专利名称：：组织培养铁皮石斛类原球茎的方法
技术领域：
：本发明属于植物组织培养
技术领域：
，具体是一种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法。
背景技术：
：铁皮石斛(DendrobiumcandidumWall,exLindl.)为兰禾斗(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物，因老茎茎节处呈褐色，又名黑节草，是一种集观赏和药用于一身的名贵珍稀草本植物，具有独特的药用价值，为石斛之极品。石斛是我国古文献中最早记载的兰科植物之一，其性味甘淡、微咸，性属清润，清中有补，补中有清。早在东汉时期的《神农本草经》中已记载石斛"主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃"。成书于一千多年前的道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为"中华九大仙草"之首，为历代帝王梦寐以求的宝物，素有"千金草"之称，驰名中外，被国际药用植物界称为"药界大熊猫"，民间称其为"救命仙草"。现代药理学研究表明，石斛多糖具有增强T细胞及巨噬细胞免疫活性的作用，是一种前景可喜的中药免疫增强剂，并具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抗诱变等作用，受到国内外学者的高度重视。铁皮石斛常附生于树木或岩石上，植株比较矮小，生长发育缓慢，叶片面积小、光合面积小、强度低，尤其是种子极小，胚具后熟现象，因此自然条件下种子难以萌发(萌发率低于5%)。在通常的栽培条件下，铁皮石斛由种子到开花需要34年，常需与某些真菌共生才能萌发，很难有实生苗栽培。而传统的分株扦插等无性繁殖方式的成活率低、生长速度慢、繁殖率低，加之近年来人们对野生铁皮石斛资源的掠夺式采挖，其生境被严重破坏，致使野生铁皮石斛濒临灭绝。国内外学者开展了对野生铁皮石斛全面的研究，包括化学成分，药理活性，人工种植等方面的研究。而铁皮石斛的培养主要集中在愈伤组织诱导、基本培养条件筛选和理化因子的考查等方面。铁皮石斛试管苗的繁殖一般要经过类原球茎(protocorm-likebodies,即PLBs)阶段，而类原球茎实质上是正在生长分化的体细胞胚胎，具有与原植株相同的物质代谢和形态发育潜能。鉴于此，人们提出用类原球茎代替原植株成为新药源的可能性。然而，已有的研究结果表明，从铁皮石斛不同部位诱导出类原球茎的研究还存在诱导率低、分化快和褐变等问题尚没有解决，目前还没有找到一个切实有效地培养技术用以解决铁皮石斛类原球茎诱导和增殖以及代谢产物控制中存在的疑点和难点，从而影响了铁皮石斛的深入研究和开发。天然铁皮石斛已作为濒临灭绝的植物种受到世界以及我国政府的重点保护，严禁采摘。为此研究铁皮石斛类原球茎的培养，实现产业化显得十分重要。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种繁殖速度快，石斛多糖含量高的组织培养铁皮石斛类原球茎的方法。本发明的目的是这样实现的一种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，它包括如下步骤a、植物体的选择及无菌处理选择68月份生长的铁皮石斛野生新鲜植株，除去根和叶进行清洗和无菌处理，选取实生苗的幼茎，将幼茎剪成0.30.5cm2大小铁皮石斛组织；b、组织诱导培养将经过无菌处理后的铁皮石斛组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，培养周期1024天，培养温度1030。C，光照时间l24小时/天，光照强度0100iimo1/m2*s;所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖050g/L+琼脂010g/L+a-萘乙酸0.l5.Omg/L+6-节氨基嘌呤0.15.Omg/L，pH值为5.07.0;c、大规模培养将诱导出的铁皮石斛类原球茎在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期1024天，培养温度1030。C，光照时间024小时/天，光照强度0100iimo1/m2s;所述的大规模培养基为MS培养基+蔗糖2050g/L+a-萘乙酸0.15.Omg/L+6-节氨基嘌呤0.15.Omg/L，pH值为5.07.0。作为本发明组织培养铁皮石斛类原球茎的方法更优化的技术方案，对培养基的配方比例和培养条件进行优化选择。所述的丛生芽诱导培养培养周期1520天，培养温度2025。C，光照时间820小时/天，光照强度5080iimol/m2s;所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖2030g/L+琼脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-节氨基嘌呤2.03.Omg/L，pH值为5.56.5;所述的大规模培养培养周期1520天，培养温度2025"，光照时间820小时/天，光照强度5080iimol/m2s;所述的大规模培养基为MS培养基+蔗糖3040g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-节氨基嘌呤2.03.Omg/L，pH值为5.56.5。