专利名称：：Mapkkk家族基因dsm1基因在控制水稻抗旱性中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高甘露醇耐受能力的水稻DSM1基因在水稻抗逆性遗传改良中的应用。本发明采用筛选T-DNA插入水稻突变体库的方法，克隆到控制水稻抗旱基因DSM1，通过共分离检测表明该突变体与干旱敏感表型是紧密连锁的，及通过超量表达DSM1基因，使转基因水稻甘露醇耐受能力提高，证实了该基因的功能。
背景技术：
：植物的生长除了有其固有的遗传基础外，往往还会受到诸多环境因素的影响。干旱、高盐、低温是最为常见的非生物逆境，严重影响了植物的生长，限制了植物的分布。非生物逆境会造成作物产量和品质的下降，在许多地区是农业发展的瓶颈。因此，培育抗逆性作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了适应或抵御这些逆境条件，植物在经过长期的生物驯化之后，形成了一套防御干旱、高盐、低温等逆境胁迫的自我保护机制。干旱、高盐和低温胁迫，都破坏了植物细胞的离子平衡，致使细胞脱水，使植物细胞受到离子和水分胁迫，引起植物体在基因表达，新陈代谢以及形态上的变化，这些变化包括一些基因表达升高或降低，生长的减缓甚至停止，体内激素(如ABA)的瞬时上升，体内调节渗透压的物质的聚集等(SekiM，UmezawaT，UranoK，ShinozakiK.Regulatorymetabolicnetworksindroughtstressresponses.CurrOpinPlantBiol，2007，10:296-302)。并且植物在进化过程中也形成了一系列的信号转导路径来介导对胁迫的反应，从而控制植物的生长发育。以往对植物信号转导路径的认识仅局限于直接感知信号的感应或受体蛋白，或直接调控反应的转录因子和目标基因。而对处于这两者之间的基因的了解却十分有限。在最近几年中，科学家们已经鉴定多条信号转导路径，如与盐胁迫有关的Salt-0ver1y-Sensitive(SOS)路径、与多种逆境有关的CDPK信号路径、与冷胁迫有关的ICE1(InducerofCBFExpression1)_CBF(C-R印eatBindingProtein)路径、与渗透压有关的ABA依赖型和非ABA依赖型的信号转导路径以及裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)级联信号通路，其中MAPK级联信号通路在植物的各种生理反应如细胞分裂、激素反应、非生物胁迫和生物胁迫中都起着及其重要的作用(JonakC，KiegerlS，LigterinkW，BarkerPJ，HuskissonNS，HirtH.Stresssignalinginplants:amitogen—activatedproteinkinasepathwayisactivatedbycoldanddrought.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93:11274-11279)。MAPK级联信号通路是高度保守的，他通过三级激酶级联反应，即MAPKKK(MAPKinaseKinaseKinase)—MAPKK(MAPKinaseKinase)—MAPK，但是，一直以来，人们只知道MAPK级联途径由这3种激酶组成，但就具体的MAPK级联通路的组成、生理功能、目标基因等情况还知之甚少，特别是参与非生物逆境应答的完整MAPK级联通路还未见报道。因此对非生物逆境应答的MAPK级联通路研究有很重要的意义(TenaG，AsaiT，ChiuWL，SheenJ.Plantmitogen-activatedproteinkinasesignalingcascades.CurrOpinPlantBiol，2001，4:392-400)。水稻是重要的粮食作物和模式植物，通过水稻突变体来研究一些与植物生长、发育和其他性状相关的基因已成为一种重要的基因功能研究手段。在我们的前期研究中分离到一个干旱敏感的水稻T-DNA突变体，其插入基因是一个MAPKKK基因。鉴于水稻中MAPKKK是否能提高植物的抗逆性目前尚无相关报道。因此，从水稻中分离出MAPKKK基因，并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。
发明内容本发明的目的涉及一个MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性改良中的应用。从水稻T-DNA突变体库中分离得到一个干旱敏感的水稻T-DNA突变体，其插入基因是一个MAPKKK基因，基于这个突变体的表型，申请人将该基因命名为DSM1(drought-sensitivemutant1)。本发明分离和应用一种包含DSM1基因的DNA片段，该片段赋予水稻在逆境条件下抗性增强的能力。其中，所述的DSM1基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO:1中第159-3494位所示的DNA序列；或2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列；或3)1)和2)所包含的亚片断。携带有本发明DSM1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress,NewYork,pp.411—463;GeisersonandCorey，1998，PlantMolecularBiology(2ndEdition)。可使用包括本发明的DSM1基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗旱，抗盐或抗寒的植物品种。本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物在逆境条件下的生长速度。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。序列表SEQIDNO:1显示的是本发明分离克隆的包含有DSM1基因编码区的核苷酸序列。图1.根据插入位点设计引物验证共分离示意图。A表示在插入位点上游设计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T1代植株中，纯合突变体只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。图2.根据插入位点设计引物验证共分离的PCR结果。上一行引物A+B，下一行引物C+B，其中泳道2，5，13，16，17，18，19，20，21，22，23，24为T-DNA纯合;1，3，6，8'14，15为T-DNA杂合；4，7，9，10，12为T-DNA阴性。图3.水稻突变体表型。上干旱胁迫前。下干旱胁迫后。ZH11为野生型对照，dsml-1为DSM1T-DNA突变体。图4.DSM1能被多种逆境(干旱、高盐、低温、ABA等)诱导表达。图5.正常生长和12Ommol/L甘露醇胁迫下，3个DSM1超量表达转基因家系(Tl)和对照生长状况的比较。图6.甘露醇胁迫地上部分统计结果。图7.