专利名称：水稻OsWRKY78基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻WRKY类转录因子基因0SWRKY78及其应用。
背景技术：
植物在进化过程中形成了复杂而精巧的调节机制以适应外界环境的多变性。通过 对内外环境变化的感知，由一系列的信号转导途径引起相关基因表达的调整，最终赋予植 物在生理上的适用性。在众多的适应性机制中，基因表达的转录调节起着重要的作用。转录 水平的基因表达调控是通过反式作用因子即转录因子(Transcription factor)与顺式作 用元件(cis-element)之间的特异识别、结合来激活或抑制相关基因的表达。另外转录因 子还可以通过蛋白-蛋白之间的相互作用调控相关基因的表达(JosSLuis Riechmarm等， 2000)。转录因子的DNA结合域决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定 了它对基因表达起激活还是抑制作用。根据DNA结合域的不同，转录因子被划分成众多家 族。近年来，已从植物中克隆到大量的转录因子，它们参与调控植物生长发育的各个方面以 及各种生物及非生物胁迫的防卫反应。其中的WRKY类转录因子在植物的生长发育和各种 胁迫应答方面发挥着重要的作用。从氨基酸组成来看，转录因子一股由DNA结合区、转录调控区(包括激活区或抑制 区)、寡聚化位点以及核定位信号这4个功能区域组成(Schwechheimer等，1998)。DNA结合 结构域(DNA-binding domain)是转录因子最关键的结构域，是转录因子识别DNA顺式作用 元件并与之结合的一段氨基酸序。植物转录因子中比较典型的DNA结合区有WRKY(Eulgem 等，2000) .AP2/EREBP (Riechmann等，1998)等。一股情况下，一个转录因子只有一个DNA结 合域或只有一个负责与DNA元件的结合，如WRKY蛋白家族中第I组成员具有两个WRKY结构 域，但只有羧基末端(C-末端)的WRKY结构域具有DNA结合活性(Eulgem等，2000)；转录调 ^！区(transcription regulation domain)(transcription activation domain)和转录抑制区(transcription repression domain)两种，它们决定了转录因子执 行何种功能；寡聚化位点(oligomerization site)是不同转录因子借以发生相互作用的 功能域；核定位信号(nuclear localizaion signal，NLS)是转录因子中富含精氨酸和赖氨 酸残基的区域，控制转录因子从细胞质进入细胞核(Raikhel等，1992)。目前鉴定的WRKY类基因，广泛参与了植物的生长发育调控、抗病反应、抗逆境胁 迫等。例如，拟南芥AtWRKY22和AtWRKY29位于MAPK激酶级联反应的下游，并且可以激活 对细菌和真菌性病害的抗性反应(Asai等，2002)；拟南芥AtWRKY33和烟草NtWRKY12均能 参与水杨酸抗病途径中PR1基因的表达(Andreasson等，2005 ；Verk等，2008)；超表达一些 WRKY基因，如AtWRKY70、NtWRKY12、0sffRKY13等能够显著提高植株对病菌的抗性(Li等， 2004 Jing 等，2009 ；Marcel 等 2008 ；Shimono 等，2007 ；Qiua,等 2009)。另外，一些 WYKY 转录因子在抗病中还起着负调控的作用，如拟南芥AtWRKYll和水稻0sWRKY45-l、0sWRKY62 均参与 了抗病过程的负调控(NoellieJournot-Catalino 等，2006 ；Tao 等，2009 ；Peng 等， 2009)。植物的非生物胁迫包括创伤、低温、干旱、盐害等。目前在植物中鉴定了一批参与
