葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程领域，涉及一种葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶及 其制备方法和应用。本发明还提供了该葡萄糖苷酶/木糖苷酶的重组质粒和重组基因工程 菌株。
背景技术：
植物木质纤维素是自然界主要的可再生资源，其主要成分是纤维素、半纤维素和 木质素，利用纤维素酶生物转化生产生物燃料已经成为世界各国新能源战略的最重要的发 展方向。木质纤维素中的纤维素是一种有100 1000个β -D-吡喃型葡萄糖以β -1，4-糖 苷键连接的直链多糖，多个分子平行紧密排列成丝状不溶性微小纤维。半纤维素则是由多 种多糖分子组成的支链聚合物，占植物干重的35%，在自然界中含量仅次于纤维素。半纤维 素的结构与组成比纤维素的复杂，它包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖 和木葡聚糖等多种组分。据估计充分利用半纤维素可使纤维乙醇的生产成本降低25%，这 显然应当归功于D-木糖。木糖在自然界中含量仅次于葡萄糖，每年仅美国从垃圾场的废纸 和垃圾中回收利用就可生产4亿吨乙醇。木质纤维素出发生产燃料乙醇，必须将生物大分 子降解为能够被微生物可利用的小分子糖类物质，木质纤维素的降解技术通常有酸水解和 酶水解两种技术路线。酸解法需要高温、高压，而且抑制物多、发酵困难，还存在环保问题。 酶解法转化条件较温和，只需要在常条件下水解，其选择性高、抑制物少，糖的纯度也高。在饲料工业中，纤维素酶在改善青贮饲料的营养价值同样具有广泛的应用前景。 添加纤维素酶可提高动物对粗纤维的利用率，改善单胃动物消化道环境，激活胃蛋白酶；纤 维素酶、半纤维素酶和果胶酶的协同作用，可破坏植物细胞壁，使细胞内容物溶解出来，提 高了养分的消化，同时也增加了非淀粉多糖的消化率和饲料原料的利用率；纤维素酶还可 以消除木质纤维中的抗营养因子。例如，果胶、半纤维素、β_葡聚糖和戊聚糖可部分溶解 在水中，增加动物胃肠道内容物粘度，影响饲料中养分吸收率利用，添加纤维素酶可降低粘 度，提高消化酶与饲料作用几率，促进饲料的良好消化。与真菌纤维素酶相比，细菌产的纤维素酶在耐热性和ρΗ耐受性都优于真菌，挖掘 细菌纤维素酶基因，既利于开发新型纤维素酶基因，也利于研究纤维素酶的多样性，为纤维 素酶的蛋白工程改造提供丰富的基因资源，获得新型的纤维素酶制剂产品。反刍动物的瘤 胃是各种细菌源纤维素降解酶的很好来源。目前在工业化生产具有较高产量的木聚糖酶就 是来源于瘤胃微生物Neocallinastixpartricaiarum。由于瘤胃环境的特殊性(酸性、高度 厌氧、高渗透压的恒温环境)，至今仅有不足20%的瘤胃微生物得到分离，80%以上的瘤胃 微生物以及其蕴藏的基因资源尚未被开发利用。国内外的专利检索也表明了瘤胃微生物资 源的开发严重缺乏，仅有少数的瘤胃微生物纤维素降解酶得到克隆鉴定，并且都是从可培 养的瘤胃微生物中获得的。木质纤维中的纤维素降解是一个复杂的多酶作用过程，因此纤维素酶是由多种
3水解酶组成的一个复杂酶系。根据其中酶功能差异性，分为以下三大类(1)葡聚糖内 切酶(1. 4-β -D-glucanhydrolase 或 endo-L 4_ β -D-glucanase Ε. C 3· 2· L 4),这类酶 作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1.4-糖苷键，产生大量小分子纤维素。(2) 葡聚糖夕卜切Bl (1. 4-β -D-glucan cellobiohydrolase 或 exo_l. 4_β _D_glucanase, Ε. C3. 2. 1. 91)，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β -1，4-糖苷键，其水解产物为 纤维二糖，故又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)。(3) β-1. 4_葡聚糖苷酶 (β -1. 4-glucosidase, Ε. C3. 2. 1. 21)，这类酶是将纤维二糖水解成葡萄糖分子。在纤维素 的降解过程中，纤维二糖对纤维素酶的降解有产物抑制效应，而葡萄糖苷酶能降解纤 维二糖从而消除纤维二糖的抑制效应，因此，β “葡萄糖苷酶在纤维素的降解过程中起着非 常重要的作用。目前已经多种细菌及真菌的β-葡萄糖苷酶得到了分离鉴定，如真菌 Aspergillus(FEMS Microbiol Lett 97 149-154,1992), Humicola(FEMSMicrobiol Lett. 146 291-295,1997)， Fusarium(Eur. J.Biochem223 :397-385,1994)， Volvariella(Appl Environ Microbiol. 