为常量元素237ml ；微量元素 0. 12ml ；缓冲液237ml ；还原剂49. 5ml ；蔗糖5g ；加蒸馏水至IOOOml ；其中各成分按下列配比配制还原剂lmol/LNaOH溶液 4ml ；Na2S · 7H20 570mg ；加蒸馏水至 IOOml ；常量元素=Na2HPO45. 70g ；NaH2PO4 6. 20g ；MgSO4 · 7H20 0. 60g ；加蒸馏水至 IOOOml ；微量元素=CaCl2· 2H20 13. 20g ；MnCl2 · 4H20 10. OOg ；CoCl2 · 6H20 1. OOg ； FeCl3 · 6H20 0. 8g ；加蒸馏水至 IOOml ；缓冲液=NaHCO335. OOg ；NH4HCO3 4. OOg ；加蒸馏水至 1000ml。通过本发明方法制备得到的大蒜菌质活素粉，经检测，产品主要相关指标检测方 法和结果分别为(1)大蒜素分别采用高效液相色谱法、定硫法、光电比色法三种方法进行 了检测比较，认为光电比色法较为合适，主要检测大蒜中总硫代亚磺酸酯含量，大蒜 素含量约占总硫代亚磺酸酯的70%，结果表明，大蒜菌质活素粉中硫代亚磺酸酯含量 1.775士0. 055mmol/100go(2)水溶性蛋白该指标用于控制发酵终点，采用Lowry法检测，结果表明，大蒜菌 质活素粉中水溶性蛋白的含量9. 367士0. 067g/100g。(3)本研究采用分子生物学技术，用16SrDNA恒定区序列设计引物，结合PCR技术， 扩增16SrDNA序列，再利用可变区序列的差异来进行分类鉴定GBS制备中的体外特定培育 瘤胃菌群。从基因水平对瘤胃菌群进行分析鉴定，具有非常好的准确性和可靠性，有效避免 了形态学特征观察的局限性和误差性。根据细菌基因序列特征进行的菌群分子生物学技术鉴定结果，经BLAST比对分 析，其瘤胃菌群结构组成与功能特点分别为(1)韦荣球菌属，属于乳酸利用菌；(2)小韦 荣球菌，属于乳酸利用菌；(3)普氏菌属，属于淀粉降解菌、半纤维素降解菌和蛋白降解菌； (4)普氏菌科，属于淀粉降解菌、半纤维素降解菌和蛋白降解菌；(5)布氏普氏菌，属于淀粉 降解菌、半纤维素降解菌和蛋白降解细菌；(6)乳酸菌，属于乳酸产生菌；(7) 丁酸弧菌属， 属于纤维降解菌、淀粉降解菌、半纤维素降解菌和蛋白降解菌；(8)牛瘤胃细菌，分类不详； (9)小牛乳酸杆菌，属于乳酸产生菌；(10)未命名瘤胃细菌，分类不详；(11)酵母菌，属于真 菌。本发明进行活体驯化的特定瘤胃菌群是反刍动物赖以生存的体内微生态环境中 至关重要的微生物，具有极高的营养学价值和重大的代谢调控作用，可为体外特定菌群工 厂化规模发酵生产提供安全、优质的菌种源和菌质，为天然大蒜素的高效转化提供重要的 辅酶和酶激活物以及多种生物活性物质，为大蒜菌质活素粉的生产提供重要的理论依据和 应用指导，为畜禽生产提供安全高效，促生长代谢的功能性饲料添加剂，这具有重要的仿生 学源头创新特点，为功能性饲料添加剂的研究和应用提供一条新的思路，从而具有显著的 经济学价值和积极的社会学效益。


图1是本发明方法的工艺流程2是三硫二丙烯标准品色谱3是本发明方法制备的大蒜菌质活素粉产品三硫二丙烯含量色谱图
具体实施例方式实施例11.添加基础大蒜氧化物进行特定瘤胃菌群活体驯化、分离、培育采集菌种源
选用4头健康去势的地方成年山羊，平均体重23. 88 士 1. 28kg，术前禁食24h，手术
安装永久性瘤胃瘘管。山羊日粮精料组成(见表3)表1山羊日粮精料配方 2.每只羊饲喂体重1. 2%的配合精料和经氧化25士3min的大蒜泥，分早晚两次分 别从瘤胃瘘管投喂，自由采食青干草，自由饮水，驯化25 士 3天。喂料6h后利用自制采样器 经瘤胃瘘管采集瘤胃液，经100目尼龙绢过滤备用。3.经尼龙绢过滤后的瘤胃液与预热的等体积人工培养液混合加入分液漏斗中，置 于39士0.5°C水浴锅内，立即充入CO2以保证厌氧环境，温育2士0. 2h后，将分液漏斗下层析 出的纤毛虫排除，上层的饲料残渣吸出，中间部分即为特定菌种群分离液。4.每IOOOml的人工培养液组成为常量元素237ml ；微量元素0. 12ml ；缓冲液 237ml ；还原剂49. 5ml ；蔗糖5g ；加蒸馏水至IOOOml ；其中各成分按下列配比配制还原剂lmol/LNaOH溶液 4ml ；Na2S · 7H20 570mg ；加蒸馏水至 IOOml ；常量元素=Na2HPO45. 70g ；NaH2PO4 6. 20g ；MgSO4 · 7H20 0. 60g ；加蒸馏水至 IOOOml ；微量元素=CaCl2· 2H20 13. 20g ；MnCl2 · 4H20 10. OOg ；CoCl2 · 6H20 1. OOg ； FeCl3 · 6H20 0. 8g ；加蒸馏水至 IOOml ；缓冲液=NaHCO335. OOg ；NH4HCO3 4. OOg ；加蒸馏水至 1000ml。5.智能仿生瘤胃发酵器厌氧驯化培育特定菌群的发酵条件是将特定瘤胃菌种群分离液与等体积新鲜人工培养液混合，每IOOOml人工培养混 合菌液中添加营养底物40士2g，其组成与山羊瘤胃特定菌群活体驯化使用的日粮配合精料一致；基础蒜泥10士 Ig ；添加的复合蒜氨酸酶激活剂组成与剂量分别为VB660士5mg/L， Fe2+30士5mmol/L ；在 39. 0士0. 3°C, 2. 66士 1. 33Kpa, ρΗ6· 3士0. 3，培养液稀释率 3士0. 2% / h，当培养料液容量达一定水平，自动打开溢液阀排空，维持发酵液总量的稳定，培养物料搅 拌lmin，静息14min，适当充入C02、N2的条件下厌氧发酵10士0. 5小时。