专利名称：早春短命植物绵果荠的高效再生植株获得的方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域。具体的说，本发明涉及植物组织培养技术领 域。
背景技术：
短命植物是对生长在干旱荒漠地带的一类生活周期或年生长期很短的特殊植物 类群的总称(Risser and Cottam，1968 ； Mulroy and Rundel, 1977 ；张立运，1985;黄培 祜，2002)。主要分布在中亚、西亚、北非、北美、南美和地中海沿岸等地的荒漠地带 (Went, 1948 ； Shreve, 1951 ；阿略兴，1954 ；谢尼阔夫，1954 ； Rooyen et al., 1992 ； Telenius，1993 ； Hegazy and Elamry, 1998 ； Wilby and Shachak, 2000 ； Gutterman, 2001)，中亚为其分布中心之一(毛祖美和张佃民，1994;黄培祜，2002)。我国短命植 物只分布于新疆北部荒漠(尤其是准噶尔荒漠)及其毗邻的草原带(潘伟斌和黄培祜， 1991)。每年春季3月下旬开始大量短命植物萌动破土，到5月有些地方短命植物盖度可 以达到50%以上，能够有效地阻止地表风沙流动，即春季新疆北部地区沙漠稳定沙面的 主要贡献者和沙漠受干扰破坏后植被入侵的先锋植物，在荒漠植物群落中具有重要地位 和生态价值(王雪芹等，2003)。短命植物还是一类很有价值的资源，它们是新疆春秋季 牧场中的优良春季牧草。很多种类是我国北方地区早春花卉及园林绿化美化的优良种质 资源，少数种又是传统中药药材。此外，据张立运(2002)的报道，短命植物是一类光合 效率高、物质积累快、营养周期短的植物资源。但是，到目前为止，国内外对短命植物 组织培养方面的研究尚未报道。绵果荠(Lachnolomalehnannii Bge.)是十字花科绵果荠属(LachnolomaBge.)，
该属为单种属。是分布于亚洲中部的干旱、半干旱沙荒地和盐碱地的一年生早春短命 植物，在我国仅分布于新疆北部。花期5月，果期6月，植株较小，株高约10-20cm， 全珠多毛，果实为短角果四棱状卵形，果皮厚而硬及果皮外有绵毛(马素卿和潘秀敏， 1987)。此外，绵果荠具有生活周期短、萌发期早、基因结构简单(2n = &= 14)、较强 的抗盐、耐旱性等特性(刘嫫心，1987)，是一种特殊的潜在遗传资源。人类可以应用高 生物技术(体细胞杂交、原生质体融合、转基因等)手段、利用这一潜在遗传资源，培育 生长期短，具有较强的抗逆性的粮食作物、蔬菜、牧草、花卉新品种和新种类。组织培养是植物生物技术的必要前提和最理想手段。它一方面可为遗传工程提 供理想的受体材料，另一方面可为常规的植物改良程序提供一种新的手段，从而使很多 用传统方法难以解决的问题迎刃而解，更多更快更好地创造出各种林木、农作物和园艺 植物的新品种、新类型和新种类，是一类新资源开发利用和种质资源保存的先锋手段。 这不仅能解决资源短缺的困难，而且具有许多农业栽培所不具备的优点(Trigianoand Gray, 2000 ； Razdan, 2002)。因此，在人类面临能源危机、资源短缺、环境污染日益严 重的情况下发挥着重要的作用。所以，本发明以短命植物绵果荠为研究材料，建立它的高效再生体系具有如下重要意义一是可为以短命植物为材料，应用组织培养技术，进行新资源开发利用及短命 植物种质保存提供研究材料和重要理论依据。二是“生命与地球环境的协同演化”是当今世界地球科学与生命科学相互交叉 的重大前沿科学主题。近年来，随着我国西部荒漠生态环境的不断恶化以及生态建设问 题的日益突出，短命植物以其独特的生物学、生态学特性已经引起了国内有关部门及学 者的高度重视。但目前为止，该类在植物组织培养方面尚未报到。因此，研究短命植物在组织培养方面研究具有重大而赋予现实的意义。
发明内容