3这方面应答的11 1^转录因子。研究发现，拟南芥中的4〖11 1^11、15、22、33、44、53、60和烟草 中的WIZZ以及辣椒中的CaWRKY2参与了创伤应答(Chcong等，2002 ；Hara等，2000 ；Oh等， 2006)；大麦HvWRKY38不仅被冷和干旱所诱导表达，而且发现在百喜草(Paspalum notatum Flugge)中超量表达能够增强其耐旱性(Xin Xiong等，2009)；水稻中的0sWRKY45不仅能够 提高水稻对稻瘟病的抗性，而且在拟南芥中超表达能够提高拟南芥对盐和干旱的抗性(Qiu 等，2008)；超量表达水稻OsWRKYll和0sWRKY89能分别提高植株的耐旱和耐紫外线辐射的 能力(Wu 等，2009 ；Wang 等，2007)。在参与生长发育调控方面，拟南芥TTG2 (Transparent Testa Glabra2)是第一个 被鉴定参与植物绒毛体和种皮发育调控的WRKY基因(Johnson等，2002)；拟南芥WRKY基 因MIN13(AtWRKY10)参与了种子大小的形成调控(Luo等，2005 ;Zhou Y等，2009)；水稻 0sWRKY51和0sWRKY71参与了种子萌发时赤霉素信号转导的调控(Xie等，2006)；另外， WRKY转录因子也广泛参与了植物的衰老(如0sWRKY4、23、82)和代谢调控(如HvWRKY46、 38)等方面(Liu 等，2008 ； Jing 等，2009 ；Sun 等，2003，2005 ；Xie 等，2007)。水稻是我国最重要的粮食作物之一，也是禾本科植物研究的模式物种，具有十分 重要的生物学及经济学价值。水稻基因组测序的完成为对于在全基因组中鉴定与研究WRKY 基因奠定了良好的基础。WRKY家族成员众多，目前所取得的一些研究成果表明，已鉴定的 WRKY类基因几乎参与了调控植物生长发育、代谢、抗性的各个方面，如病害、干旱、高盐、低 温等生物和非生物胁迫以及体细胞胚发育、表皮毛形成或生化成分的变化等。通过对这些 生理生化途径与功能的研究将在一个全新的层次上为作物的高产、高抗和选优提供理论基 础。对WRKY转录因子的结构与功能的分析鉴定，是阐明在各种条件下基因表达调控机理的 重要内容之一，揭示转录因子之间及与DNA之间相互作用的具体机制，就可以人为地控制 特定基因的表达从而为育种研究提供有力的工具。
发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻中一个与生长发育相关的WRKY类基因0sWRKY78及
其应用。本发明所提供的一个水稻WRKY类转录因子，名称为WRKY78，是具有下述氨基酸残 基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID No 2 ；2)将序列表中SEQ ID No 2的氨基酸 残基序列经过一个或几个氨基酸残基的代换/或缺失和/或添加的蛋白质，或者其功能相 当于SEQ ID No2所示序列的亚片段。其中，SEQ ID No :2由618个氨基酸残基组成，其等电点为5.93，分子量为 66. 16KD。结构分析表明，该蛋白含有两个保守的WRKY结构域(WRKYGQK)，分别位于氨 基端第241至247位和415至421位氨基酸残基。另外，该蛋白还含有两个锌指结构域 (CX4CX22HXH，“X”表示任意核苷酸)，位于SEQ ID No :2的氨基端第261至291和435至 466位氨基酸残基。在SEQ ID No :2的氨基端第375至378位还含有一个核定位信号区。 该蛋白属于WRKY家族的第la组。上述0sWRKY78基因的cDNA，可具有下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列；2)蛋白序列表中SEQ ID No 1蛋白序列对应的DNA序列；3)与序列表中 SEQ ID No :1的cDNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
本发明还公开了 0sWRKY78基因在调控水稻生长发育中的应用。将0sWRKY78基因 导入水稻植株，制备转基因水稻，能改良水稻的形态，培育具优良株型的水稻新品种。含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及工程菌均属于本发明的保护范 围。可以利用已经克隆的0sWRKY78基因作探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选到本 发明的基因或同源基因，也可以利用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、 mRNA和cDNA中扩增得到本发明的0sWRKY78基因或同源基因序列。实验证明，本发明的水 稻0sWRKY78基因在正常水稻植株的茎秆和叶片中表达最高，其次是发育的种子中。另外， 0sffRKY78对低温、激素和盐处理有一定的响应。本发明的水稻0sWRKY78基因的RNA干涉 转基因植株变矮、剑叶直立、叶绿素含量提高，表明0sWRKY78参与调控水稻的生长发育。因 此，可通过基因工程等方法改变该基因的表达，在一定程度上的改良水稻的形态，培育具优 良株型的水稻新品种。