取出50%发酵混 合液作为工作菌液与大蒜泥混合，进行富氧氧化反应，高效转化大蒜活素；保留50%发酵 混合液作为菌种液继续进行发酵培养。6、将发酵特定菌质与经搅碎工艺所得大蒜泥混合进行富氧氧化反应，相关条件分 别为菌质与大蒜泥的液固重量比1.5 1.0,pH 6. 4士0.3，温度30士0.3°C下，采用气动搅 拌方式实行充分的富氧反应，其反应时间2士0. 2h，反应终点物料在75。C以下进行温敏干 燥、粉碎、质检、包装制备产品。实施例2经体外分离、驯化、培育适合人工瘤胃环境的瘤胃菌群，制备菌质利用体内驯化后的瘤胃有益菌群进行体外分离、驯化、参照Russell的配方改进 的人工培养液培育，在仿生学的以及添加基础大蒜泥量研究基础上初步制定发酵条件为， 温度39.0士0.5°C (微电脑温度控制仪控制)，压力2.66士1.33恥￡1(压力自动调节阀控 制)，稀释率3士0. 2% /h (培养液缓慢滴定)，当培养料液容量达一定水平，自动打开溢液阀 排空，维持发酵液总量的稳定，气搅Imin静息14min (微电脑定时器结合气泵工作)，pH稳 定在合适范围(碱液缓冲滴定)，研究菌群动态代谢变化规律，为规模化菌群人工发酵生产 提供最佳发酵工艺参数，后期研究提供优质菌种源。(本发明中推荐使用智能仿生瘤胃发酵 器进行体外培养，智能仿生瘤胃发酵器及使用方法或参见中国专利申请200910026844. 2)1材料与方法1. 1添加基础大蒜氧化物进行特定瘤胃菌群活体驯化、分离、培育采集菌种源的研 究1. 1. 1山羊瘤胃瘘管手术安装选用4头健康去势的地方成年山羊，平均体重23. 88 士 1. 28kg，术前禁食24h，手术 安装永久性瘤胃瘘管。1 · 1 · 2山羊日粮精料组成(见表3)表2山羊日粮精料配方 1.1.3试验设计每只羊每天饲喂体重1. 2%的配合精料和经20min氧化的大蒜泥，分6 00，18:00 两次分别从瘤胃瘘管投喂，自由采食青干草，自由饮水，15天过渡期。1.1. 4样品的采集喂料6h后利用自制采样器经瘤胃瘘管采集瘤胃液，经100目尼龙绢过滤备用。
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1. 1. 5人工培养液(人工唾液)组成参照Russell的配方[i]加以改进。还原剂(现用现配)=Imol/LNaOH溶液 4ml ；Na2S · 7H20 570mg ；加蒸馏水至IOOml ；常量元素=Na2HPO45. 70g ；NaH2PO4 6. 20g ；MgSO4 · 7H20 0. 60g ；加蒸馏水至IOOOml ；微量元素CaCl2· 2H20 13. 20g ；MnCl2 · 4H20 10. OOg ；CoCl2 · 6H20 1. OOg ； FeCl3 · 6H20 0. 8g ；加蒸馏水至IOOml ；缓冲液=NaHCO335. OOg ；NH4HCO3 4. OOg ；加蒸馏水至 IOOOml ；培养液配置常量元素237ml ；微量元素0. 12ml ；缓冲液237ml ；还原剂49. 5ml ；蔗 糖5g ；加蒸馏水至1000ml。1. 1.6培养底物1. 1. 6. 1营养底物(山羊日粮精料)培养菌液中添加量为40g/L。1. 1. 6. 2基础大蒜泥添加量待定。1. 1.7试验方法经尼龙绢过滤后的瘤胃液与预热的等体积人工培养液混合加入分液漏斗中，置于 39士0.3°C水浴锅内，立即充入CO2以保证厌氧环境，温育2士0. 2h后，将分液漏斗下层析出 的纤毛虫排除，上层的饲料残渣吸出，中间部分即为特定菌种群分离液。取150ml锥形瓶5个，分别加入预热人工培养液及特定菌群分离液各50ml，盖上橡 胶塞，39士0. 3°C水浴锅内培养，持续充入C02。每IOOml培养菌液添加大蒜泥量分为4组 即Ig大蒜泥组、2g大蒜泥组、3g大蒜泥组和4g大蒜泥组，对照组不加大蒜泥。pH值低于 6. 00时用碱液调至6. 00，每Ih调一次。试验重复三次。1. 1.8测定指标1. 1.8. 1瘤胃液pH值pHS-3C型pH计即时读数。1. 1. 8. 2微生物总脱氢酶活性(TDHA)测定取发酵液2ml，加入0. 2ml 1. 5%的氯化三苯基四氮唑(TTC)。(对照管加入0. 2ml 蒸馏水)通入CO2后在39°C恒温振荡水浴锅中培养lOmin，吸出Iml放入另一试管中，立即 加入50 %异丙醇5ml终止反应，混合后以4000rpm离心lOmin，取上清液在485nm处测定OD值。总脱氢酶活力单位以39°C，pH6. 8的条件下，每分钟引起测定液在485nm处OD值 上升0.1为1个酶活力单位。1. 1.8. 3数据处理所有试验数据均以Excel软件建立数据库，采用SPSS15. O统 计软件中One-WayANOVA检验组间差异的显著性，采用LSD法进行多重复合比较，结果均以 χ 士 SE表不。1. 2特定瘤胃菌群人工体外驯化培育代谢规律的研究1.2. 1培养底物1. 2. 1. 1营养底物(山羊日粮精料):培养菌液中添加量为40g/L。1. 2. 1. 2基础大蒜泥添加量10g/L。1.2. 2 HMilJRWM^t (Pneumatic stirring bionic ruman system,PSBRS)厌氧发酵条件将特定瘤胃菌种群分离液与等体积新鲜人工培养液混合，每IOOOml人工培养混 合菌液中添加营养底物40士2g，其组成与山羊瘤胃特定菌群活体驯化使用的日粮配合精 料一致；基础蒜泥10士 Ig ；添加的复合蒜氨酸酶激活剂组成与剂量分别为VB660士5mg/L， Fe2+30士5mmol/L ；在 39. 0士0. 3°C, 2. 66士 1. 33Kpa, ρΗ6· 3士0. 