65 :553_559,1999), Candida(Appl Environ Microbiol 61:518-525,1995)。关于β -葡萄糖苷酶基因已有一些专利和文献报道。如Dion等报道了 Thermus thermophilus 的 β -葡萄糖苷酶基因(glycoconjugate J, 16 :27_37，1999) ；Gonzalez 等 艮道了芽抱菌 Bacillus polymyxa 的 β-葡萄糖昔醇基因(Biochem Biophys Res Commun, 194 1359-1364，1993) ；Wrightdd 等报道了 Microbispora bispoera 的 β -葡萄糖苷酶基 因(Appl Environ Microbiol,63 ；3902-3910,1997) ；Lieb 等报道了 Thermotogamariti 的 β -葡萄糖苷酶基因(Mol Gen Genet，242 111-115，1994) ；Tonouchi 等报道了 Acetobacter xylinum的β-葡萄糖苷酶基因(美国专利USP6316251，2001年11月31日)。木聚糖(xylan)是一种杂合多聚五碳糖，主链由吡喃木糖基以β_1，4木糖苷键 相连。侧链上连着多种不同大小的基团。木聚糖的降解酶主要是(1)内切β_1，4-木聚 糖酶(endo-l，4-i3-D-Xylanase，EC3. 2. 1. 8)，该酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的 β-1，4木糖苷键，其主要水解产物为低聚木寡糖；(2) β-1，4-木糖苷酶(β-xylosidase， EC3. 2. 1. 37)，该酶通过水解低聚木寡糖的末端来水解释放木糖。微生物的木糖苷酶大部分 为胞内酶，少数真菌则能分泌胞外的β-木糖苷酶。在利用半纤维素生产燃料乙醇中，木聚糖经木糖酶和木糖苷酶降解成木糖，产生 的木糖可以经细菌或真菌发酵生产乙醇，因而在生物能源中的应用潜力发挥倍受关注。而 目前国内关于木糖苷酶的专利也很少，仅有南开大学(中国专利号=200710063139. 0)和丹 麦的丹尼斯科公司(中国专利号CN96194959.7)两项。而与木糖苷酶的研究报道也仅有 曲霉(Aspergillus) β-木糖苷酶的分离纯化及基因克隆。而具有β -葡萄糖苷酶和木糖苷酶降解功能的双功能酶，国内外仅有一篇文献报 道，Brunner 等(Phytochemistry，59 (2002)689-696)从马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)中克隆到的β _葡萄糖苷酶/木糖苷酶。

发明内容
本发明的目的是提供一种新型的具有β -葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能的糖苷水解酶。本发明的另一目的是提供该葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶的制备 方法。本发明的再一目的是提供该葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶的应用。 本发明提供了一种葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶，它具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。本发明中，葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶是指同时具备葡萄糖苷酶 和木糖苷酶活性的、氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的多肽，简称为RuBGXl。该术语还包 括同时具备葡萄糖苷酶和木糖苷酶活性的、SEQ IDN0.2序列的变异形式。这些变异形式包 括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10 个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为 20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相 近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末 端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括与SEQ ID NO. 2的 氨基酸序列的同源性达到80%及以上的序列。本发明的RuBGXl具有β -葡萄糖苷酶/木糖苷酶双重酶的特征，最适反应ρΗ5. 