图1是实时定量RT-PCR检测0sWRKY78的相对表达量图2是0sWRKY78_GFP融合 蛋白的亚细胞定位3是0sWRKY78RNAi载体(A)和过量表达载体(B)示意4是 0sffRKY78RNAi转基因水稻植株中目的基因的RT-PCR分析5是0sWRKY78过表达(0EX) 转基因水稻植株中目的基因的RT-PCR分析图6是0sWRKY78RNAi水稻植株(A)和茎秆(B) 的形态特征7是0sWRKY78RNAi水稻籽粒的形态8是0sWRKY78RNAi水稻植株 (C8580和C8589)及未转化对照(WT)叶片叶绿素的吸收光谱。
具体实施例方式通过以下实例进一步对本发明进行了说明与定义而并非限制。通过实例，科研人 员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获 得不同的研究效果。实施例1 :0sWRKY78基因序列分析与克隆根据已发表的大麦WRKY类转录因 子 SUSIBA2 蛋白(又称为 HvWRKY46)的氨基酸序列，在 NCBI (http//www. ncbi. nlm. nih.gov/)网站通过BLASTP比对搜索，在水稻中找到了 SUSIBA2的同源基因，基因座为 0s07g39480 (0s07g0583700)，按照 Xie 等(2005)的命名规则，称为 0sffRKY78 (Gene bank Accession NO :AK070537)，在其他研究报道中又被称为0sWRKY70或0sWRKY59等。在水 稻基因组释义数据库(http://rice.plantbiology.msu. edu/index. shtml)中查询，发 现该基因位于水稻测序品种日本晴第7染色体上，含有6个外显子。根据预测，该基因全 长编码序列(CDS)为1857bp，它的5 ‘ UTR和3 ‘ UTR分别长47bp和425bp (序列表SEQ ID No 1)0该基因编码一条含有618个氨基酸残基的多肽(序列表SEQ ID No :2)。在 UniProtKB/Swiss-Prot网站上分析该多肽的结构特点，表明其等电点为5. 93，分子量为 66. 16KD。结构分析还表明，该蛋白含有两个保守的WRKY结构域(WRKYGQK)和两个锌指结 构域(CX4CX22HXH，“X”表示任意核苷酸)。根据Xie等(2005)的分类原则，0sWRKY78转录 因子归于WRKY超家族中第la组。根据Genbank登陆号AK070537(引自日本Rice Genome Resource)的序列设计引 物并作为模板以 STF1-1 (5-CAGGATCCGCAGCAATGGCCGATTCGCCAAA-3，下划线所示为 BamHI 酶
5切位点)与STF 1-2 (5-TAGAGCTCTCACGGACCCATGACTAA-3,下划线所示为SacI酶切位点)用 于扩增0sWRKY78基因全长cDNA序列。根据Genbank登陆号BK005212 (引自国家基因研究 中心)的序列设计引物并作为模板以W9P-F (5-GTAAGCTTCTCGCCTCCGAAACAACATG-3,下划线 所示为 Hindlll 酶切位点)与 W9P-R (5-ATCCATGGCTGCGGTTGCGCTGCGCTGCGCT-3,下划线所示 为Ncol酶切位点)用于扩增0sWRKY78基因启动子部分序列。通过PCR的方法从相应的克 隆中扩增获得了 0sWRKY78基因的全长编码区序列(CDS)和5’上游启动子区序列(ATG上 游2.0kb)，并通过分别克隆入pMD18-T (购自TaKaRa公司)载体上。阳性克隆送上海生物 工程有限公司测序，克隆序列经确认无误后用于后续实施例的各种载体构建与功能研究。实施例20sWRKY78的表达特征1、0sffRKY78转录水平的表达分析选取粳稻品种 日本晴不同生长发育时期的组织，用冷酚法抽提总RNA。将植物组织在液氮中研磨成粉 末，加入 5ml 抽提缓冲液(50mmol/l Tris-HCl pH9. 0，20mmol/l EDTA，1 % SDS)和等体积 的Tris缓冲液饱和的苯酚(预冷)，在冰上充分混勻lOmin。然后于4000rpm、4°C离心 20min,吸取上层水相，加入两倍体积的冰冷无水乙醇，在冰上混勻静置30min。再次离心 后，弃上清，沉淀用70%冷乙醇洗一次，然后置室温下自然晾干沉淀，再用1ml冰水溶解沉 淀，并加入1/3体积的8mol/l LiCl，混勻后于4°C放置过夜。