3，培养液稀释率 3士0. 2% / h，当培养料液容量达一定水平，自动打开溢液阀排空，维持发酵液总量的稳定，培养物料搅 拌lmin，静息14min，适当充入C02、N2的条件下厌氧发酵10士0. 5小时。取出50%发酵混 合液作为工作菌液与大蒜泥混合，进行富氧氧化反应，高效转化大蒜活素；保留50%发酵 混合液作为菌种液继续进行发酵培养。1. 2. 3生物反应器发酵状况监测与样品采集每Ih抽取发酵液样品，动态测定pH、总脱氢酶活力，剩余样品置-20°C冰箱保存待 测。培育33h。1.2. 4发酵指标的测定1.2.4. 1瘤胃液pH值pHS-3C型pH计即时读数。1.2. 4.. 2微生物总脱氢酶活性(TDHA)1. 2. 5数据处理所有试验数据均以Excel软件建立数据库，采用SPSS15. 0统计软 件中One-WayANOVA检验组间差异的显著性，采用LSD法进行多重复合比较，结果均以χ士SE表不。2结果与分析2. 1特定瘤胃菌群驯化、分离、培育添加基础大蒜泥量的研究表3不同剂量大蒜泥对瘤胃液pH值的影响 注VS对照组 *Ρ < 0. 01，* P < 0. 05 ;VS Ig 大蒜泥组☆ P < 0. 01，★ P < 0. 05 ；VS 2g大蒜泥组ΔΡ<0. 01，AP<0. 05 ;VS 3g大蒜泥组< 0. 01，γΡ < 0. 05。表4不同剂量大蒜泥对瘤胃液TDHA的影响单位U/ml 注VS对照组 *P < 0. 01，* P < 0. 05 ;VS Ig 大蒜泥组☆ P < 0. 01，★ P < 0. 05 ；VS 2g大蒜泥组ΔΡ<0. 01，AP<0. 05 ;VS 3g大蒜泥组VP < 0. 01，γΡ < 0. 05。表4表明对照组、Ig大蒜泥组、2g大蒜泥组、3g大蒜泥组和4g大蒜泥组pH变化 范围分别为 5. 95士0. 035 6. 49士0. 015,5. 70士0. 029 6. 44士0. 012,5. 70士0. 032 6. 44士0. 009,5. 83士0. 029 6. 48士0. 023 和 5. 91 士0. 029 6. 51 士0. 033 ；pH 平均值分 别为 6. 11 士0. 042,5. 99士0. 049,6. 01 士0. 048,6. 08士0. 043 和 6. 12士0. 042。随着发酵的 进行，PH都随着降低，各组间差异均不显著(P > 0. 05)。表5表明对照组、Ig大蒜泥组、2g大蒜泥组、3g大蒜泥组和4g大蒜泥 组 TDHA 变化范围分另Ij 为 0. 047 士 0. 077 0. 433 士 0. 018U/ml、0. 349 士 0. 028 0. 448 士 0. 021U/ml、0. 201 士 0. 028 0. 446 士 0. 013U/ml、0. 084 士 0. 023 0. 413 士 0. 027U/ ml 禾口 0. 023 士 0. 015 0. 426 士 0. 016U/ml ；TDHA 平均值分另Ij 为 0. 378 士 0. 015U/ml、 0.399士0.013U/ml、0. 324士0. 018U/ml、0. 235士0. 025U/ml 禾Π 0.196士0. 029U/ml,Ig 大蒜 泥组最高，4g大蒜泥组最低，TDHA随着大蒜泥添加量的增大呈递减趋势。与对照组相比，3g 大蒜泥组和4g大蒜泥组TDHA均较低，差异均极显著(P <0.01)；与Ig大蒜泥组相比，2g 大蒜泥组TDHA较低，差异显著(P < 0. 05)，3g大蒜泥组和4g大蒜泥组TDHA均较低，差异 均极显著(P < 0. 01)；与2g大蒜泥组相比，3g大蒜泥组和4g大蒜泥组TDHA均较低，差异 均极显著(P < 0. 01)。由此确定Ig大蒜泥组TDHA最好，因此基础大蒜泥添加量为lg/100ml，即10g/L。2. 2特定瘤胃菌群人工体外驯化培育代谢规律的研究菌液发酵培养33小时作为一培育周期，基础碱液缓冲，以减小PH值的变化范围， 每一周期结束后取部分菌种液_20°C保存，提取1500ml菌种液，再加入1500ml新鲜预热培 养液进行培养。重复培养3次。表5菌群体外驯化培育各项指标的动态变化 注pH VS 第一批 *P < 0. 01，* P< 0. 05 ；VS 第二.批^P < 0.01,*]3 < 0. 05。
TDHA VS第一批/ΔΡ< 0. ΟΙ,ΑP < 0. 05 ；VS 第二批VP < 0. 01,TP < 0. 05。
表6表明三批菌液培育pH值变化范围分别为6.02 7. 01、5. 76 6. 67和 5. 46 6. 84，平均值分别为6. 35士0. 046,6. 08士0. 046和6. 01 士0. 049。由于第一批菌液 来源为冷冻保存液，解冻后菌群活性不强，发酵强度较弱，故PH值水平较高；第二批、第三 批都是持续发酵，菌液直接来自上一批培养菌液，开始菌群活性高，发酵强度较强，故PH值 水平较低。与第一批相比，第二批和第三批PH均较低，差异均极显著(P < 0. 01)。表6表明三批菌液培育TDHA变化范围分别为0. 003 0. 341U/ml、0. 093 0. 376U/ml 和 0. 205 0. 483U/ml,平均值分别为 0. 183士0. 017U/ml、0. 248士0. 012U/ml 和0. 290士0. 008U/ml。由于第一批菌液来源为冷冻保存液，解冻后细菌活性不强，故起始 TDHA较低，随着菌群逐渐复苏，TDHA随之升高；第二批、第三批都是持续发酵，菌群活性较 高，故TDHA维持在较高水平。