8， 最适反应温度50°C，分子量82，002Dao本发明的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶，它的核苷酸编码序列可以 如 SEQID NO. 1 所示。本发明的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶的核苷酸编码序列具备葡 萄糖苷酶和木糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列，例如SEQID NO. 1的核苷酸序列及其简并序 列。该简并序列是指，SEQ ID NO. 1序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并 密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 1同源性低至约 70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0. 2所述的序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 1的核 苷酸序列的同源性至少70 %，较佳地至少80 %，更佳地至少90 %的核苷酸序列。本发明还提供了含有上述的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶的核苷 酸编码序列的重组载体，该重组载体可以是大肠杆菌载体或者酵母载体。本发明中RuBGXl重组载体可以是pET21a、pET28a等大肠杆菌表达载体。相应的， 可用于表达 RuBGXl 的重组菌株是 Escherichia coli BL21、Ε. coliJM109、Ε. coli DH5a 或 者E.coli toplO等中的一种。本发明中RuBGXl重组载体也可以是是酵母表达载体pPIC9、pPIC9K、pKLACl、pYES 其中任意一种。相应的，可用于表达RuBGXl的重组菌株是Saccharomyces cerevisiae、 Pichia pastoris、Kluyveromyces Iactis 中的一禾中。上述重组载体和基因工程菌株可以采用本领域常规的技术手段和操作方法制备。本发明还提供了一种制备RuBGXl的方法，依次包括以下步骤(1)收集中国牦牛瘤胃微生物菌体，抽提DNA ；(2)筛选具有β -葡萄糖苷酶活性的阳性克隆；(3)特异性引物扩增获得RuBGXl的核苷酸编码序列；(4)重组表达 RuBGX 1。
上述分离收集菌体、抽提DNA、筛选克隆、扩增基因、表达蛋白等步骤都可以采用本 领域常规的技术手段和操作方法。本发明采用宏基因组技术方法克隆来源于牦牛瘤胃微生物纤维素降解酶的β -1， 4-葡萄糖苷酶，同时具有较高的β -1，4-木糖苷酶的酶活性。宏基因组(Metagenome)(也称微生物环境基因组学Mi crobial Environmental Genomics,宏基因组学、元基因组学Metagenomics,生态基因组学Ecogenomics)是由 Handelsman ^ 1998 ρWfl^W^^^C^J "the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培 养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组 学(metagenomics)就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因 筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能基因、相互协作关 系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。本发明的RuBGXl核苷酸编码序列也可以根据预测的RuBGXl核苷酸编码序列人工
合成获得。本发明利用元基因组技术及分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其他 受体菌，或由其他菌株或在其他培养方式产生本发明所涉及的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功 能酶。本发明还提供了 RuBGXl在制备生物燃料或者饲料添加剂方面的应用。本发明的RuBGXl可应用于木质纤维素的纤维素、半纤维素的降解及饲料添加等 其他工业过程。本发明还提供了一种提高木聚糖还原产量的方法，即将RuBGXl与木聚糖酶联合 使用。实验表明，在木聚糖酶中加入适量的RuBGXl，在同等条件下可以明显增加木寡糖