超表达实验所用pU1301载体图。图8.DSM1基因抑制表达转基因家系干旱胁迫表型。具体实施例方式以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离DSM1T-DNA突变体，克隆包含有DSM1基因完整编码区段和基因的启动子区段的DNA片段，以及验证DSM1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。实施例1:分离DSM1T-DNA突变体基于已报道的植物MAPK/MAPKK/MAPKKK蛋白质序列建立隐马尔可夫模型(H匪s:HiddenMarkovmodelprofiles)然后用HMMER扫描水稻全基因组，得到水稻基因组里所有可能的MAPKKK基因。然后从水稻突变体库(http:〃rmd.ncpgr.cn/)中挑取相应的T-DNA突变体。本发明所涉及的序列来源于NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)，TIGR(http:〃www.tigr.org)，KOME(http:〃cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以"TIGRRiceAnnotationRelease4"为准。其中DSM1T-DNA突变体的侧翼序列为根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，可以确定插入位点，在插入位点的两边设计一对引物A和B，及T-DNA上设计一条引物C，如图1，A表示在插入位点上游设计的引5物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T1代植株中，T-DNA纯合植株只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。根据插入位点设计的弓I物序列为A(弓I物)5'CACCGTCCTCGGGTTTATC3'B(弓|物)5'AGTTTCTTGCCGCTGTTCA3'C(引物)5'AATCCAGATCCCCCGAATTA3'。PCR反应体系的总体积为20ii1，DNA模板lul(约50ng)、lXTaq酶反应缓冲液、25mMMgCL2l.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶，加水至20ii1。反应程序为:94。C变性5min，94°C45s、55。C45s、72。Clmin30cycles，72。C延伸5min。PCR结果，如图1，2，5，13，16，17，18，19，20，21，22，23，24为T-DNA纯合；1，3，6，8，14，15为T-DNA杂合；4，7，9，10，12为T-DNA阴性。结果表明这个T-DNA插在第12个EXON，据ATG7174bp处。实施例2:鉴定突变体干旱胁迫表型将已鉴定好基因型的纯合和野生型家系催芽后直播到小圆桶中。试验用的土壤为南方水稻土与粗沙按2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶期的植株进行断水干旱胁迫12天，然后复水7天，拍照并调查植株的存活率。与野生型对照相比，T-DNA纯合植株表现为干旱敏感表型，在中度胁迫复水后，纯合植株基本全部死亡，而野生型仍有60%以上的存活率。该实验经行了3次生物学重复，结果一致。说明该突变表型确实是T-DNA插入造成的。为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，又繁殖了一代即T2代。将T1代收获的种子播种得到T2代纯合，杂合和野生型种子。同样经行上述胁迫实验，结果一致。实施例3:检测水稻内源DSM1基因的表达水平我们选用袖稻品禾中中花11号(OryzasativaL.subsp.j即onicacv.Zhonghim11)作为表达谱分析时材料。种子催芽后，在正常生长条件下培养18-20天，至四叶期时进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是将幼苗直接从水培液中取出暴露于空气中，分别在胁迫前、胁迫后6小时、24小时、36小时取样；高盐胁迫是将幼苗由水培液移入含有200mmol/LNaCl的水培液中，分别在胁迫前，2小时、6小时、12小时取样；低温胁迫是把水稻幼苗放入4t:人工气候室，分别于胁迫前、胁迫后3小时、7小时、12时取样。激素处理是用lOOyM脱落酸(ABA)均匀的喷洒水稻植株表面后，分别在胁迫前、胁迫后3小时、6小时、12小时取样。所有的处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行的。总RNA采用TRIZ0L试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZ0L试剂说明书)，利用反转录酶SSII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为65°C5min，42°C120min，70°C10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(5'-GTGGTCATGGTCCATTATTGCC-3'和5'-CCCAAACCCTCAACTGGCTTA-3')对DSM1基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长72bp)。同时用引物(AF:5'-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3'禾PAR:5'-TGCACAATGGATGGGTCAGA—3')对水稻Actinl基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为95。C5min;95。C10sec，60。C5sec，72。C34sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明，DSM1基因在高盐、ABA和干旱处理后诱导上升表达，在低温胁迫中也有轻微地下降表达(见图3)。实施例4:DSM1基因超量表达、抑制表达载体的构建和遗传转化为了能更好的分析DSM1基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达和抑制表达。从转基因植株的表型研究该基因的功能。超量表达载体构建方法如下首先通过查找日本水稻全长数据库Knowledge-based0ryzaMolecularbiologicalEncyclopedia(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆J033107F14(登录号AK102767)，并购买其全长cDNA。已该全长cDNA为模板，用引物DSMFLF(5'-CCAGGTACCCAACAGTGGGCAATAGG-3')和DSMFLR(5'-CCAGGATCCTGGTTTCAATGAGGCCATG-3')，扩增出包含DSM1全长的DNA片断，反应条件为94。