与第一批相比，第二批和第三批TDHA均较高，差异均极显著 (P < 0.01)；与第二批相比，第三批TDHA较高，差异显著(P < 0.05)。表6菌群体外驯化培育三次循环各项指标平均值的动态变化 表7表明从发酵起始点至发酵16h，pH持续降低，之后有所回升并趋于稳定；从 发酵起始点至发酵9h，TDHA持续升高，表明瘤胃细菌发酵逐渐增强，此时瘤胃细菌活性最 强，此后TDHA维持在相对较高水平并相对稳定在一定的范围。而MCP的合成及细菌数量要 滞后TDHA Ih达到峰值，且为了提高瘤胃细菌工厂化培育效率，故将瘤胃细菌的最佳培育 时间设定为10h。菌液驯化培育过程中加入一定基础量的大蒜泥能够有效地抑制有害菌的繁殖，使 与其相适应的特定瘤胃菌群生长繁殖，从而确保发酵的安全性和有效性，使与其相适应的 瘤胃菌群能高度地纯化。本试验结果表明，添加基础大蒜泥剂量为10g/L。在确保发酵安全性的同时，维持 瘤胃菌群较高的活性，使其进一步驯化培育。3. 2pH值对瘤胃菌群发酵的影响
瘤胃液pH值是一项反映瘤胃发酵指状态的一项重要指标，它受日粮性质、唾液分 泌、瘤胃内挥发性脂肪酸及其它有机酸的生成、吸收和排空的影响。ChUrch(1976)报道，在 体内瘤胃PH值主要受唾液分泌量与有机酸产生量的影响。瘤胃液pH值的相对稳定是由于 唾液中碳酸氢盐与发酵生成的VFA相互作用的结果，瘤胃液pH的正常变化范围是5. 5 7. 5，低于或高于这个范围都会影响底物中各种营养物质的降解效率。体外发酵pH值也是一项反映菌群发酵状态的一项重要指标。本试验过程中通过 不断滴加培养液、加入碱液以及排出多余的发酵液使PH值相对稳定，有利于增强各种酶类 的活性，提高营养物质的降解效率和菌群的活性。3. 3瘤胃液TDHA的变化规律菌液中酶的活力与瘤胃微生物的数量和代谢之间有密切关系。总脱氢酶是参与蛋 白质合成与分解的重要酶类。在瘤胃微生物中发现的脱氢酶类主要有以NAD+或NADP+为辅 基的谷氨酸脱氢酶(GDH)和乳酸脱氢酶(LDH)，其中NAD+-GDH很可能是瘤胃微生物利用氨 合成蛋白质的最重要的酶(Chalupa等，1968)。因此，总脱氢酶既反映了微生物发酵时脱氢 酶传递氢的能力，又反映了微生物合成蛋白质的能力。本试验中总脱氢酶的活性在严密监 控下，维持在较高水平，表明菌群的活性较强。3. 4瘤胃菌群代谢规律通过严密调控pH、温度、压力、稀释率、厌氧、气体搅拌等条件进行瘤胃菌群动态性 代谢变化规律的研究，结果表明从发酵起始点至发酵16h，pH持续降低，虽然基础碱液的 滴加减慢PH降低的速度，但由于瘤胃菌群发酵强度较高，活性较强，所以呈持续降低趋势， 之后由于发酵强度降低有所PH回升并趋于稳定；从发酵起始点至发酵9h，TDHA持续升高， 表明瘤胃细菌发酵逐渐增强，此时瘤胃细菌活性最强，此后随着培养液的滴加，发酵趋于稳 定，TDHA维持在相对较高水平并相对稳定在一定的范围。而MCP的合成及细菌数量要滞后 TDHA Ih达到峰值，菌群培育IOh后达到最佳水平，且为了提高瘤胃细菌工厂化培育效率， 优化培育时间，故将瘤胃细菌的最佳培育时间设定为10士0. 2h，为规模化瘤胃菌群发酵培 育提供参考依据，后期研究提供优质菌种源。实施例3 发酵工艺最适条件筛选的正交设计试验1.2. 1采用正交设计L9(34)，寻求菌质蒜泥比(体积质量比即L :kg)、反应时间、亚 铁离子浓度以及不同Vb6含量菌液的最佳组合。测定样品为75°C低温干燥的GBS。植物源 大蒜活素高效转化影响因素、水平的正交设计试验(见表16)表7植物源大蒜活素高效转化影响因素、水平的正交设计试验

1.2. 2测定指标1.2.2. 1水溶性蛋白
1.2. 2. 2MCP1. 2. 2. 3大蒜三硫二丙烯采用高效液相色谱法测定[ii]1.2. 2.3. 1主要仪器与药品LCQ Deca XP MAX LC/MSB 联用仪(美国 FINNIGAN)三硫二丙烯标准品(批号100384-200501，中国药品生物制品检定所生产，含量 为88. 4%)；大蒜菌质活素粉(本实验室自主生产)；甲醇(色谱醇)。1. 2. 2. 3. 2色谱质谱条件色谱柱Agileut咒-(18柱(4.6\150謹，5“111)，流动相甲醇-水，梯度洗脱，甲 醇 60 100% (0 15min) ；100% (15 25min) ； 100 60% (25 28min) ；60% (28 30min)，流速0. 5ml/min，柱温:30°C，二极管扫描范围200 500nm，分辨率2. 4nm，检测波 长 228nm。1. 2. 2. 3. 3对照品溶液的配制和样品溶液的制备精确称取三硫二丙烯对照品0. 009Img于25ml容量瓶中，用色谱纯甲醇溶解并定 容到刻度，即得对照品储备液(1. 8044mmol/L)。分别称取0. 9320g于锥形瓶中，用20ml色 谱纯甲醇溶解，超声处理lOmin，清液转入25ml容量瓶中，用甲醇定容，测定前稀释5倍， IOOOOrpm离心lOmin，按外标法定量分析。1.2. 2. 3. 4 计算公式
检测样品浓度=？!f口。t^f χ对照品浓度X稀释倍数 对照品峰面积1. 2. 3数据处理所有试验数据均以Excel软件建立数据库，采用SPSS15. O统计软 件中进行正交设计结果分析。2结果与分析2. 1植物源大蒜活素高效转化菌质的制备表8VB6含量为10mg/L的菌液发酵培育的各项指标测定值
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表9VB6含量为30mg/L的菌液发酵培育的各项指标测定值 表10Vb6含量为60mg/L的菌液发酵培育的各项指标测定值 表11不同V1B6含量菌液发I酵培育PH值的动态变化