的产量。本发明提供了一种葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶RuBGXl，该酶同时 具备葡萄糖苷酶和木糖苷酶的双功能特征，能够水解葡萄糖苷、半乳糖苷、木糖苷、纤维二 糖及三糖等，尤其是β型底物。加入适量的金属离子，例如Mg2+、Co2+可以提高RuBGXl活 性。本发明提供的新型葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能蛋白可用于纤维素生物转化、化 工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业方面应用等领域。本发明的RuBGXl可应用于木质纤维素的纤维素、半纤维素的降解及饲料添加等 其他工业过程。利用本发明的RuBGXl降解木质纤维，条件温和，抑制物少，产物纯度高、产 量高、水解速度快。用于饲料添加剂，本发明的RuBGXl能够提高动物对粗纤维的利用率，改 善单胃动物消化道环境，激活胃蛋白酶；提高了养分的消化程度，同时也增加了非淀粉多糖 的消化率和饲料原料的利用率；纤维素酶还可以消除木质纤维中的抗营养因子。添加纤维 素酶可降低粘度，提高消化酶与饲料作用几率，促进饲料的良好消化。


图1 牦牛瘤胃内容物中提取的微生物宏基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道Ml Lambda/Hind III Marker ；泳道1 提取的瘤胃微生物基因组DNA。图2 牦牛瘤胃微生物宏基因组cosmid文库的BamH I图谱分析，其中，泳道Ml Lambda/Hindi 11 Marker ；泳道11-20 瘤胃微生物基因组cosmid克隆质粒DNA BamH I产 物；泳道 M2 :1Kb DNA ladder Marker。图3 重组表达载体pET2Ia-RuBGXl的EcoR I和Hind III酶切电泳图，其中，泳 道 M2:lKb DNA ladder Marker ；泳道 31、33 重组 pET21a_RuBGXl 质粒；泳道 32、34 重组 pET2Ia-RuBGXl质粒EcoR I和Hind III双酶切产物；泳道35 :pET21a质粒。图4 重组酶RuBGXl表达、纯化的蛋白SDS-PAGE电泳图，各泳道加入的样品分 别是泳道41 未带质粒的大肠杆菌细胞蛋白；泳道42-47 分别是300mmOl、150mmOl、 1 OOmmo 1,80mmo 1,60mmo 1,40mmo 1的咪唑洗脱收集液；泳道48 大肠杆菌pET2Ia-RuBGXl重 组菌破碎后上清；泳道49 大肠杆菌pET21a-RuBGXl重组菌破碎后沉淀；泳道50 带pET21a 空质粒的大肠杆菌。图5 重组酶RuBGXl的最适反应pH值。图6 重组酶RuBGXl的最适反应温度。图7 =RuBGXl降解纤维二糖及MU-纤维二糖的TLC分析图，其中，Marker 葡萄糖 +纤维二糖；纤维二糖+ 纤维二糖+RuBGXl 纤维二糖-纤维二糖中没有加入酶液；MU-纤 维二糖+ =MU-纤维二糖+RuBGXl =MU-纤维二糖-:MU_纤维二糖中没有加入RuBGXl酶液。图8 =RuBGXl和木聚糖酶降解木聚糖的协同效应。图9 木聚糖酶降解木聚糖Ih后产物高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析图。图10 =RuBGXl木聚糖酶共同降解木聚糖Ih后产物HPAEC分析图。图11 木聚糖酶降解木聚糖16h后产物HPAEC分析图。图12 =RuBGXl木聚糖酶共同降解木聚糖16h后产物HPAEC分析图。
具体实施例方式实施例1中国牦牛瘤胃微生物宏基因组DNA的提取采集中国青海牦牛瘤胃样品，采用3层纱布过滤，滤液离心收集瘤胃微生物菌体， 取100-200ul菌体样品，PBS洗2 3次，加入650uL DNA抽提缓冲液(Tris-HCl，IOOmM ρΗ8· 0 ；Na2EDTA IOOmM ρΗ8· 0 ；Na3PO4 Buffer 100mMpH8. 0 ；NaCl 1. 5M ；CTAB 1% ；ρΗ8· 0)， 混勻后，置-80°C中，然后放置在65°C水浴中融化，重复三次；冷却后加入3-4 μ L溶菌酶 (100mg/L)于摇床中水平振荡(37°C，225rpm)约 30min ；加入 2-3 μ L 蛋白酶 K(20mg/mL) 后继续振荡约30min ；加入50-70uL SDS (20% )，混勻后，65°C保温l_2h，每隔10 20min 上下颠倒离心管混勻；12，OOOrpm室温离心lOmin，收集上清液，加入400_500ul的酚氯 仿异戊醇(25 24 1)抽提两次；氯仿异戊醇(24 1)抽提一次后加入0. 6倍体 积的异丙醇，室温放置15-20min后，12000rpm离心15min ；沉淀用70%乙醇漂洗，干燥后用 60-100 μ L TE (ρΗ8. 0)溶解，加入1 μ LRNAase去除RNA。