专利名称：过表达Rps23r1基因的转基因小鼠模型的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因模型，具体涉及一种在大脑中特异性过表达Rps23rl基因 的转基因小鼠模型的构建方法。
背景技术：
阿尔茨海默氏老年痴呆症(Alzheimer，s disease,AD)是最常见的一种神经退行 性疾病，严重危害人类健康。大脑中由淀粉样蛋白(Αβ)小分子多肽聚集所形成的细胞 外淀粉样斑和由神经细胞内微管结合蛋白tau高度磷酸化所形成的神经元纤维缠结是AD 的两个重要病理特征。大量实验证据表明淀粉样蛋白(Αβ)的大量生成和聚集是引发 阿尔茨海默氏老年痴呆症的关键原因，而tau蛋白的高度磷酸化也参与了某些神经退行性 疾病的发生。因此鉴定那些能够影响淀粉样蛋白(Αβ)产生和tau蛋白磷酸化的新基 因蛋白并阐明其作用机理，对于开发治疗老年痴呆症的药物，具有非常重要的意义。Rps23rl基因是在小鼠中由于一个核糖体蛋白组分基因ribosomal protein S23(Rps23)发生返座(retroposition)后起源而来，但其生理功能还不清楚。本申请人 (Zhang Yff,Liu S,Zhang Χ,Li WB,Chen Y,Huang X，Sun L，Luo W,Netzer WJ，Threadgill R, Wiegand G, Wang R, Cohen SN, Greengard P, Liao FF, Li L, Xu H. (2009)A functional mouse retroposed gene Rps23rl reduces Alzheimer' s β -amyloid levels and tau phosphorylation. Neuron 64 :328_340.)最近的研究发现，Rps23rl 基因所编码的 RPS23R1 蛋白在过表达时，可以同时抑制β-淀粉样蛋白(Αβ)的产生和tau蛋白的磷酸化。进一 步的分子机制研究表明，RPS23R1蛋白可以通过和腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)相 互作用，促进腺苷酸的合成，从而提高蛋白激酶A(PKA)的活性。PKA活性的升高可以抑制糖 原合成酶(GSK3)的活性，进而抑制β-淀粉样蛋白(Αβ)的生成和tau蛋白的磷酸化。本申请人在前期构建的一种由人源Thy-I基因启动子驱动的Rps23rl过表达的转 基因小鼠，在体内证实了 RPS23R1蛋白对β-淀粉样蛋白(Αβ)生成和tau蛋白磷酸化的 抑制作用。但是由于人源Thy-I基因启动子对于外源基因表达的驱动能力不是太强，在这 些小鼠中过表达的RPS23R1蛋白水平只相当于内源RPS23R1表达水平的1倍。因此为了更 方便有效地研究Rps23rl基因在大脑中的生理及病理功能，有必要构建新型的Rps23rl转 基因小鼠，使用更强的启动子如朊蛋白(Prion)基因的启动子来高表达RPS23R1蛋白。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种在大脑中特异性过表达Rps23rl基因的转基 因小鼠模型的构建方法。本发明的第二个目的在于提供一种载体质粒MoPrP. Rps23r 1，所述MoPrP. Rps23rl载体质粒包含Rps23rl基因片段。所述Rps23rl基因的序列如下atgcagagcc aacagagaaa cattggctac tttaaccacc ttaaagcgga ctccaggaat 60
atcacctaca gcatgacctt ttcgacgaaa tccagcaacc agaacttcat cattttcctc 120aatgaagttc aggcagccat cattgggcac gaacgctgtg atcttcttcc cgttcttaat 180gagctgcacc ctgacgcact tcctgatggc agaatttggc tgtttggcct caacccctac 240tttttccagc acaattccct ttgcatgaga ggcaccccca aacggattgg ccttcagggc 300tgtgcccaag tgggctttct tgtactgttt gtcatgccac ttctgatccc gtcggtgact 360gcggagcttc cgggcagttc ggagaccacg acacttgccc atcttgccgg cgccacgggc 420ccctaa426所述过表达Rps23rl基因的转基因小鼠模型的构建方法包括以下步骤1) Rps23rl基因片段的克隆；2)将所述Rps23rl基因插入到MoPrP载体质粒，构建携带Rps23rl基因的MoPrP. Rps23rl载体质粒。