注VS 10mg/L 组 *P<0. 01，* P<0.05 ;VS 30mg/L 组☆ P < O. 01，★ P < O. 05。 表12不同Vb6含量菌液发酵培育TDHA的动态变化 注VS10mg/L组*Ρ<0· 01，* Ρ<0· 05 ;VS 30mg/L 组，^P < O. 01，^P < O. 05。表14不同Vb6含量菌液发酵培育水溶性蛋白含量的动态变化单位g/100ml 注VS10mg/L 组 *P < 0. 01，* P < 0. 05 ;VS 30mg/L 细☆ P < O. 01，★ P < O. 05。表9、表10、表11表明添加不同剂量Vb6的三组菌液pH前2h迅速降低，以后由于 碱液调节及培养液稀释趋于稳定；TDHA随时间延长逐渐升高，其中前4小时活性提高迅速， 并维持在较高水平，随着发酵结束，活性水平稍有降低，并且30mg/L和60mg/L组高于IOmg/ L组；MCP含量随着时间稳中有升，然后稍有降低，主要与菌液的稀释有关，MCP总量也稍有 提高，其中30mg/L和60mg/L组均高于10mg/L组；水溶性蛋白含量随着时间稳中有升，总量 也逐渐增大，其中30mg/L和60mg/L组均高于10mg/L组。表12表明:10mg/L组、30mg/L组和60mg/L组pH变化范围分别为5. 87 6. 40、 5. 93 6. 40 和 5. 90 6. 40，平均值分别为 6. 15士0. 046,6. 13士0. 034 和 6. 13士0. 038，各 组间差异不显著(P > 0. 05)。表13表明10mg/L组、30mg/L组和60mg/L组TDHA变化范围分别为0. 031 0. 302U/ml、0. 002 0. 500U/ml 和 0. 001 0. 370U/ml，平均值分别为 0. 181 士 0. 027U/ml、
0.259士0. 047U/ml 和 0. 252士0. 039U/ml，各组间差异不显著(P > 0. 05)。表14 9表明10mg/L组、30mg/L组和60mg/L组MCP含量变化范围分 另Ij 为 0. 515 + 0. 023 0. 994 + 0. 081mg/mUl. 018 + 0. 015 1. 641+0. 055mg/ ml 和 0.837 士 0.034 1. 687 士 0. 138mg/ml，平均值分别为 0. 779 士 0. 033mg/ml、
1.351 士 0. 037mg/ml 和 1. 261 士 0. 059mg/ml。与 10mg/L 组相比，30mg/L 组和 60mg/L 组 MCP 均较高，差异均极显著(P < 0. 01)。表15表明10mg/L组、30mg/L组和60mg/L组水溶性蛋白含量变化范围分别 为 0.021 士 0.003 0. 192 士0. 023g/100ml、0. 147 士0. 046 0. 231 士 0. 016g/100ml 和 0. 137 士 0.047 0. 271 士 0. 034g/100ml，平均值分别为 0. 105 士 0. 009g/100ml、 0. 181 士 0. 009g/100ml 和 0. 192 士 0. 011g/100ml。与 10mg/L 组相比，30mg/L 组和 60mg/L 组 水溶性蛋白含量均较高，差异均极显著(P < 0.01)。2. 2发酵工艺最适条件筛选的正交设计试验通过正交设计试验，结果如下(表17、表18、表19)表15正交设计试验结果
19 表16正交设计试验单因素统计 通过SPSS15. 0统计分析，表18表明各因素水平的优劣顺序为: A3 > A2 > A1, B2 > B1 > B3, C3 > C2 > C1, D3 > D2 > D1
表17正交试验设计方差分析结果 通过SPSS15. 0统计分析，表19表明影响因素主次顺序为D > A > C > B。3 讨论3. 1体外培养条件下瘤胃菌群代谢活动的变化体外培养液pH变化是一个重要指标，直接影响到瘤胃细菌发酵的活性和底物降 解的程度。当饲喂高比例精料时，由于乳酸菌株的大量繁殖，导致PH值降至6.0以下，当PH < 5. 5时，生态系统即受到破坏性影响(Owens et al.，1998)。pH降到6. 2时，将严重抑制 纤维素菌的生长(Jagos et al.，1977[m] ；Russell et al.，1966[iv])。本试验通过 pH 的调 节，使PH稳定在合适范围，为胃细菌提供合适的酸碱度，使其维持在较高的活性状态。瘤胃微生物在降解饲料蛋白质的同时，又利用饲料发酵过程中产生的挥发性脂肪 酸(VFA)、能量(ATP)和部分寡肽、氨基酸和氨(包括内源性的氨)合成微生物蛋白。最终 这些微生物蛋白连同饲料中过瘤胃蛋白(包括过瘤胃完整蛋白和部分小肽)随食糜流入真 胃和小肠，然后又被动物分泌的消化酶分解成小肽或游离氨基酸，供动物机体利用。反刍动 物小肠可吸收氨基酸来源于3个部分即瘤胃微生物蛋白质、饲料非降解蛋白质(包括小 肽)和内源分泌的蛋白质。微生物蛋白质是小肠吸收氨基酸的主要来源，就多数日粮而言， 瘤胃中合成的微生物蛋白约占进入小肠总氨基酸氮的60 85% (冯仰廉，2004)。瘤胃微 生物的氨基酸组成变异很小，而且品质优于植物蛋白，仅次于鱼粉和豆粕，在小肠中的降解 率高达80 85%。瘤胃微生物蛋白的合成和分解体系除了能使反刍动物大量利用非蛋白 氮外，还在反刍动物蛋白质代谢上起着重要的稳衡控制作用。MCP产量对反刍动物蛋白质营 养状况影响较大，它是研究反刍动物蛋白质营养的一个重要指标。体外培育MCP含量反映 了瘤胃细菌降解饲料生成氨氮同时利用氨氮合成菌体蛋白的能力，反映了瘤胃MCP的合成 能力及其繁殖性能。