针对短命植物在组织培养方面研究空白的技术现状，本发明旨在提供一种早春 短命植物绵果荠高效再生体系建立的方法，填补了短命植物在现有技术中组织培养方面 的技术空白，解决绵果荠的自然繁殖率低而面临灭绝威胁的问题，更加缩短生长发育周 期，获得人工培养条件和培养基下的离体再生植株。本发明通过以下技术方案实现的以绵果荠为研究材料，通过不同的外植体、 生长调节剂、糖浓度和培养条件对其愈伤组织的诱导及其增殖、芽的分化和根诱导的影 响研究，并不同的基质和再生苗的前处理对再生苗移栽成活率的影响进行比较，建立绵 果荠愈伤组织诱导及植株再生的最佳体系，从而得到早春短命植物绵果荠的高校再生植 株的方法。本发明具体提供了一种早春短命植物绵果荠高效再生体系建立的方法，包括以 下步骤1)无菌材料的备用；2)在愈伤组织的诱导中，选用子叶为外植体，生长调节剂配方为MS+l.Omg/1 IBA+O.lmg/IBAP,在黑暗条件下进行愈伤组织培养，蔗糖浓度为3%或4%;3)在愈伤组织的增殖中，选用子叶为诱导出来的愈伤组织的增殖对象，生长调 节剂配方为 MS+l.Omg/1 IBA+O.lmg/1 BAP ；4)在不定芽的分化中，子叶愈伤组织分化的生长调节剂配合方式为MS+0.5mg/ L IBA+l.Omg/L KT和MS+O.lmg/L IBA+2.0mg/L BAP,下胚轴的愈伤组织分化的生长调 节剂配合方式为 MS+O.lmg/L IAA+1.0mg/L BAP ；5)在不定根的诱导中，选用配方为l/2MS+0.1mg/LNAA ；6)在植株再生培养中，选在分化培养基里分化的愈伤组织接种到已筛选出的分 化培养基中培养，观察植株再生情况，培养温度22°C-24°C、光照强度2000Lx、光照时 间为16h/d。本发明中，选用现有技术中常用的不同植物生长调节剂IAA，2，4-D，NAA， IBA和BAP都为本领域熟知的，可以通过公众途径获得，其中，IAA代表吲哚乙酸，2， 4-D代表2，4-二氯苯氧乙酸，NAA代表奈乙酸，IBA代表吲哚丁酸，BAP代表苄基氨
基嘌呤。通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果1.发明弥补了短命植物在现有技术中组织培养方面的技术空白，解决绵果荠的自然繁殖率低而面临灭绝威胁的问题，更加缩短生长发育周期，获得真正人工培养条件 和培养基下的离体再生植株。本发明并为以短命植物为材料，应用植物生物技术，进行 新资源开发利用及短命植物种质保存提供了研究材料和重要技术方案。2.在本发明提供的早春短命植物绵果荠再生体系中，选用的生长调节剂配合为 MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP,该配合的愈伤组织诱导率达到了 100%，诱导出来的愈 伤组织的手感为松脆(易碎)、颜色为绿色、产生量大、诱导期很早(6_9d)。3.在本发明提供的早春短命植物绵果荠再生体系中，选用的子叶愈伤组织分化 的生长调节剂配合方式为 MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L KT 和 MS+0.1mg/LIBA+2.0mg/ LBAP,该配方的不定芽诱导率分别为80.00(士8.16) %和77.78(士 11.11) %，平均每块 愈伤组织诱导芽数分别为5.33 (士0.62) %和5.00 (士0.37) %。 下胚轴的为MS+O.lmg/L IAA+1.0mg/L BAP,该处理的分化率为 91.67 (士8.33) %，平均芽数为 6.45 (士0.68)。4.在本发明提供的早春短命植物绵果荠再生体系中，选用的不定根诱 导中，发根率最佳的配方选用l/2MS+0.1mg/LNAA，该处理不定根的诱导率为 80.00 (士 13.33) %，平均根长为 4.05 (士 0.42) cm。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在 下述的说明中，如无特别说明，％皆指质量百分比。本发明以现有的组织培养技术为发明基础。本发明所使用的生长调剂是日本 Sigma公司的、琼脂粉是美国Sanland公司的，MS培养基所使用的试剂和蔗糖是中国天 津化学试剂有限公司和上海蓝季科技发展有限公司生产的分析纯。本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实 施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例一无菌材料的备用培养基选用10X大量元素母液、100X铁盐母液、100X微量元素母液、 100 X有机物(维生素)母液不同培养基，配制MS (Murashige and Skoog, 1962)培养基， 不添加任何生长调节剂，所述培养基包含3%蔗糖和0.6%琼脂粉，pH值均调为6.0，用 150mL三角瓶分装，每瓶约50mL。