0. 8%的琼脂糖电泳检测结果如图 1所示，抽提的瘤胃宏基因组大小在30 40kb左右，完全符合构建宏基因组cosmid文库要 求。实施例2牦牛瘤胃微生物宏基因组cosmid文库的构建及葡萄糖苷酶的活性筛选 瘤胃未培养细菌宏基因组文库的构建方法参照Epicentre公司pTOB::TNC Cosmidcloning kit试剂盒产品说明书。抽提的宏基因组dna经end-r印air enzyme mix末端补平，和试剂盒中的去磷酸化载体pweb: :tnc连接，连接产物用maxplax lambda packaging extracts包装后、侵染宿主菌ε. coli epi100，侵染产物涂平板，37°c培养12 16h长出菌 落，即为该批样品的宏基因组文库。随机调取10个cosmid克隆提取质粒dna，用bamh i酶 切分析(如图2)，结果表明构建的文库质量较好，插入的基因组片断大小约30 40kb。β -葡萄糖苷酶的活性筛选采用荧光底物4-甲基伞形酮β -d_l，4-葡萄糖苷作为 底物。将96孔板微量培养的细胞冻融破碎后加入20ul的lmg/ml 4-甲基伞形酮β -d-i, 4_葡萄糖苷的底物(50mmol citrate-phosphate ph4. 8)，37°c反应 30 分钟后加入 30ul im na2co3，紫外下呈现荧光即为具有β-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆。通过对5000个cosmid 文库克隆的筛选，共获得50个具有β -d-1,4-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆。实施例3瘤胃微生物来源的rubgxl基因的序列的克隆及分析将筛选到的cosmid阳性文库克隆，在pgemllz中进行亚克隆、功能筛选和使用特 异性的寡核苷酸作为测序反应引物测定瘤胃微生物来源的rubgxl基因、它的启动子/调节 去、基因的结构部分和终止区的序列。为测定核苷酸序列，分离出的部分sau3a i酶切片断(2_3kb)，然后将其克隆到载 体pgemllz中，利用4-甲基伞形酮β-d-i，4-葡萄糖苷为底物进行亚文库的β -葡萄糖苷 酶的功能筛选，获得的阳性亚文库克隆通过载体pgemllz的t7测序引物和sp6测序引物测 定核苷酸序列。使用分析软件dnaman进行编码区序列分析。在seq id no 1中给出了测 定的基因的orf序列。获得的具有β -1，4-葡萄糖苷酶活性的基因命名为rubgxl,rubgxl基因编码854 个氨基酸残基组成(seq id n0. 2)，并且具有82，002da的推断分子量，自n端氨基酸序列的 前端是一个17氨基酸长的疏水性信号肽序列，第73-292位氨基酸为糖基水解酶家族3的 催化功能域(glycosyl hydrolase 3domain)，第358-616时糖基水解酶家族3c端功能域 (glycosyl hydrolase 3c domain)，通过ncbi (http //www, ncbi. ηlm. nih. gov/) ^blastx 软件分析，rubgxl 与 parabacteroides distasonis atcc 8503 β-glucosidase 的同源性 最高，其氨基酸序列相似度58%。分析结果表明获得的rubgxl是一个新型的纤维素降解酶 基因。实施例4rubgx1基因在大肠杆菌中的重组表达根据rubgxl基因序列以及大肠杆菌表达载体pet_21a序列，设计合成一组寡核苷 酸引物ιη向引物 rubgxif tccgaattc AAGCCGCCCCAGCTCGGAAAAGCA (seq id no 3)和反 向引物 rubgxir :cgcaagctt TTGCATCAGAAGGACAGTGTGGGT (seq id no 4)。序列中的限制
性内酶识别序列以下划线标记，基因序列以斜体表示，克隆的基因序列去除去除了 n端17 个信号肽氨基酸。pcr扩增rubgxl基因产物经琼脂糖电泳回收后用ecori和hindiii分别 酶切后，与ecor i和hindiii酶切的载体pet-21a(+)(购自novagen公司)连接，连接产 物转化大肠杆菌e. colitoplo，转化子利用引物ruBGXIF和ruBGXIR进行菌落pcr筛选及 验证。提取转化子的质粒，用ecor i和hind iii酶切分析(结果如图3)，选择具有2. 3kb 插入片段的重组载体(命名为pet21a-rubgxl)转化大肠杆菌表达菌株ε. coli bl21(de3) (购自novagen公司)进行重组表达。上述制备重组载体的技术手段也适用于制备pet28a_rubgxl，上述基因工程菌株的制备思路也适用于制备含有pET28a-RuBGXl或者pET2Ia-RuBGXl的Escherichia coliBL21(DE3)、E. coli JM109、E.coli DH5 α 或者 Bacillus subtilis 基因工程菌株。