本试验通过严密调控微生态环境，MCP含量测定结果表明严密的体外 调控环境保证了瘤胃细菌的生长繁殖。瘤胃细菌在发酵过程中发挥着重要的作用。本试验中由于培养底物中含有植物纤 维素，瘤胃细菌含有能降解纤维素等植物细胞壁各种成分的高活性酶，将它们分解为单糖， 并经细菌的发酵作用，产生终产物VFA。瘤胃细菌具有水解蛋白质的活性。在瘤胃内，蛋白 水解细菌占瘤胃细菌总数的12 38%。目前普遍认为，主要的蛋白水解菌是居瘤胃拟杆 菌、嗜淀粉拟杆菌和溶纤维丁酸弧菌。培养菌液中的蛋白质，被细菌分泌的蛋白水解酶降解 为NH3、VFA、C02和其它含氮化合物。许多瘤胃细菌能够利用氨作为唯一氮源合成自体细胞 蛋白质。瘤胃微生物具有脂解活性，三酰甘油和磷脂经细菌水解为甘油和脂肪酸，甘油进一 步酵解生成丙酸。瘤胃菌群参与糖类代谢、蛋白质代谢、脂类代谢、矿物质代谢等，pH、TDHA、MCP反映 了瘤胃菌群代谢活动和繁殖性能的强弱。本试验整个发酵过程中，瘤胃菌群保持了较高的 活力和代谢水平，这是瘤胃细菌增殖活动加强的表现。 本试验添加不同剂量VB6 (10mg/L, 30mg/L, 60mg/L)，进行菌液的体外驯化培育，通 过各项发酵参数的测定与统计分析可以看出，菌液培育的中、高剂量组(30mg/L、60mg/L)发酵指标优于低剂量组(10mg/L)。3. 2水溶性蛋白变化对瘤胃发酵的评价作用添加的培养底物日粮组成表明，由于培养底物中添加了一定量的豆粕，瘤胃细菌 在降解底物的时候会解离部分水溶性蛋白。周围蛋白(Peripheral Protein)，又称外在蛋 白，一般为水溶性蛋白质，分布在质膜内外两侧，通过静电作用及离子键，氢键与膜脂质分 子的极性头部相结合，或通过与内在蛋白相互作用间接与膜结合。在本项目工艺流程中，使 用了一定量大豆粕作为发酵底物，大豆粕在有益菌群的降解作用下，会产生一定量的水溶 性蛋白，通过水溶性蛋白含量的测定来衡量瘤胃细菌对底物的降解效率和程度，该指标可 作为工艺流程中发酵终点的质量控制指标。3. 3影响植物源大蒜素高效转化的因素评价Gleitz J等认为在新鲜的大蒜中，没有游离的植物源大蒜活素，只有它的前体 物质——蒜氨酸(alliin)，约占大蒜总鲜重的0.25% ；蒜氨酸以稳定无臭的形式存在于 大蒜中，当大蒜加工或受到物理机械破碎后，蒜氨酸酶就会和蒜氨酸相遇，在磷酸吡哆醛 (Pyridoxia Phoshate)辅酶参与下发生反应，生成具有强烈辛辣味的挥发性物质-植物源 大蒜活素。3. 3. IVb6对大蒜素高效转化的影响瘤胃菌群能够合成B族维生素，通过添加维生素B6,活化成蒜氨酸酶的辅酶磷酸吡 哆醛，高效转化植物源大蒜活素。3. 3. 2亚铁离子对大蒜素高效转化的影响一些金属离子可作为蒜氨酸酶的激活剂，低浓度起激活作用，而高浓度则会成为 抑制剂将抑制酶的活力[v]。金属离子如Mg2+、Fe3+、Ca2+、Fe2+、Mn2+对蒜氨酸酶有很好的激活 作用，其中Fe2+、Mn2+的激活效果最好，显著地提高了蒜氨酸酶的活性，而Cu2+强烈抑制酶的 活性。3. 3. 3富氧氧化对大蒜素高效转化的影响大蒜素的转化即蒜氨酸和蒜氨酸酶的反应需要在有氧条件下进行，氧化程度决定 大蒜素的转化量。富氧氧化能够提高蒜氨酸酶活力，促进大蒜素高效转化。3. 3. 4其它因素对大蒜素高效转化的影响大蒜中蒜氨酸的转化是一种酶促反应。因此，各种影响蒜氨酸酶活力的反应参数 都影响酶促反应的速度与强度。而温度、PH值、辅酶因子及其配置位点、反应时间等是影响 酶活性的重要因素。反应温度低，蒜氨酸酶的活性小；蒜素转化时间长，温度太高，偏离蒜氨 酸酶活性最适范围，产品得率又降低；反应PH值过低会使蒜氨酸酶变性失活，过高则影响 大蒜素的稳定性，造成产物的损失。本试验设定PH 6.3士0.1，反应温度30士0.11。反应 的时间也可影响蒜氨酸的转化。酶促反应时间短，一部分蒜氨酸难以及时酶解形成蒜素，转 化率降低；酶解时间长，蒜素及一些有机硫化物容易挥发或转化成副产物，影响产品的产率 及质量。3. 3. 5本研究中大蒜素高效转化技术的总体评价本正交试验表明，最佳工艺条件为菌质蒜泥比2.0 1.0，反应时间21!，亚铁离 子浓度30. Ommol/L, VB6含量为60mmol/L，但综合考虑实际生产效率，将菌质蒜泥比调整为 1.5 1.0。植物源大蒜活素转化时有氧氧化反应pH 6. 3 士0. 1，反应温度30 士0. 1°C。
通过正交设计试验的结果表明，合适的Vb6、菌质蒜泥比、亚铁离子、反应时间依次 分别是植物源大蒜活素高效转化的重要因素，尤其是Vb6通过菌群的代谢活动转化为磷酸 吡哆醛活性形式，这是蒜氨酸酶高效转化植物源大蒜活素的重要辅酶，工艺设计条件的最 优化组合，是植物源大蒜活素高效转化的理论基础和技术保证。植物源大蒜菌质活素富氧氧化制备大蒜素的转化即蒜氨酸和蒜氨酸酶的反应需要在有氧条件下进行，氧化程度决定 大蒜素的转化量。富氧氧化能够提高蒜氨酸酶活力，促进大蒜素高效转化。采用智能仿生瘤胃发酵器厌氧发酵培养10士0.2小时后，气动搅拌菌质，保留 50%发酵混合液作为菌种液继续进行发酵培养。提取50%发酵混合液作为特定菌质与经搅 碎工艺所得大蒜泥混合进行富氧氧化反应，相关条件分别为菌质与大蒜泥的液固重量比 1.5 1.0，pH 6. 4士0.3，温度30士0.3°C下，打开智能仿生瘤胃发酵器氧化阀，采用气动搅 拌方式实行充分的富氧反应，其反应时间2士0. 2h，反应终点物料在75V以下进行温敏干 燥、粉碎、质检、包装制备产品。实施例3植物源大蒜菌质活素粉的相关指标检测2.1测定指标2. 1. 1植物源大蒜菌质活素粉三硫二丙烯含量测定(高效液相色谱法)2. 