第二天，在4000rpm、4°C离心 lOmin,用70%冰冷乙醇洗RNA沉淀两次后，在室温下晾干，然后溶解于适量的水中，再将 抽提的总RNA用Qiagen公司的RNeasy Plant Mini试剂盒进行纯化，再用DNasel (RNase free)除去总RNA中的DNA，溶解于无菌水中。纯化的总RNA在Eppendorf Biophotometer 分光光度计上测定浓度和纯度，并定容至1 P g/1 Pl，再用甲醛变性凝胶电泳检测所提 总 RNA 的质量。第一链 cDNA 的合成按照 Invitrogen 公司 SuperScript First-Strand Synthesis System试剂盒提供的操作规程与试剂，从每个样品中取5 y g总RNA，分别加入 liil 的 dNTP MixOligo(dT)，用 RNase-free 水补足至 10 u 1，于 65°C 加热变性，5min 后在 冰上快速冷却，然后依次添加 2 ii 1 10Xbuffer、4ii 1 MgC12、2ii 1 DTT 和 1 yl RNaseOut, 于42°C水浴2min后再加入1 y 1 SuperScript II反转录酶，再在42°C水浴50min，最后 在70°C加热15min终止反应。终止反应后于冰上冷却，并再加入1 P 1 RNase H除去残留 的RNA。实验中每个样品均设有未加反转录酶的对照，整个过程设有未加模板的对照(NTC， no-template control)监测系统污染。以引物 WRT-F (5-ATAAAGGGCGTCACAATCAC-3)和 WRT-R(5-GAACAGGCTCAATCAT ACCAG-3)进行扩增，在Eppendorf Master cycler 快速PCR仪 上进行。反应程序如下95°C、5min ；95°C、50sec，52°C，50sec，72°C、25sec，(15，20，25，30) 个循环，72°C、lOmin。PCR产物180bp，在1. 5%的琼脂糖凝胶电泳、成像分析。水稻内原基因 OsActinl(ACT-F 5-GGCATCACACCTTCTACAACGA-3 ；ACT-R :5_ACACCATCACCA GAGTCCAACA-3) 作为内参，以评价总RNA的一致性。通过半定量RT-PCR检测了 0sWRKY78的表达特性。结 果表明，0sffRKY78在水稻植株的各个组织及其不同发育时期都有表达，但在不同组织或同 一组织不同发育时期间存在较明显的差异。其中，在茎中的转录水平最高，其次是叶片。为了进一步定量分析0sWRKY78的表达量，在ABI公司PRISMTM 7700 SequenceDetector上进行了荧光实时定量PCR分析。荧光实时定量RT-PCR反应在96孔 PCR板中进行，利用引物WRT-F和WRT-R进行扩增，同时水稻内原基因OsActin 1作为内参。 20ii 1 的反应体系包括10ii 1 2 X SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA)、5，和3，端引物(3 u mol/1)各1 yl和lng的第一链cDNA模板。反应条件如下:50°C,2min ;95°C，lOmin ;95°C，15s ;60°C，lmin ；共 40 个循环。结果显示，OsWRKY78 基因在莲中 的相对表达量最高，其次为叶，根和叶鞘中也有一定的表达，这与上述半定量RT-PCR分析 结果较为一致。同时还发现，成熟叶片较新生叶片中的相对表达量要高，正在伸长中的茎比 已伸长茎中的表达量要高(图1)。2、0sffRKY78-GFP融合蛋白的亚细胞定位通过引物对STF1-1 (5-CAGGATCCGCAGCAA TGGCCGATTCGCCAAA-3，下划线所示为 BamHI 酶切位点)/STF1-5 (5-TATCTAGATCACGGACCCATG ACTAA-3下划线所示为Xbal酶切位点)，以含目的基因全长cDNA序列的克隆AK070537为 模板扩增0sWRKY78基因编码序列，连入pMD18-T载体，测序验证后，双酶切(Ncol和Xbal) 并回收该片段，随后与经过双酶切(BamHI和SacI)的含0sWRKY78⑶S的pMD18_T载体相 连，以构建含有新的酶切位点(BamHI/Xbal)的全长⑶S。与此同时，以载体pM0N30049 (含 绿色荧光蛋白GFP编码序列，购自Monsanto公司)为模板，用引物GFP-F (5-CATCTAGAACCA TGGGCAAGGGCGAG-3，下划线所示为 Xbal 酶切位点)/GFP-R(5_GTGAGCTCACTTGTAGAGTTCATCC A-3，下划线所示为SacI酶切位点)扩增出绿色荧光蛋白(GFP)全长编码序列(⑶S)，连入 PMD18-T载体，测序验证。