实施例5RUBGX1的特性分析底物特异型分析利用下列的底物p-nitrophenyl- β -glucopyranside (对硝 基苯基一β - 口比喃葡萄糖昔)，p-nitrophenyl-α -glucopyranside(对销基苯基一α -批 喃葡萄糖苷)，p-nitrophenyl- β -galactoside (对硝基苯基-β -半乳糖苷)； p-nitrophenyl- α -galactoside (对石肖基苯基-α -半季L 糖 Ρ ) ；p-nitrophenyl- β _D_ xylopyranoside (对硝基苯基-beta-D-木糖苷)、蔗糖，分析RuBGXl对这些底物的水解 能力。结果表明，RuBGXl对α-型构型的糖苷底物没有活性，但RuBGXl对β构型的底 物具有一定的广 i普个生，其中 p-nitrophenyl- β -glucopyranside 禾口 p_nitrophenyl_ β -D-xylopy-ranoside的活性较高，分别是100%和29. 5 %，而同类型的β构型的底物 p-nitrophenyl- β -galactoside 的相对活性不足 8. 3% 应用分光光度仪在410nm检测产物来测定酶的活性，以每分钟催化pNPG或pNPX 生成Iumol对硝基苯酚(p-nitrophenol)所需要的酶量为一个酶活单位(IU)。结果表明重 组RuBGXl对pNPG和pNPX的比活分别为37. 6IU/mg蛋白、11. lIU/mg蛋白。酶的最适合反 应条件的测定以PNPG为底物，测定最适pH所用的缓冲液范围为pH 3.0-8.0，50mmol柠檬 酸“磷酸氢二钠缓冲液(citrate-phosphate buffer)。结果表明(如图5)在ρΗ5· 8酶的 活性最高。在最适的PH下测定不同温度(33°C-62°C)酶的催化效率，结果发现RuBGXl在 50°C下的活性最高(如图6)。实施例6金属离子及单糖对RuBGXl活性的影响在酶的最适合条件下(pH5. 8，50°C )测定金属离子及单糖对RuBGXl水解pNPG和 pNPX的影响。反应体系为50uL 1. 25mmol pNPG/pNPX，5mmol的金属离子或单糖，5uL的酶 液，50°C反应10分钟后加入2倍体积的IMNa2CO3的中止反应，410nm分光光度法测定产物 PNP生成量，结果如下表，表明适当的金属离子如Mg2+、Co2+可以提高20%的RuBGXl活性， 而且葡萄糖对RuBGXl的葡萄糖苷酶活性有较明显的抑制效应，对RuBGXl木糖苷酶的活性 影响并不明显。
试剂
相对葡萄糖苷酶活性(%)
相对木糖苷酶活性(%) MnCl2117.6±5.2128.6±9·8 CaC 12 102.6 + 4. 3 100. 3 + 3.6实施例7RUBGX1的β -1-4-葡萄糖苷酶性质分析RuBGXl的β _1_4-葡萄糖苷酶的性质分析利用纤维二糖和4_甲基伞形酮 i3-D-l，4-纤维二糖为底物，用薄层层析(TLC)分析生成的产物。薄层层析条件展开剂 正丁醇乙醇水(5 3 2)；展开时间1小时，显色剂=H2SO4 methanol (3 7)；显色 方法80-90°C烘烤15-20min。结果如图7所示，RuBGXl能够降解二糖底物纤维二糖及三糖
底物MU-纤维二糖产生葡萄糖。实施例8RUBGX1的β -1-4-木糖苷酶性质分析2%的木聚糖中(pH5. 8，50mmol citrate/phosphate缓冲液配制)中，分别加入 0. 2V的木聚糖酶(xylanase)和0. 3V的大肠杆菌重组表达的RuBGXl，升温至45°C水解， 分在20min、40min、60min取样，用3，5_ 二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖产物以 分析木聚糖酶和RuBGXl协同降解木聚糖。结果如图8，加入适量的RuBGXl可以显著的提 高还原糖的产量，反应液继续45°C作用16小时，利用高效离子交换色谱-脉冲安培检测 法(HPAEC-PAD)分析单一酶解及双酶解产物，离子交换色谱分析条件型号DX500(美国 Dionex 公司)；分析柱CarboPac PA-1 (250mmX4. 6mm)(美国 Dionex 公司)；洗脱条件 O-IOOmM醋酸钠/0. IM NaOH梯度洗脱5min，接着以100_400mM醋酸钠/0. IM NaOH梯度洗 脱35min。木糖的定性采用标准加入法。离子交换色谱分析结果表明xylanase单个酶作用 1小时(如图9)或16小时(如图11)都没有木糖的产生，而RuBGXl与xylanase在45°C 作用1小时产物中有少量的木糖的积累(如图10)，而且在同等条件下，双酶作用比单一的 xylanase水解产生的木寡糖的量高，当反应时间延长到16小时后大量木糖的积累(如图 12)。