1. 2植物源大蒜菌质活素粉中植物源大蒜活素含量测定(定硫法)2. 1. 2. 1 主要试剂硝酸(GR)，氢氧化钠(AR)，氯化钠(AR)，甲基橙(AR)2. 1. 2. 2 测定方法准确称取实施例2植物源大蒜菌质活素粉2. 5g(精确至0. OOOlg)，加浓硝酸3 4mL，用玻璃棒搅拌至黄色，放置20min，过滤并洗入IOOmL容量瓶中，定容至刻度。吸取滤 液80mL，放入150mL烧杯中，加0. 1 %甲基橙指示剂5滴，滴加10%氢氧化钠溶液至黄色，用 1 1盐酸调节PH = 2 3之间。在电炉上加热微沸，趁热加入IOmL 15%氯化钡溶液，搅 拌均勻，在90°C水浴上保温2h，用定量(无灰)滤纸过滤，用热去离子水洗至无氯离子(滤 液加硝酸银溶液不混浊为止)，将沉淀同滤纸放入预先恒重的瓷坩锅中，低温炭化，再放入 马福炉中6000C灼烧至恒重，取出冷却后称重。 式中32. 06 硫分子量；233. 39 硫酸钡分子量；m 硫酸钡重量；162. 26 植物源 大蒜活素分子量；Hitl 样品重量；Vtl 提取液总体积；V 测定提取液体积(HlL)。2. 1. 3植物源大蒜菌质活素粉硫代亚磺酸酯含量测定(光电比色法)[16]说明植物源大蒜活素含量约占总硫代亚磺酸酯的70%，国际上多使用该法的测 定值代表大蒜制剂的含量。建议本项目产品的植物源大蒜活素检测采用此法。2. 1. 3. 2 主要试剂5,5' -二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)(比利时进口分装)，L-半胱氨酸(生 化试剂)，Hepes (Sigma公司进口分装)，无水乙醇。
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2. 1. 3. 3半胱氨酸溶液的制备称一定量的L-半胱氨酸，使之溶解于50mM pH7. 5的!fepes缓冲液中，制备IOmM 左右的半胱氨酸溶液。半胱氨酸溶液的准确浓度通过测定与DTNB反应生成NTB，在412nm 下的吸光度值计算得到。2. 1. 3. 4DTNB 溶液的制备准确称取一定量的DTNB，使之溶解于一定体积50mM pH7. 5的!fepes缓冲液中，制 备成1. 5mM的DTNB溶液。2. 1. 3. 5植物源大蒜菌质活素粉乙醇提取液中硫代亚磺酸酯的含量测定称取植物源大蒜菌质活素粉2g(精确至0. OOOlg)，加入20m无水乙醇，超声提取 IOmin,然后4000rpml0min，取上清液测定硫代亚磺酸酯含量。2. 1. 3. 6半胱氨酸溶液的初始吸光度值取IOmM左右的半胱氨酸溶液5mL于试管中，加ImL去离子水，摇勻后取ImL于 IOOmL容量瓶中，加水至刻度。取稀释100倍的半胱氨酸溶液4. 5mL与DTNB溶液0. 5mL，在 26°C下保温15min后，在412nm波长下测定其初始吸光度值(Atl)。2. 1. 3. 7与乙醇提取液反应后半胱氨酸溶液的吸光度值取配置成IOmM左右的半胱氨酸溶液5mL，加入ImL乙醇提取液，在26°C下保温 15min后，取ImL反应混合液于IOOmL容量瓶中，加水至刻度。取稀释100倍的反应混合液
4. 5mL与DTNB溶液0. 5mL在26°C下保温15min后，在412nm波长下测定其初始吸光度值 ㈧。2. 1. 3. 8 计算公式ΔΑ412 = A0-AC thiosulf inates (mmol/mL) = ( Δ A412 X β ) / (2 X 14150)ΔΑ412-与硫代亚磺酸酯反应前后半胱氨酸吸光度值之差β -半胱氨酸溶液的稀释倍数2. 1. 4植物源大蒜菌质活素粉中水溶性蛋白含量测定(Lowry法)称取0. 15g植物源大蒜菌质活素粉(精确至0. Img)于离心管中，加入4mL蒸馏水， 混勻后加入2mol/L NaOH 4mL，摇勻，置50°C恒温振荡水浴中消化30min。消化完成后，摇勻，取0. 2mL消化液，用5. 8mL蒸馏水混勻，4000r/min离心5min。吸取上清液0. SmL作测定管，同时做空白管(加0. SmL蒸馏水，同标准曲线系列中 的第0管)和标准蛋白管(作为测定参照，可按标准曲线系列中的第3管进行)。各管加 入4mL福林-酚试剂甲液，37°C作用lOmin，再各加入0. 4mL福林-酚试剂乙液，于37°C水 浴中反应30min，750nm波长，蒸馏水调零，测定各管吸光度。将测定管吸光度减去空白管吸光度，代入标准曲线，查出样品测定溶液蛋白质含 量(C，μ g)，再计算出样品中蛋白质含量。 Χ-样品中蛋白质含量(g/l00g)C-样品测定溶液蛋白质含量(μ g)vl-测定时吸取测定溶液体积(mL)
v2_稀释后溶液的体积(mL)v3_稀释时吸取样品消化液的体积(mL)v4-样品消化时的体积(mL)W-称取样品量(g)2. 2结果与分析高效液相测定标准品及样品三硫二丙烯含量色谱图如图2和图3所示表20植物源大蒜菌质活素粉的各项指标测定