C预变性3min;94。C30sec，50。C30sec，72。C3min，30个循环；72。C延伸10min。用BamHI和Kpnl双酶切，回收次PCR片段；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pCAMBIA1301U酶切完毕，用氯仿异戊醇(体积比为24:l)抽提，纯化酶切产物。用包含DSM1全长的酶切片段和酶切后的载体做连接反应，转化大肠杆菌DH1013(大肠杆菌DH10P菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。遗传转化的载体pCAMBIA1301U(见图7)是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(载体pCAMBIA1301来自澳大利亚CAMBIA[CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture]实验室)基础上，在酶切位点EcoRI和Sacl处引入广泛使用的组成型表达的Ubiquitin启动子(参见TokiS，TakamatsuS，NojiriC，0obaS，AnzaiH，IwataM，ChristensenAH，QuailPH，UchimiyaH.ExpressionofaMaizeUbiquitinGenePromoter—barChimericGeneinTransgenicRicePlants.PlantPhysiol，1992，100:1503-1507)而得到的(见图7)，被命名为遗传转化的载体pCAMBIA1301U。抑制表达载体构建方法如下首先通过查找日本水稻全长数据库Knowledge-basedOryzaMolecularbiologicalEncyclopedia(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆J033107F14，并购买其全长cDNA。以该全长cDNA为模板，用引物uz41maif(5'ccaactagtggtaccTTGTAGCACCACCTGACT3')禾Puz41mair(5'ccagagctcggatccATTGAAGACGCAACCACT3')，扩增出包含DSM1全长的400bp片断，反应条件为94。C预变性3min;94°C30sec，50。C30sec，72。Clmin，30个循环；72。C延伸10min。用BamHI和Kpnl双酶切或Spel和Sacl双酶切，回收该PCR片段；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pdsl301(见图7)酶切完毕，用氯仿异戊醇(体积比为24:l)抽提，纯化酶切产物。用包含DSM1400bp的酶切片段和酶切后的载体pdsl301(见图7)做连接反应，转化大肠杆菌DH1013(大肠杆菌DH1013菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选获得阳性克隆。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(如下述具体步骤)将以上载体(pCAMBIA1301U和pds1301)导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(中花ll)遗传转化方法(体系)在Hiei等人手艮道的方f去(Hiei等，Efficienttransformationofrice，OryzasativaL.，mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT_DNA，PlantJ，6:271-282，1994)基础上改良进行(如下述具体步骤)。7具体遗传转化步骤如下(1)愈伤组织诱导将成熟的水稻种子中花ll(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，O.15%氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±rC。(2)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±rc。(3)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±rc。(4)农杆菌培养在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，培养温度28°C;将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，2『C摇床上培养2-3小时。(5)农杆菌侵染将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至0D6。。0.8-1.0;将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20°C。(6)愈伤洗涤和选择培养灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400卯m，第二次以后为250卯m，潮霉素浓度250卯m)。(7)分化将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照下培养，温度26°C。(8)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2_3周，温度26°C。(9)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。培养基组分及其配方(l)试剂和溶液縮写本发明中培养基所用到的植物激素的縮写表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-节基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧节青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(N即thaleneaceticacid，萘乙酸)IAA(Indole-3-aceticacid，口引哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide,二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓縮液(10X)]的配制硝酸钾(KN03)28.3g磷酸二氢钾(KH2P04)4.0g硫酸铵((NH4)2S04)4.63g硫酸镁(MgS047H20)1.85g氯化钙(CaCl22H20)1.66g逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。2)N6培养基微量元素母液[100倍浓縮液(100X)]的配制0.08g0.16g4H20)0.44g7H20)0.15g室温下溶解并定容至1000ml。