植物体的的无菌处理是本发明的重要技术环节，无菌处理的方法包括如下步骤a)将选取的铁皮石斛健康实生苗的幼茎，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；b)将铁皮石斛幼茎用7080%的酒精浸泡2040秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；c)将经过酒精灭菌的铁皮石斛幼茎用0.050.15%氯化汞溶液浸泡消毒36分钟，用无菌水冲洗45次，再用滤纸吸干无菌水；d)无菌条件下将氯化汞消毒的铁皮石斛幼茎剪成0.30.5cm2大小铁皮石斛组织，接种于诱导培养基中，每瓶接种5块。本发明的优点在于该方法容易操作，生产成本低，不污染环境，可以实现批量生产。选用配方合理的诱导培养基，愈伤组织的诱导率平均为99.6%，通过两段培养的方式铁皮石斛类原球茎产量大幅度提高，和野生铁皮石斛比较石斛多糖含量提高1倍以上。通过本发明方法生产铁皮石斛类原球茎，不变性，产量大，成本低，周期短，极具市场竞争力。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1:一种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，它包括如下步骤a、植物体的选择及无菌处理a)选择7月份生长的铁皮石斛野生健康实生苗的幼茎，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；b)将铁皮石斛幼茎用75%的酒精浸泡30秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；c)将经过酒精灭菌的铁皮石斛幼茎用0.1%氯化汞溶液浸泡消毒5分钟，用无菌水冲洗5次，再用滤纸吸干无菌水；d)无菌条件下将氯化汞消毒的铁皮石斛幼茎剪成0.30.5cm2大小铁皮石斛组织，接种于诱导培养基中，每瓶接种5块。b、组织诱导培养将经过无菌处理后的铁皮石斛组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，培养周期16天，培养温度2(TC，光照时间10小时/天，光照强度80Pmol/m2s;所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖28g/L+琼脂4.5g/L+a-萘乙酸2mg/L+6_苄氨基嘌呤3mg/L，pH值为5.5;c、大规模培养将诱导出的铁皮石斛类原球茎在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期18天，培养温度22t:，光照时间10小时/天，光照强度80ymol/m2s;所述的大规模培养基为MS培养基+蔗糖40g/L+a-萘乙酸2mg/L+6-苄氨基嘌呤3mg/L，pH值为5.5。实施例2:—种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，它包括如下步骤a、植物体的选择及无菌处理a)选择7月份生长的铁皮石斛野生健康实生苗的幼茎，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；b)将铁皮石斛幼茎用78%的酒精浸泡30秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；c)将经过酒精灭菌的铁皮石斛幼茎用0.12%氯化汞溶液浸泡消毒5分钟，用无菌水冲洗4次，再用滤纸吸干无菌水；d)无菌条件下将氯化汞消毒的铁皮石斛幼茎剪成0.30.5cm2大小铁皮石斛组织，接种于诱导培养基中，每瓶接种5块。b、组织诱导培养将经过无菌处理后的铁皮石斛组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，培养周期18天，培养温度25t:，光照时间18小时/天，光照强度60ymol/m2s;所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖25g/L+琼脂5g/L+a-萘乙酸3mg/L+6_苄氨基嘌呤2mg/L，pH值为6.0;c、大规模培养将诱导出的铁皮石斛类原球茎在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期20天，培养温度25t:，光照时间8小时/天，光照强度50ymol/m2*s;所述的大规模培养基为MS培养基+蔗糖30g/L+a-萘乙酸3mg/L+6-苄氨基嘌呤2mg/L，pH值为6.0。实施例3:对野生铁皮石斛、实施例1和实施例2培养得到的铁皮石斛类原球茎石斛多糖含量进行检测，具体检测方法包括如下步骤(1)提取称取野生铁皮石斛或铁皮石斛类原球茎适量，加入20倍体积的蒸馏水，在8(TC水浴下浸提2小时，过滤得提取液。残渣按上述步骤重复提取2次，合并三次提取所得滤液，待用。(2)5%苯酚溶液的配制称取苯酚100g，加铝片0.lg和碳酸氢钠0.05g，常压蒸5馏，收集182t:馏分。精密称取该馏分约10.0g置于200mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得5%(W/V)苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。(3)样品的测定取上述提取液，按适当比例稀释，精密吸取2ml具塞刻度试管中，加入5%苯酚溶液lmL，摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，摇匀，置IO(TC水浴中加热15min，冷水迅速冷却至室温。以2mL蒸馏水同法操作为空白，使用紫外分光光度计，测定波长为490nm处的吸光度A，代入标准曲线A=0.0153C-0.0122，求出样品多糖的葡萄糖浓度C(ug/ml)，按多糖含量(％)=CDf/W样X100X计算多糖含量。