测定指标 由表20可以看出，前三组定硫法结果比较接近，而硫代亚磺酸酯含量则逐渐升 高，三硫二丙烯水平接近，水溶性蛋白含量逐渐降低。第四组由于采用新大蒜为原料，水分 比较多，各项指标测定值均较低。2. 3 讨论2. 3. 1植物源大蒜素不同检测方法的评价目前，有关植物源大蒜素的检测方法较多，而且测定结果差异较大，缺少权威性测 定方法，因此本研究采用三种测定方法进行了比较分析与评价。2. 3. 1. 1高效液相色谱法是以三硫二丙烯为标准品进行的检测。植物源大蒜素所 含有的有效活性成分为多种含硫化合物，主要是二硫二丙烯(约50 60%)、三硫二丙烯 (25 30% )，其它为少量多种复杂的含硫化合物。虽然该法测定的灵敏度高，但由于三硫 二丙烯在大蒜素中所含的比例较低，数值的误差反而变大，加之该法对设备的要求以及检 测的成本均较高，不太适合本项目的检测。2. 3. 1. 2定硫法主要检测大蒜中总的含硫量，包括活性和非活性的含硫化合物。由 于该法检测成本较低，固常被较多使用，但该法相当耗时，影响因素较多，准确性较差，因此 不宜在本项目中使用。同时，若含有阿藿烯或二烯丙基三硫化物时，则测定有很大误差[vi]。2. 3. 1. 3光电比色法主要检测产品中总硫代亚磺酸酯含量。植物源大蒜素含量约 占总硫代亚磺酸酯的70%，本研究参考Lawson法，在检测中加大被检测样量及试剂剂量， 使检测结果重复性好。该法简便易行，灵敏度较高，影响因素较少。目前，国外销售的含有蒜 粉的药片和胶囊的质量检测，都是以产品的硫代亚磺酸酯含量进行评定，因此硫代亚磺酸 酯可以作为评定大蒜制品质量的重要指标。本项目产品的大蒜素检测采用此法较为合适。
权利要求
一种大蒜菌质活素粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)用大蒜氧化物驯化、培育山羊瘤胃特定菌群；(2)采集瘤胃液进行体外分离、驯化、培育得到特定菌种群；(3)将特定菌种群添加基础大蒜泥和复合蒜氨酸酶激活剂进行体外厌氧驯化培育，得到特定菌质液；所说的复合蒜氨酸酶激活剂是VB6和Fe2+；(4)将特定菌质液与大蒜泥混合，在富氧等条件下氧化反应2±0.2h，反应终点产物经温敏干燥、粉碎制成大蒜菌质活素粉。
2.根据权利要求1所说的大蒜菌质活素粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体是 每只羊饲喂体重1. 2%的配合精料和经氧化25士3min的大蒜泥，分早晚两次分别从瘤胃瘘 管投喂，自由采食青干草，自由饮水，驯化25士3天。
3.根据权利要求2所说的大蒜菌质活素粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体是 采集瘤胃液，经尼龙绢过滤，过滤后瘤胃液与预热的等体积人工培养液混合加入分液漏斗 中，置于39士0. 5°C水浴锅内，立即充入CO2以保证厌氧环境，温育2士0. 2h后，将分液漏斗 下层析出的纤毛虫排除，上层的饲料残渣吸出，中间部分即为特定菌种群分离液。
4.根据权利要求3所说的大蒜菌质活素粉的制备方法，其特征在于，其中所说的人 工培养液每IOOOml的组成为常量元素237ml ；微量元素0. 12ml ；缓冲液237ml ；还原剂 49. 5ml ；蔗糖5g ；加蒸馏水至IOOOml ；其中各成分按下列配比配制还原剂Imol/LNaOH 溶液 4ml ；Na2S · 7H20 570mg ；加蒸馏水至 IOOml ；常量元素=Na2HPO4 5. 70g ；NaH2PO4 6. 20g ；MgSO4 · 7H20 0. 60g ；加蒸馏水至 IOOOml ；微量元素-.CaCl2 · 2H20 13. 20g ；MnCl2 · 4H20 10. OOg ；CoCl2 · 6H20 1. OOg ；FeCl3 · 6H20 0. 8g ；加蒸馏水至IOOml ；缓冲液=NaHCO3 35. OOg ；NH4HCO3 4. OOg ；加蒸馏水至 1000ml。
5.根据权利要求4所说的大蒜菌质活素粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)所说的厌 氧驯化培育发酵条件具体是将步骤(2)的菌种群分离液接种到等体积新鲜人工培养液中，每IOOOml人工培养混 合菌液中添加营养底物40士2g，其组成与山羊瘤胃特定菌群活体驯化使用的日粮配合精 料一致；基础蒜泥10士 Ig ；添加的复合蒜氨酸酶激活剂组成与剂量分别为VB660士5mg/L， Fe2+30士5mmol/L ；在 39. 0士0. 3°C, 2. 66士 1. 33Kpa, ρΗ6· 3士0. 3，培养液稀释率 3士0. 2% / h，维持发酵液总量稳定的条件下厌氧发酵10士0. 5小时，得菌质。
6.根据权利要求5所说的大蒜菌质活素粉的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体是 利用在步骤(3)所得发酵特定菌质与经搅碎工艺所得大蒜泥混合进行富氧氧化反应，反应 条件为菌质与大蒜泥的液固重量比1.5 1.0,pH 6. 4士0.3，温度30士0.3°C下，采用气动 搅拌方式实行充分的富氧反应，其反应时间2士0. 2h，反应终点物料在75。C以下进行温敏 干燥、粉碎得产品。
全文摘要
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种大蒜菌质活素粉的制备方法。该方法是先用大蒜氧化物驯化、培育山羊瘤胃特定菌群；然后采集瘤胃液进行体外分离、驯化、培育得到特定菌种群；再将特定菌种群添加基础大蒜泥和复合蒜氨酸酶激活剂进行体外厌氧驯化培育，得到特定菌质液；最后将特定菌质液与大蒜泥混合，在富氧等条件下氧化反应2±0.2h，反应终点产物经温敏干燥、粉碎制成大蒜菌质活素粉。利用本发明方法能制得植物源大蒜菌质活素粉，作为功能性饲料添加剂应用于畜牧业生产，能够具有显著的经济学价值和积极的社会学效益。
文档编号A23K1/14GK101904416SQ20091003282
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者任颖, 孙镇平, 张军, 张阳军, 杨盛荣, 黄凯 申请人:扬州大学;无锡大江中盛生物科技有限公司