结果说明RuBGXl与xylanase降解木聚糖时具有协同促进降解效应，并且能将木聚糖 降解成微生物可发酵的D-木糖。葡萄糖苷酶木糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用SEQUENCE LISTING<110>复旦大学<120>葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用<210>1<211>2298<212>DNA<213>中国牦牛瘤胃微生物<220><221>CDS<222>(1). . (2298)<223><400>1
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葡萄糖苷酶木糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用
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葡萄糖苷酶木糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用
cgcaagcttt tgcatcagaa ggacagtgtg ggt 3权利要求
一种葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶，其特征是它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶，其特征是它的核 苷酸编码序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.一种含有权利要求1所述的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶的核苷酸编 码序列的重组载体，该重组载体是大肠杆菌载体或者酵母载体。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征是该重组载体是大肠杆菌载体表达载体 pET21a 或者 pET28a。
5.一种含有权利要求4所述的重组载体的重组菌株，该菌株是Escherichia coliBL21、E.coli JM109.E.coli DH5a 。
6.如权利要求3所述的重组载体，其特征是该重组载体是酵母表达载体PPIC9、 pPIC9K、pKLACl、pYES 其中任意一种。
7.—种含有权利要求6所述的重组载体的重组菌株，该菌株是Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis 中的一禾中。
8.一种制备如权利要求1所述的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶的方法， 其特征是该方法依次包括以下步骤(1)收集中国牦牛瘤胃微生物菌体，抽提DNA;(2)筛选具有葡萄糖苷酶活性的阳性克隆；(3)特异性引物扩增获得如权利要求1所述的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降 解酶的核苷酸编码序列；(4)重组表达葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶。
9.权利要求1的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶在制备生物燃料或者饲料 添加剂中的用途。
10.一种提高木寡糖产量的方法，其特征是将权利要求1所述的葡萄糖苷酶/木糖苷酶 双功能纤维素降解酶与木聚糖酶联合使用。
全文摘要
本发明属生物工程领域，涉及一种葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶RuBGX1，其重组载体、菌株、制备方法及应用。RuBGX1能够水解葡萄糖苷、半乳糖苷、木糖苷、纤维二糖及三糖等底物，在木聚糖酶中加入适量的RuBGX1，可以明显增加木聚糖的还原产量。RuBGX1可用于纤维素生物转化、化工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业方面应用等领域。利用本发明的RuBGX1降解木质纤维，能够减少添加酶的种类，简化酶解工艺。本发明的RuBGX1用作饲料添加剂，能够提高动物对粗纤维的消化程度，改善单胃动物消化道环境，增加饲料利用率，促进饲料的良好消化。
文档编号A23K1/165GK101870966SQ20091017171
公开日2010年10月27日 申请日期2009年8月26日 优先权日2009年4月27日
发明者包蕾, 吕红, 周峻岗 申请人:复旦大学