分装后放入灭菌锅，在1.2X 104kg/m2(121°C )下灭 菌20min，取出，放平，冷却备用。无菌苗的培育成熟的绵果芥果实采集于新疆阜康彩南。果实采摘后，在室温 下贮藏备用。取粒大饱满、无病虫害的种子先自来水冲2-3min，然后在无菌条件下70% 乙醇浸泡l.Omin，无菌水冲4-5次，0.1 %升汞消毒1.5min，无菌水冲3_5次，接种MS基 本培养基。先培养在温度为5-15°C白天/晚上、光照为16h、湿度为70-80%的培养箱 4-5d，种子萌发出来了以后转移到温度为23士 1°C、光照为16h、湿度为70-80%的培养 室培养10d。培育的14-15d的健康无菌苗选用愈伤组织诱导。实施例二愈伤组织的诱导本试验以建立一个绵果荠愈伤组织诱导的最佳体系为目的，把绵果荠下胚轴与子 叶作为外植体，把现有技术中常用的不同植物生长调节剂(IAA，2，4-D, NAA，IBA， BAP)的不同浓度和组合方式对其愈伤组织的诱导及其生长的影响进行了比较研究。
1.愈伤组织诱导中不同外植体和不同生长调节剂的筛选绵果芥种子萌发到14-15d后，把无菌苗的下胚轴和子叶分别切成0.5cm长、 0.5X0.3cm2面积，并接种附加现有技术中不同植物生长调节剂(IAA，2，4_D，NAA, IBA，BAP)的MS培养基及无加任何植物激素的MS基本培养基作为对照(CK)，参见 见表1。所有培养基包含3%蔗糖和0.6%琼脂粉，PH值均调为6.0，在1.2X104kg/ m2(121°C)下进行了灭菌20min(Shirinetal.，2007)。培养基放在温度为23 士 1°C、湿度为 70-80%的黑暗条件下进行25d的培养。每18d更换培养基，培养基更换中把褐化的、污 染外植体或愈伤组织被去掉(Kabiretal.，2008)。25d统计愈伤组织诱导率和分析质量。表1.生长素和细胞分裂素的不同浓度及其配合方式
权利要求
1. 一种早春短命植物绵果荠再生体系建立的方法，其特征在于，所述的通过选用不 同外植体、生长调节剂，选用不同的糖浓度和培养条件，对早春短命植物绵果荠的愈伤 组织的诱导、增殖、芽的分化和根的诱导培养和植株的再生，具体包括以下步骤1)无菌材料的备用；2)在愈伤组织的诱导中，选用愈伤组织的外植体为子叶，生长调节剂配方为 MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP,在黑暗条件下进行愈伤组织培养，蔗糖浓度为3%或4% 时；3)在愈伤组织的增殖中，选用子叶为诱导出来的愈伤组织的增殖对象，生长调节剂 配方为 MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP ；4)在不定芽的分化中，子叶愈伤组织分化的生长调节剂配合方式为MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L KT和MS+O.lmg/L IBA+2.0mg/L BAP,下胚轴的愈伤组织分化的生长调节 剂配合方式为 MS+O.lmg/L IAA+1.0mg/L BAP ；5)在不定根的诱导中，选用配方为l/2MS+0.1mg/LNAA;6)在植株再生培养中，选在分化培养基里分化的愈伤组织接种到已筛选出的分化培 养基中培养，观察植株再生情况，培养温度22°C-24°C、光照强度2000Lx、光照时间为 16h/d。
全文摘要
本发明公开了一种早春短命植物绵果荠再生体系建立的方法，通过以不同的外植体、生长调节剂、糖浓度和培养条件对其愈伤组织的诱导及其增殖、芽的分化和根诱导的影响，并以不同的基质和再生苗的前处理对再生苗移栽成活率的影响进行比较，确定选用愈伤组织的外植体为子叶，生长调节剂配伍为MS+1.0mg/l IBA+0.1mg/l BAP，在黑暗条件下进行组织培养，蔗糖浓度为3％或4％，建立绵果荠愈伤组织诱导及植株再生的最佳体系，从而得到早春短命植物绵果荠的高效再生植株的方法。解决绵果荠的自然繁殖率低而面临灭绝威胁的问题，更加缩短生长发育周期，获得真正人工培养条件和培养基下的离体再生植株，具有广泛的应用价值。
文档编号A01H4/00GK102007868SQ201010274418
公开日2011年4月13日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者廖康, 满苏尔, 谭敦炎 申请人:新疆农业大学