3)将MoPrP. Rps23rl载体质粒经限制性内切酶酶切后所得到的包含有小鼠朊蛋 白(Prion)基因的5’端启动子片段和3’端转录非翻译片段，以及Rps23rl基因片段的整 个DNA片段进行显微注射到小鼠的受精卵中，得到过表达Rps23rl基因的转基因小鼠模型。本发明构建的Rps23rl转基因小鼠模型的基因组中稳定整合了外源的Rps23rl 基因，可以遗传给后代，并且能够在小鼠的大脑中过表达带有Myc标记的外源RPS23R1蛋 白。所述Rps23rl转基因小鼠在长期观察中没有发现其他异常变化，为在体内研究评价 Rps23rl的生理和病理功能提供了有效的手段。
图1为MoPrP.Rps23rl质粒载体的构建及酶切示意图。在图1中，将带有 MyC-RpS23rl基因的PCR片段，以及带有小鼠朊蛋白(Prion)基因的5’端启动子片段 (PrP-5，)和3，端转录非翻译片段(PrP-3，)的MoPrP质粒，分别用限制性内切酶XhoI进 行酶切后，所得到的片段进行再连接，形成新的MoPrP. Rps23rl环状质粒。再经限制性内切 酶NotI进行酶切，获得用于显微注射的DNA片段。图2为Rps23rl转基因小鼠基因型鉴定PCR结果。在图2中，以从不同小鼠尾部 提取的基因组DNA为模板，用引物对Myc-Fr和MoPrP-Rev进行PCR扩增，有阳性扩增产物 的即为Rps23rl转基因小鼠。FO，Fl和F2分别指原代、子一代和子二代小鼠。图3为RPS23R1蛋白在Rps23rl转基因小鼠和对照小鼠中的表达情况。在图3中， 分别从clone 1和clone 2小鼠系的子二代小鼠，各取2只对照小鼠和2只Rps23rl转基 因小鼠。收集其大脑组织样品，用裂解液裂解后，等蛋白量的样品用4% 20%聚丙烯酰胺 凝胶电泳进行分离，再用抗Myc抗体进行免疫印记，研究带有Myc标记的外源RPS23R1蛋白 的表达情况。
具体实施例方式Rps23rl基因转基因小鼠模型的构建方法主要包括(1) Rps23rl基因片段的克隆设计带有XhoI限制性内切酶酶切位点，针对Myc标记的5’端引物 XhoI-Myc—5 (5，-gcg ctcgag cccacc atggcatcaatgcagaagctg—3，)，禾口带有 XhoI 限帝[Jf生内切酶酶切位点，针对Rps23rl基因末端的3’端引物XhoI-Rps23rl_3 (5’ -gcg ctcgag ttaggggcccgtggcgccggca-3‘)。以申请人前期构建的人源Thy-I基因启动子驱动的 Rps23rl转基因小鼠的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。所获得的PCR产物经纯化测序验 证具有序列表所示的DNA序列，即为Rps23rl基因片段。(2)将Rps23rl基因片段克隆到MoPrP质粒，构建携带Rps23rl基因的MoPrP. Rps23rl质粒载体将所获得的Rps23rl基因的PCR片段，以及带有小鼠朊蛋白(Prion)基因的5’端 启动子片段和3’端转录非翻译片段的MoPrP质粒分别用限制性内切酶XhoI进行酶切后， 所得到的片段进行再连接，形成新的环状质粒(如图1所示)。以新得到的环状质粒DNA为 模板，用位于Myc标记部位的5’端引物Myc-Fr (5’ -caccatggcatcaatgcagaag-3’ )和位于 朊蛋白(Prion)基因3，端转录非翻译片段区域的3，端引物MoPrP-Rev(5，-gtggataccccc tcccccagcctagacc-3’)进行PCR扩增。有阳性PCR产物扩增出来的环状质粒即为Rps23rl 基因以正确方向插入的目标MoPrP. Rps23rl质粒载体。(3)Rps23rl转基因小鼠的构建将MoPrP. Rps23rl质粒用限制性内切酶NotI进行酶切，获得携带有小鼠朊蛋白 (Prion)蛋白基因的5’端启动子片段和3’端转录非翻译片段，以及Rps23rl基因片段的整 个DNA片段，将该DNA片段显微注射到小鼠的受精卵，然后将受精卵移植到假孕小鼠的输卵 管中，在子宫内发育至出生，获得2个原代转基因小鼠系(clone 1和clone 2)，再将原代 小鼠FO与野生型小鼠交配而产生后代小鼠Fl、F2。