式中W样为样品重量；D为样品的稀释倍数；f为换算因子。所得样品多糖含量须>30%。通过该方法对野生铁皮石斛与上述两个实施例生产的铁皮石斛类原球茎样品石斛多糖含量的检测结果如下野生铁皮石斛与两个实施例石斛多糖含量的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>试验结果证明，采用本发明的方法生产的铁皮石斛类原球茎比野生铁皮石斛的石斛多糖含量高出2倍以上。实施例4:采用MS培养基、B5培养基和本发明的诱导培养基分别对通过无菌处理后的铁皮石斛小块组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，试验结果如下不同培养基诱导比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>试验结果证明，采用本发明的诱导培养基对通过无菌处理后的铁皮石斛小块组织进行诱导培养，组织鲜重和诱导率显著提高。实施例5:分别采用单纯的诱导培养基、单纯的大规模培养基和本发明的诱导培养基+大规模培养基两步法培养方法，进行组织培养生产铁皮石斛类原球茎试验，除了培养基和培养周期不同以外，其它试验条件与实施例1相同，试验结果如下采用不同方式的培养基对铁皮石斛产量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>试验结果证明，采用本发明的组织培养铁皮石斛类原球茎的方法比单纯使用诱导培养基培养、单纯使用大规模培养基培养产量增加2倍以上。权利要求一种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，它包括如下步骤a、植物体的选择及无菌处理选择6～8月份生长的铁皮石斛野生新鲜植株，除去根和叶进行清洗和无菌处理，选取实生苗的幼茎，将幼茎剪成0.3～0.5cm2大小铁皮石斛组织；b、组织诱导培养将经过无菌处理后的铁皮石斛组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，培养周期10～24天，培养温度10～30℃，光照时间1～24小时/天，光照强度0～100μmol/m2·s；所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖0～50g/L+琼脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值为5.0～7.0；c、大规模培养将诱导出的铁皮石斛类原球茎在培养基中进行大规模培养，培养周期10～24天，培养温度10～30℃，光照时间0～24小时/天，光照强度0～100μmol/m2·s；所述的大规模培养基为MS培养基+蔗糖20～50g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值为5.0～7.0。2.按照权利要求1所述的组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，其特征在于所述的丛生芽诱导培养培养周期1520天，培养温度2025。C，光照时间820小时/天，光照强度5080iimol/m2s;所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖2030g/L+琼脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-节氨基嘌呤2.03.Omg/L，pH值为5.56.5;所述的大规模培养培养周期1520天，培养温度2025。C，光照时间820小时/天，光照强度5080iimol/m2s;所述的大规模培养基为MS培养基+蔗糖3040g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-节氨基嘌呤2.03.Omg/L，pH值为5.56.5。3.按照权利要求1或2所述的组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，其特征在于植物体的的无菌处理方法包括如下步骤a)将选取的铁皮石斛健康实生苗的幼茎，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，置超净工作台内；b)将铁皮石斛幼茎用7080%的酒精浸泡2040秒进行表面灭菌，再用无菌水清洗干净；c)将经过酒精灭菌的铁皮石斛幼茎用0.050.15%氯化汞溶液浸泡消毒36分钟，用无菌水冲洗45次，再用滤纸吸干无菌水；d)无菌条件下将氯化汞消毒的铁皮石斛幼茎剪成0.30.5cm2大小铁皮石斛组织，接种于诱导培养基中，每瓶接种5块。全文摘要本发明公开了一种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，它包括植物体的选择及无菌处理、愈伤组织诱导培养和大规模培养三个环节，所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖20～30g/L+琼脂4～6g/L+α-萘乙酸2.0～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L；所述的大规模培养基为MS培养基+蔗糖20～50g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L。该方法易操作，有效成分含量高，生产成本低，不污染环境，可达到产业化水平。文档编号A01H4/00GK101715733SQ20101000076公开日2010年6月2日申请日期2010年1月19日优先权日2010年1月19日发明者贾景明申请人:烟台汇鹏生物科技有限公司