双酶切(Xbal和SacI)含GFP的pMD18_T载体，回收片段连入经 双酶切的重组PMD18-T载体，完成两段序列的融合。最后通过BamHI和SacI切下该片段连 入双元载体P3003 (本实验室购建保存)中，经酶切以及PCR的方法筛选鉴定阳性克隆，构 建命名为0sWRKY78: :GFP。同时以质粒Ubi: :GFP作为对照。选择洋葱里面新鲜的鳞叶切成小块(2cm长宽)，置于MS培养基上。使洋葱鳞叶的 内表面(要轰击的一面)朝上。放黑暗培养过夜。取适量金粉用50 1无菌水洗两次。 用 50 ？？ 1 无菌水重悬。依次加入 5 ？ 1 质粒 DNA(1 ？ g/ ？ 1)，15 ？？ 1 2. 5M CaCl2 和7 ？？ 1 0. 1M亚精胺(每加完一样，可振荡2-3s)，振荡3min，冰上10m。lOOOOrpm离心 10 20s，弃上清。加80 1无水乙醇，振荡重悬，lOOOOrpm离心10 20s，弃上清。用 10 1无水乙醇定容。重悬待用。把包裹好的DNA轰击进洋葱表皮细胞后，继续放黑暗培 养过夜后，在 Confocal laser-scanning microscope (Carl Zeiss LSM510)上观察洋葱表 皮细胞。有研究表明，当蛋白质分子量超过50kDa时，就不能通过物理扩散作用进出核孔。 GFP本身分子量小于50kDa，能够自由通过核孔，而0sWRKY78蛋白自身分子量为66. 16kDa， 因此WRKY78: :GFP融合蛋白不可能通过物理作用进入核孔，只有在特定的核定位信号肽作 用下才能进入细胞核中。实验结果显示，转化0sWRKY78::GFP融合基因的洋葱表皮细胞中 只在细胞核内观察到绿色荧光；而只含有GFP基因的细胞中，绿色荧光信号弥散于细胞各 个部位(图2)。该结果证明了 0sWRKY78蛋白定位于细胞核内。据此可以推测0sWRKY78蛋 白是调控基因表达的反式作用因子，在细胞核中起作用。实施例30sWRKY78转基因水稻的获得与鉴定1. 0sWRKY78_RNAi载体的构建。通过在NCBI数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)中作同源比对，选定了 0sffRKY78基因第3外显子中420bp的一段特异序列作为构建干涉载体的目的片段。通过 设计含有特定酶切位点的引物STF1-F (5-CCACTAGTACTGTAGGCTTCTGCTATC-3,下划线所示为 Spel 酶切位点)和 STFl-R(5-CAGGATCCAGTAGTTGCCACACCATCAT-3，下划线所示为 BamHI 酶 切位点)将该段序列扩增出来，电泳后利用胶回收试剂盒回收目的片段，并克隆到PMD18-T 载体上，在经过测序确认无误后，用双酶切(Spel和BamHI)消化经过扩增的含有目的片段 的质粒(pMD18-T)和中间载体pl022 (本实验室购建保存)。酶切产物经电泳后，回收目的片段和切开的载体P1022，通过连接酶连接两片段，并导入大肠杆菌DH5 a中。挑选阳性克 隆鉴定后，再次双酶切(Bglll和Xbal)鉴定过的质粒，随后与双酶切(Spel和BamHI)过 的目的片段再次相连后，同样导入大肠杆菌DH5 a中扩增并鉴定。鉴定的阳性克隆再经过 BamHI和SacI双酶切后与经过同样酶切的双元载体p3003相连(载体示意图见图3A)，经 大肠杆菌扩增后并通过酶切以及PCR的方法筛选鉴定阳性克隆，并导入农杆菌中。2. 0sffRKY78超量表达载体的构建通过双酶切(BamHI和SacI)含有0sWRKY78全 长CDS的pMD18-T载体，回收目的片段，并与经相同酶切的含有玉米泛素基因Ubi启动子 (2.0kb长)的双元载体P3003相连接(载体示意图见图3B)，导入大肠杆菌扩增后，通过酶 切以及PCR的方法筛选鉴定阳性克隆，抽提质粒，将载体导入农杆菌中。3.转基因水稻的鉴定将构建好的载体通过农杆菌介导的水稻转化程序(刘巧泉 等，1998)，导入到粳稻品种日本晴中，通过一系列的筛选与培养，最后每个载体都获得了超 过20个的独立转化子。首先采用了离体叶片潮霉素抗性检测法(刘巧泉等，2001)对转基 因水稻作初步筛选。对TO代转基因植株的检测结果显示绝大多数转基因水稻植株的叶片 在含潮霉素的检测液中都能保持新鲜绿色，由此说明潮霉素抗性基因在大多数水稻植株中 都能正常表达。