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(匪)的配制准备800ml双蒸水并加热至70。C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA2H20)3.73克，充分溶解后在7(TC水浴中保持2小时，定容至1000ml，4t:保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制碘化钾(KI)硼酸(H萬)硫酸锰(MnS04硫酸锌(ZnS04烟酸(Nicotinicacid)0.lg维生素Bl(ThiamineHC1)0.lg维生素B6(PyridoxineHC1)0.lg甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4t:保存备用。5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制硝酸铵(NH4N03)16.5g硝酸钾19.Og磷酸二氢钾1.7g硫酸镁3.7g氯化钙4.4g室温下溶解并定容至1000ml。6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制碘化钾0.083g0.62g0.86g0.025g0.0025g硫酸锰钼酸钠(Na2Mo042H20)硫酸铜(CuS045H20)室温下溶解并定容至1000ml。7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液l均为mg/ml。8)葡萄糖贮存液0.5g/ml。9)AS贮存液的配制秤取AS0.392g，DMSO10ml。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)愈伤组织诱导培养基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA贮存液(100X)10ml维生素贮存液(ioox)10ml2，4-D贮存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.蔗糖(Sucrose)30gPhytegel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三-角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA贮存液(100X)10ml维生素贮存液(ioox)10ml2，4-D贮存液2.Oml脯氨酸0.5gCH0.蔗糖30gPhytegel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌c3)预培养基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(匪)2.5ml2，4-D贮存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g琼脂粉(Agarose)1.75g加蒸馏水至250ml，lN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250ii1AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(匪)2.5ml2，4-D贮存液0.75mlCH0.2g0128]蔗糖5g0129]琼脂粉1.75g0130]加蒸馏水至250ml，lN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250ii1AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。0131]5)悬浮培养基0132]N6max母液(10X)5ml0133]N6mix母液(100X)0.5ml0134]Fe2+EDTA贮存液(100X)0.5ml0135]维生素贮存液(100X)1ml0136]2，4-D贮存液0.2ml0137]CH0.08g0138]蔗糖2g0139]加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和1001AS贮存液。0140]6)选择培养基0141]N6max母液(10X)25ml0142]N6mix母液(100X)2.5ml0143]Fe2+EDTA贮存液(100X)2.5ml0144]维生素贮存液(匪)2.5ml0145]2，4-D贮存液0.625ml0146]CH0.15g0147]蔗糖7.5g0148]琼脂粉1.75g0149]加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。7)预分化培养基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(匪)2.5ml6-BA贮存液0.5mlKT贮存液0.5mlNAA贮存液50ii1IAA贮存液50ii1CH0.15g蔗糖7.5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5.9，封口加入250ii1HN和200卯mCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。使用前溶解培养基，110163]0164]0165]0166]0167]0168]0169]0170]0171]0172]0173]8)分化培养基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTA贮存液(100X)维生素贮存液(100X)6-BA贮存液KT贮存液NAA贮存液IAA贮存液CHPhytegel100ml10ml10ml10ml2ml2ml0.2ml0.2mllg30g3g0177]0178]0179]0180]0181]0182]0183]0174]0175]加蒸馏水至900ml，lN氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至lOOOml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。0176]9)生根培养基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTA贮存液(100X)5ml维生素贮存液(100X)5ml蔗糖30gPhytegel3g加蒸馏水至900ml，lN氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至lOOOml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。0184]实施例5:DSM1超量表达转基因1\代家系在甘露醇胁迫下的生长状况0185]本实施例选取了3个DSM1超量表达1\家系进行了甘露醇胁迫实验。