在Fl中，clone 1系和clone 2系的 Rps23rl转基因小鼠与对照小鼠的出生比例分别为16 14和13 17。在F2中，该比例 分别为42 38和45 41。而且在Fl和F2中都没有观察到Rps23rl转基因小鼠表现出 早死或形态/行为的异常。这些结果表明Rps23rl转基因不影响小鼠的正常发育生长。(4)在大脑中过表达Rps23rl的转基因小鼠的鉴定小鼠出生后，剪取鼠尾提取基因组DNA，用引物对Myc-Fr和MoPrP-Rev进行PCR扩 增，有阳性扩增产物的即为Rps23rl转基因小鼠。FO，Fl和F2分别指原代、子一代和子二 代小鼠(参见图2)。取Rps23rl转基因小鼠和对照小鼠的大脑组织样品，用裂解液裂解。等蛋白量的 样品进行4% 20%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后将蛋白质电转移至尼龙膜，加入一抗 (鼠抗Myc单克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology公司)进行杂交，洗膜后再用二抗(带 有HRP的羊抗鼠IgG，Sigma公司)进行杂交，洗膜后用化学发光剂(ECL)显色。结果显示 在获得的2个新的Rps23rl转基因小鼠系中，clone 1小鼠系在大脑中有带有Myc标记的外 源RPS23R1蛋白过量表达。而clone 2小鼠系的基因组中虽然整合有外源Rps23rl基因， 但其大脑中外源的RPS23R1却没有表达(参见图3)。
权利要求
一种在大脑中特异性过表达Rps23r1基因的转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤1)Rps23r1基因片段的克隆，所述Rps23r1基因片段的序列如下atgcagagcc aacagagaaa cattggctac tttaaccacc ttaaagcgga ctccaggaat 60atcacctaca gcatgacctt ttcgacgaaa tccagcaacc agaacttcat cattttcctc120aatgaagttc aggcagccat cattgggcac gaacgctgtg atcttcttcc cgttcttaat180gagctgcacc ctgacgcact tcctgatggc agaatttggc tgtttggcct caacccctac240tttttccagc acaattccct ttgcatgaga ggcaccccca aacggattgg ccttcagggc300tgtgcccaag tgggctttct tgtactgttt gtcatgccac ttctgatccc gtcggtgact360gcggagcttc cgggcagttc ggagaccacg acacttgccc atcttgccgg cgccacgggc420ccctaa 4262)将所述Rps23r1基因插入到MoPrP载体质粒，构建携带Rps23r1基因的MoPrP.Rps23r1载体质粒；3)将MoPrP.Rps23r1载体质粒经限制性内切酶酶切后所得到的包含有小鼠朊蛋白Prion基因的5’端启动子片段和3’端转录非翻译片段，以及Rps23r1基因片段的整个DNA片段进行显微注射到小鼠的受精卵中，得到过表达Rps23r1基因的转基因小鼠。
2. 一种载体质粒MoPrP. Rps23rl，其特征在于所述MoPrP. Rps23rl载体质粒包含 Rps23rl基因片段。
全文摘要
过表达Rps23r1基因的转基因小鼠模型的构建方法，属于转基因模型，具体涉及一种在大脑中特异性过表达Rps23r1基因的转基因小鼠模型的构建方法。通过克隆Rps23r1基因，构建重组质粒，注射到小鼠的受精卵中，得到过表达Rps23r1基因的转基因小鼠。所述过表达Rps23r1基因的转基因小鼠的基因组中稳定整合了由小鼠朊蛋白Prion基因启动子驱动的Rps23r1基因，可以稳定遗传给后代并能在大脑中表达带有Myc标记的外源RPS23R1蛋白。所述Rps23r1转基因小鼠在长期观察中没有发现其他异常变化，为在体内研究评价Rps23r1的生理和病理功能提供了有效的手段。
文档编号A01K67/027GK101942446SQ201010249169
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者孙良武, 张云武, 许华曦, 陈耀民, 黄秀梅 申请人:厦门大学