进一步利用潮霉素通用引物HP1/HP2对这些水稻植株进行PCR扩增，证明 潮霉素抗性检测阳性的植株，PCR鉴定依然为阳性。综合上面的分析，再生的转基因水稻植 株绝大多数都是阳性。经过2-3代的选择，筛选获得了比较稳定的多个纯合转基因系，以 用于后续的分析。RNAi转基因植株命名为C8580、C8589、C8620，超表达转基因植株命名为 C8640、C8648、C8754。为了明确转基因植株中目的基因的表达是否已改变，对转基因水稻植株总RNA进 行了半定量RT-PCR分析。选择部分T2或T3代纯合转基因植株，选取开花后15天的未成 熟籽粒30-40粒，提取胚乳总RNA，根据材料与方法所述反转录成第一链cDNA，用跨越内含 子的引物WRT-F和WRT-R进行RT-PCR分析。结果显示，与正常的未转化亲本(wild type, WT)相比，3个RNAi转基因植株(C)中0sWRKY78的表达明显下降(图4)，而在超表达转基 因植株(0EX)中表达明显升高(图5)，与预期的结果较为一致。实施例4转基因调控0s WRKY78表达对水稻植株生长发育的影响1.转基因水稻 农艺性状分析将选育的上述RNAi或超量表达转基因水稻幼苗移栽入田间，在营养生长期 与未转化对照并无明显的表型差异。但是在抽穗后期，发现几乎所有的TO代RNAi植株的 穗茎不能完全抽出，存在着包穗现象，而超表达转基因植株能正常抽穗。随后调查了转基因 水稻的T1和T2代的农艺性状，发现RNAi植株与未转化亲本相比，植株从地表到剑叶顶的 高度并没有差异，但到穗顶的高度明显变矮(图6A)，呈极显著差异。进一步分析发现RNAi 植株的倒一和倒二茎节间长度变短(图6B)，与亲本和阴性对照系相比也表现出极显著的 差异，分析由此造成了包穗现象。籽粒性状分析表明，RNAi转基因植株稻谷颖壳色泽较亲 本要深，但长、宽、厚并没有差异但糙米粒长度明显变短(图7)，而宽度和厚度方面并没有 变化。这些结果表明0sWRKY78基因在水稻植株的发育尤其是茎秆的伸长和种子的发育过 程中起着重要的调控作用。2.转基因水稻光合色素吸收光谱分析性状调查显示，0sffRKY78-RNAi植株剑叶较 亲本对照更为坚挺，直立，且叶色较深(图6A)。而超表达植株，株高并无改变，但叶片与干 涉植株相反，稍微变软，且不挺立。因此在齐穗期，取最新的一张完全叶，称取水稻植株新鲜叶片0. lg，剪成2mm长的片段，加入80 %的丙酮，在25mL容量瓶定容。在黑暗处浸提48h 后，浸提液用UltroSpeC2000型紫外-可见分光光度计分别测定了光合色素的吸收光谱。结 果表明与亲本相比，2个独立的RNAi植株叶片光合色素在各个光波长度下的吸收值都比亲 本要高(图8)，说明干扰植株叶片的叶绿素含量较亲本有了提高，同时也表明0sWRKY78基 因在水稻发育过程中参与各方面的调控。
权利要求
一种水稻WRKY类转录因子WRKY78，它的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.一种由权利要求1所述的转录因子WRKY78衍生的蛋白质，其特征在于，它的氨基酸 序列是在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个到十个氨基酸残基，并且具有 与WRKY78相似功能。
3.一种编码WRKY78的基因0sWRKY78，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
4.权利要求3所示的0sWRKY78基因在调控水稻生长发育中的应用。
全文摘要
本发明属于农业技术领域，涉及水稻WRKY类转录因子基因OsWRKY78及其应用。所说的水稻WRKY类转录因子WRKY78，它的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。编码WRKY78的基因OsWRKY78，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明的水稻OsWRKY78基因的RNA干涉转基因植株变矮、剑叶直立、叶绿素含量提高，表明OsWRKY78参与调控水稻的生长发育。因此，可通过基因工程等方法改变该基因的表达，在一定程度上的改良水稻的形态，培育具优良株型的水稻新品种。
文档编号A01H5/00GK101875690SQ20101024918
公开日2010年11月3日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者于恒秀, 刘巧泉, 张昌泉, 顾铭洪 申请人:扬州大学