具体步骤如下将超量表达转基因家系种子去壳消毒(75X酒精处理3min，0.15%氯化汞处理30min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型对照家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有Ommol/L和120mmol/L的甘露醇的1/2MS培养基上，在光照培养室生长10天后观察表型和测量植株的株高。每个家系的每种处理不少于15棵植株，实验设置3次重复。结果表明DSM1超量表达的转基因植株的生长在正常条件下略差于对照，但在逆境胁迫处理后生长要显著(t测验P〈0.01)优于对照，说明本发明的DSM1基因的表达可以缓解甘露醇胁迫造成的植株生长受阻，增强转基因植物对非生物逆境的抗性(见图5、图6)。实施例6:DSM1抑制表达转基因1\代家系在干旱胁迫下的生长状况本发明选取了3个DSM1抑制表达T1家系进行了甘露醇胁迫实验。具体步骤如下将抑制表达转基因家系种子去壳消毒(75X酒精处理3min，0.15%氯化汞处理30min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型对照家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到正常1/2MS培养基上，在光照培养室生长IO天后，将幼苗移入装有沙土的小圆桶中。试验用的沙土为南方水稻土与粗沙按重量份2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。等幼苗生长至4叶期后，对植株进行断水干旱胁迫12天，然后复水7天，拍照并调查植株的存活率。试验表明，本实施例与野生型对照相比，抑制表达植株表现为干旱敏感表型(图8)。序列表〈110〉华中农业大学〈120〉MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性中的应用〈130〉〈141>2009-11-10〈160>2〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>3845〈212>DNA〈213>水稻(0ryzasativa〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(3845)〈223〉〈220〉〈221>CDS〈222〉(159)(3494)〈223〉〈400>1ggagtcaatecctgccteaagttgagtteccccttccgcctcagcgtcagtggccatgtc60ggatccaccc3ccc3ccacc3gc朋cagtgggc朋teggcc朋tegctgctgctgcgacg120gcgacctcggcggcggcggcggcggcggtggcgacggcatgaagaacttcttc￡igg176MetLysAsnPhePheArg15getccacateggggaggggtegggcgacggcgectectegtctccc224LysLeuHislieGlyGluGlySerGlyAspGlyAlaSerSerSerPro101520cctccaccgccctectegaggaaggggageggcggggtggggggt朋t272ProProProProSerSerArgLysGlySerGlyGlyValGlyGlyAsn253035catcacctgcacgecgagcagaggcagccateggcgteggcggtgteg320HisHisLeuHisAlaGluGinArgGinProSerAlaSerAlaValSer404550agetggcttgattecgtcccaggteggcctcagccccctacgccgteg368<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>LeuMetLysLeuAspGinThrAlaLeulieMetSerLeuGluLeuArg265270275g朋tctcctteag朋tttgttgga朋tgatttggttC3g333ctt1040GluSerLysProSerGluPheValGlyAsnAspLeuValGinLysLeu280285290getggcetagtegcc3gaC3CEltgggtggaactttttttgattctgag1088AlaGlyLeuValAlaArgHisMetGlyGlyThrPhePheAspSerGlu295300305310ggcEltgttggtgaaatacCElgatgatg3gatecctg3gaaccagt1136GlyMetLeuValLysTyrGinLysMetMetArgTyrLeuArgThrSer315320325attElgtgtegttgttcctcttggcc朋tte朋aattggtctggca1184lieGlySerValValValProLeuGlyGinLeuLyslieGlyLeuAla330335340cgtcatcgtgCElctgetattt朋ggttttggccgataacattggtate1232ArgHisArgAlaLeuLeuPheLysValLeuAlaAspAsnlieGlylie345350355ccctgtCg￡letcctggg￡i￡lggcagtacactggateggacgatggg1280ProCysArgLeuLeuLysGlyArgGinTyrThrGlySerAspAspGly360365370getttg朋tattgtgaaatttgatgatggaagggagttcattgttgat1328AlaLeuAsnlieValLysPheAspAspGlyArgGluPhelieValAsp375380385390cttgtcgCElgatcctggtcttattcctteagatggtgetgttttg1376LeuValAlaAspProGlyThrLeulieProSerAspGlyAlaValLeu395400405tctg朋tttg朋g朋Elgttecttcteaaataatcatcattttaac1424SerThrGluPheGluGluSerSerPheSerAsnAsnHisHisPheAsn410415420gat朋tg￡lCate￡lggCElgttgggatctteaaatagtttetegaat1472LysAspAsnAsplieArgGinLeuGlySerSerAsnSerLeuSerAsn425430435tctgCEltgtElgttcttttgagtgtgagttecttgac3ga3gatctsea1520SerAlaCysSerSerPheGluCysGluLeuLeuAspArgArgSerThr440445450tggate朋cgttggtccttctgat3gtg3tgg3get3CgageC3g1568TrplieAsnValGlyProSerAspSerAspGlyAlaThrThrSerGin455460465470Elgt朋c朋tc朋c朋朋tacacteteagatteattcgggatt1616ThrSerLysAsnAsnGinGinAsnThrLeuSerAspSerPheGlylie475■485ttatctgttagettcactElgtg朋朋t3ggCCt3tt3C3朋tg朋1664LeuSerValSerThrPheThrSerGluAsnArgProlieThrAsnGlu490495500tea3gaElgtg￡lCg￡lCattgetgccgC333g朋3g朋3g3tea1712SerArgSerThrAspAsplieAlaAlaAlaLysAsnLysGluArgSer505510515Elgtgt￡latt朋ttcttcgteaactteacctteaccttctteccca1760SerValThrlieAsnSerSerSerThrSerProSerProSerSerPro520525530g朋gt￡lggcElgtactCC3getgtceggaggatg朋agte朋ggatatt1808GluValGlySerThrProAlaValArgArgMetLysValLysAsplie535540545550tcggagtacEltgatt朋tgetgcca朋gag朋tccac朋ctegetcag1856SerGluTyrMetlieAsnAlaAlaLysGluAsnProGinLeuAlaGin555560565朋gatecatgaggttttacttg朋朋tggagttgtegcaccacctgac1904LyslieHisGluValLeuLeuGluAsnGlyValValAlaProProAsp570575580ttgtttteag朋gattecEltgg朋gagcca朋ggacetcategtgtet1952LeuPheSerGluAspSerMetGluGluProLysAspLeulieValTyr585590595g￡lC3CC3CCctttttc朋age朋ggatg朋atg朋a朋gaggatg朋t2000AspThrThrLeuPheGinSerLysAspGluMetLysLysArgMetAsn600605610g朋cttgggtcg￡iggg朋tatgetgatcgtggtcatggtccattettg2048GluLeuGlySerArgGluTyrAlaAspArgGlyHisGlyProLeuLeu615620625630cctcatcatcctcatg朋etcccateaaaagttcctcacegggca2096ProHisHisProGlyHisGluLeuProSerLysValProHisArgAla635640645cctetag￡lCteactt朋gCC3gttgagggtttgggcattgaccacccc2144ProLeuAspSerLeuLysProValGluGlyLeuGlylieAspHisPro650655660cctg￡lCatec朋gat朋ctcttttatttctcagtatgaaccttct2192ProAsplieGinAspAsnThrSerPhelieSerGinTyrGluProSer665670675gCElcctcccCElgg朋getteatcgcagcttacaaagcaattgcctgtt2240说明书15/20页AlaProProGinGluAlaSerSerGinLeuThrLysGinLeuProVal6806856903CggetgetgetgttgCElactgetgcagtggttgcgtctteaatggtt2288ThrAlaAlaAlaValAlaThrAlaAlaValValAlaSerSerMetVal695700705710gttgetgetgetaaatea朋c朋tgatgtgaactttgacgtgcctgtt2336ValAlaAlaAlaLysSerAsnAsnAspValAsnPheAspValProVal715720725gCElgetgetgCElgtcactgCElgetgcagttgttgccacaactget2384AlaAlaAlaAlaThrValThrAlaAlaAlaValValAlaThrThrAla730735740getgttage朋gc朋tatg朋C3Cttggagcctggtaatcagctgcat2432AlaValSerLysGinTyrGluHisLeuGluProGlyAsnGinLeuHis745750755ElgtttaCC33gtccctccg朋ggg朋tg朋teaategag3333gtgca2480SerLeuProSerProSerGluGlyAsnGluSerlieGluLysSerAla760765770gatgagttttgggataaaCElg朋ttttg朋attgatcatggtc朋gat2528AspGluPheTrpAspLysGinAsnPheGlulieAspHisGlyGinAsp775780785790朋tactttggatc朋g朋gatteagetgaagttcgccaggatget2576AsnThrLeuAspGinGluLysAspSerAlaGluValArgGinAspAla795■805g朋3ga3CCteagat朋gteaagegg3gag3gtgcaa朋tctg朋2624GluArgThrSerAspLysSerSerGlyThrGluSerAlaLysSerGlu810815820ateactctggatgatgttgcggagtttg朋atec朋tggg朋g朋att2672lieThrLeuAspAspValAlaGluPheGlulieGinTrpGluGlulie825830835actattgggg朋cgcattggtcttggateatttggag朋gtttet3ga2720ThrlieGlyGluArglieGlyLeuGlySerPheGlyGluValTyrArg840845850gagtggcatg朋gttgetgte朋g朋gtttctgc朋c朋2768GlyGluTrpHisGlyThrGluValAlaValLysLysPheLeuGinGin855860865870gatattteaElgtgatgetctgg朋g朋ttt3gaactgaggtgcgaate2816AsplieSerSerAspAlaLeuGluGluPheArgThrGluValArglie875880885ate朋g￡lggttgeggcatccg朋tgttgttetcttcatgggtgetatt2864lieLysArgLeuArgHisProAsnValValLeuPheMetGlyAlalie890895900actcgtgtecccaatctttctattgtcacagaatttcttccaagaggt2912ThrArgValProAsnLeuSerlieValThrGluPheLeuProArgGly905910915agettattteggtteattcatcgtccc朋c朋ccagttggatg朋3ga2960SerLeuPheArgLeulieHisArgProAsnAsnGinLeuAspGluArg920925930朋gcgcttaagaatggcacttgatgtggcacgtggtatgaattatcte3008LysArgLeuArgMetAlaLeuAspValAlaArgGlyMetAsnTyrLeu935940945950cat朋ctgcacaccggtgatagtccatcgagatctgaagtctccaaac3056HisAsnCysThrProVallieValHisArgAspLeuLysSerProAsn955■965etactggttgacaagaattgggttgtgaaggtttgcgactttggttte3104LeuLeuValAspLysAsnTrpValValLysValCysAspPheGlyLeu970975980tctEltgaag朋c朋gaccttcttgteatea3gateaseagetgga3152SerLysMetLysAsnLysThrPheLeuSerSerArgSerThrAlaGly985990995gcggagtggatggcacctg朋gtecttcgt朋tg朋ccatea3197ThrAlaGluTrpMetAlaProGluValLeuArgAsnGluProSer100010051010g￡lCgagaaatgcgatgtttttagetatggggtcatactgtgggaa3242AspGluLysCysAspValPheSerTyrGlyVallieLeuTrpGlu101510201025ctttgtttectgc朋ccttggggaggcatg朋cgecatgc朋3287LeuCysThrLeuLeuGinProTrpGlyGlyMetAsnAlaMetGin103010351040gtcgtcgetgttgggtttcagaatcgtcgccttgatattcca3332ValValGlyAlaValGlyPheGinAsnArgArgLeuAspliePro104510501055gat朋cactgatcccgecattgcag朋ateategcaa朋tgctgg3377AspAsnThrAspProAlalieAlaGlulielieAlaLysCysTrp106010651070CElg3Cgg￡lCccaaaattgeggccateatttgcagatateatggec3422GinThrAspProLysLeuArgProSerPheAlaAsplieMetAla107510801085teattgCC3ctgctg333朋catgaccgetc朋gcgCC33gg3467SerLeuLysProLeuLeuLysAsnMetThrAlaGinAlaProArg109010951100CElg3gagta,c朋3CCg￡lCgagt朋g朋朋朋g3ggatgtteccaGinArgVa]_GinGin—ThrAspGlu11051110gctgcccgaaggccteagta,tegcatttttttttgttttttgtategteacaccaattgtgtgttcg卿ttgg腿gcg:tgatgatgttagtgtgctgggtetccatctgtgaagaccagcgctgccaaacccgtccac:g3tgg3gg朋朋ttg朋C3gCggC朋g朋3CtgtgC3朋Cgcg朋tca朋tgtttegcac:agttcttcccC朋3朋C3CC3gtctcagg3朋tcacatggcgggcggaagttecacatgc:ttttttcateccatctctcttttcctttatctcgtgttctccaccaaatggtggtetttg:tgt朋tetggc〈210>2〈211>1111〈212>PRT〈213>水稻(0ryzasativa〈400>2MetLysAsnPhePheArgLysLeuHislieGlyGluGlySerGlyAsp151015GlyAlaSerSerSerProProProProProSerSerArgLysGlySer202530GlyGlyValGlyGlyAsnHisHisLeuHisAlaGluGinArgGinPro354045SerAlaSerAlaValSerSerTrpLeuAspSerValProGlyArgPro505560GinProProThrProSerThrProSerGluAlaGluGlySerProPhe65707580SerSerSerValGlySerGlyAlaGluGluArgArgGinSerValAla859095AlaGluArgArgArgSerGinGluGluGluTrpGluArgArgArgSer100105110GinGluGluGluAlaValArgGluMetArgArgSerGinGluGluAsp115120125GluValGluGluArgVallieArgGluSerSerGluAlaGluGluArg130135140LysArgValArgGluLysGluAspAspAspLeuGluGluPheGinLeu145150155160GinLeuValLeuGluMetSerAlaArgAspAsnProGluGluMetGlu165170175lieGluValAlaLysGinlieSerLeuGlyPheCysProProGinSer3514357436343694375438143845180185190SerThrAlaGluAlaLeuAlaAlaArgTyrTrpAsnPheAsnAlaLeu195200205GlyTyrAspAspArglieSerAspGlyPheTyrAspLeuTyrValThr210215220GlyAsnGlyProAlaSerlieThrMetProSerLeuLysAspLeuArg225230235240AlaGinSerLeuSerHisArgValAsnTrpGluAlaValLeuValHis245250255ArgGlyGluAspProGluLeuMetLysLeuAspGinThrAlaLeulie260265270MetSerLeuGluLeuArgGluSerLysProSerGluPheValGlyAsn275280285AspLeuValGinLysLeuAlaGlyLeuValAlaArgHisMetGlyGly290295300ThrPhePheAspSerGluGlyMetLeuValLysTyrGinLysMetMet305310315320ArgTyrLeuArgThrSerlieGlySerValValValProLeuGlyGin325330335LeuLyslieGlyLeuAlaArgHisArgAlaLeuLeuPheLysValLeu340345350AlaAspAsnlieGlylieProCysArgLeuLeuLysGlyArgGinTyr355360365ThrGlySerAspAspGlyAlaLeuAsnlieValLysPheAspAspGly370375380ArgGluPhelieValAspLeuValAlaAspProGlyThrLeuliePro385390395400SerAspGlyAlaValLeuSerThrGluPheGluGluSerSerPheSer405410415AsnAsnHisHisPheAsnLysAspAsnAsplieArgGinLeuGlySer420425430SerAsnSerLeuSerAsnSerAlaCysSerSerPheGluCysGluLeu435440445LeuAspArgArgSerThrTrplieAsnValGlyProSerAspSerAsp450455460GlyAlaThrThrSerGinThrSerLysAsnAsnGinGinAsnThrLeu465470475■SerAspSerPheGlylieLeuSerValSerThrPheThrSerGluAsn48549049520ArgProlieThrAsnGluSerArgSerThrAspAsplieAlaAlaAla500505510LysAsnLysGluArgSerSerValThrlieAsnSerSerSerThrSer515520525ProSerProSerSerProGluValGlySerThrProAlaValArgArg530535540MetLysValLysAsplieSerGluTyrMetlieAsnAlaAlaLysGlu545550555560AsnProGinLeuAlaGinLyslieHisGluValLeuLeuGluAsnGly565570575ValValAlaProProAspLeuPheSerGluAspSerMetGluGluPro580585590LysAspLeulieValTyrAspThrThrLeuPheGinSerLysAspGlu595600605MetLysLysArgMetAsnGluLeuGlySerArgGluTyrAlaAspArg610615620GlyHisGlyProLeuLeuProHisHisProGlyHisGluLeuProSer625630635640LysValProHisArgAlaProLeuAspSerLeuLysProValGluGly645650655LeuGlylieAspHisProProAsplieGinAspAsnThrSerPhelie660665670SerGinTyrGluProSerAlaProProGinGluAlaSerSerGinLeu675680685ThrLysGinLeuProValThrAlaAlaAlaValAlaThrAlaAlaVal690695700ValAlaSerSerMetValValAlaAlaAlaLysSerAsnAsnAspVal705710715720AsnPheAspValProValAlaAlaAlaAlaThrValThrAlaAlaAla725730735ValValAlaThrThrAlaAlaValSerLysGinTyrGluHisLeuGlu740745750ProGlyAsnGinLeuHisSerLeuProSerProSerGluGlyAsnGlu755760765SerlieGluLysSerAlaAspGluPheTrpAspLysGinAsnPheGlu770775780lieAspHisGlyGinAspAsnThrLeuAspGinGluLysAspSerAla785790795■GluValArgGinAspAlaGluArgThrSerAspLysSerSerGlyThrGluSerAlalieGinPheLys865ArgLeuGluAsnArg945AspValSerArgValMetArglieAlaAlaGly850LysThrPhePheGin930GlyLeuCysArgAsn1010lie1025Asn1040Leu1055Ala1070Asp1085Gin1100Trp835GluPheGluMetLeu915LeuLys820GluValLeuValGly■Pro805SerGluTyrGinArg885AlaArgGluMetAsnTyrAspLysAspSer995GluLeuAlaAspLyslieAlaSerPhe980ThrPro965GlyAlaGlulieArgGin870lielieGlyArgLeu950AsnlieThrGly855AsplieThrSerLys935HisThrlie840GluLeu825Gly810AspAspArgTrpHisGlyGluVallieThr860AlaAlaGly845GluLeuGlu830LeuValGlulieSerSerAsp875ArgHisProAsnLysArgLeu920ArgAsnArgVal905PheLeuLeu890Pro815PheGlyAlaGluVal895ValGluSerValPhe880ValThrAsnLeuSerlie910ArgProAsnCysLeuLeuValArgLeulieArgThrMetLeuSerLysMet985Asp970LysPro955LysAla940ValHis925LeulieTrpAsnLysThrAsnAspValAlaValValHisPhe990Val975LeuArg960LysSerGlyProSerAspThrTrpGluMetGinlieProCysTrpMetAlaProArgLeuValAspGinSerGinAlaGluTrpMetAlaProGluValLeu10001005GluLysCysAspValPheSer1020GinPro1035GlyPhe1050Alalie1065ProLysLeuArg1080ProLeuLeuLys1095GinGinThrAsp11101015Cys1030Val1045Asn1060Thr1075Leu1090Arg1105ThrGlyThrAspLysValLeuLeuAlaValAspProTrpGinAlaProAsnGluTyrGlyGlyGlyAsnArgGlulieSerPheMetThr权利要求一种控制水稻抗旱性的基因DSM1在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于，该基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO1中第159-3494位所示的DNA序列；或2)编码与1)中第159-3494位编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。全文摘要本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性中的应用。通过功能分析和鉴定获得一个控制水稻抗旱性的关键基因DSM1，验证了该基因在水稻抗旱性抗逆遗传改良中的应用。所述的DSM1基因是下列核苷酸序列之一序列表SEQNO1中第159-3494位所示的核苷酸序列；或编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的核苷酸序列。将水稻内源基因DSM1的功能缺失或其表达量降低后，水稻抗旱性极限著下降；将含DSM1基因的核苷酸序列与外源启动子连接后转入水稻，转基因水稻的抗旱能力得到显著提高。文档编号A01H5/00GK101705234SQ20091027269公开日2010年5月12日申请日期2009年11月10日优先权日2009年11月10日发明者宁婧,熊立仲申请人:华中农业大学