用于降低反刍动物的胃肠产甲烷作用的组合物的制作方法

专利名称：用于降低反刍动物的胃肠产甲烷作用的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及反刍动物的饲料添加剂和补充剂领域。更具体而言，本发明涉及借助于在摄入的饲料的正常发酵期间竞争甲烷微生物所需的氢原子的抑制剂来降低反刍动物的胃肠产甲烷作用。本发明提供包含所述抑制剂的饲料补充剂和饲料组合物，以及它们用于降低产甲烷作用的非治疗性用途。
背景技术：
产甲烷作用是瘤胃发酵过程期间氢(H2)清除的主要途径(Beauchemin et al.， 2008)。从瘤胃环境除去H2对于瘤胃发酵的有效延续很重要，但是由产甲烷作用产生的甲烷则涉及动物饲料能量的损失(Johnson and Johnson, 1995)以及促使全球变暖的重要温室气体(Steinfeld et al.，2006)。这两个问题均使得全球寻求减少反刍动物的甲烷产生的饲料添加剂。
降低甲烷释放的研究选择之一是将过量的H2重新导入产生更多对反刍动物有益的产物的过程中，由此降低产甲烷作用。实例包括通过加入丙酸前体刺激产丙酸作用 (propiogenesis)，以及向瘤胃中引入还原性产乙酰作用(acetogenesis)的尝试(Joblin， 1999,Molano et al.，2008)。成功地将这些过程引入瘤胃会分别产生作为动物营养的丙酸或乙酸，同时降低产甲烷作用的H2的有效性。然而，引入丙酸前体(苹果酸和富马酸)对甲烷产生造成不确定的效果(Asanuma et al.，1999，Ungerfeld et al.，2007)，并且目前向瘤胃中引入还原性产乙酰作用的尝试由于与产甲烷作用相比对氢的较低亲和力而失败(Le Van et al. ，1998)。
降低甲烷释放的其他选择描述于US 5，843，498，其涉及用于抑制瘤胃产甲烷作用和改善饲料效率的反刍动物饲料组合物，所述组合物包含作为有效组分的半胱氨酸和/或其盐。
少数研究组研究了硝酸盐作为甲烷降低饲料添加剂的潜力，而且添加硝酸盐看起来一致地降低产甲烧作用(Guo et al. ,2009, Sar et al.，2005，Takahashi et al.，1998)。
引入硝酸盐(N03)作为替代性氢降低剂(sink)以减少瘤胃中的产甲烷作用的可能性被极大忽略，这是由于始终发现硝酸盐在瘤胃中还原成氨期间所形成的作为中间产物的亚硝酸盐的毒性效果(Lewis，1951)。据报导反刍动物饲料中的高剂量硝酸盐导致高铁血红蛋白血症，从而降低血液将氧气运输至动物组织的能力。此外，已知瘤胃中的亚硝酸盐积累降低瘤胃中的微生物活性，这又降低动物的饲料摄入。
已经建议向高硝酸盐饲喂的反刍动物补充甲酸盐、乳酸盐或富马酸以缓解亚硝酸盐对发酵的抑制效果(Iwamoto，1999 ；Iwamoto，2001)。与单独的硝酸盐处理相比，同时给予硝酸盐和GOS或乳链菌肽还报导为降低瘤胃和血浆亚硝酸盐和高铁血红蛋白浓度的有效措施，同时将瘤胃产甲烷作用保持在低水平(Sar，2004)。
利用益生素加速亚硝酸盐还原已经得到广泛研究。美国专利第6，120，810号教导通过给予动物包含有效量的亚硝酸盐还原微生物产丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidiproprionici)的组合物来减少反刍动物的硝酸盐中毒。欧洲专利申请第1 630 226号公开一种用于反刍动物的饲料组合物，其包含具有亚硝酸盐还原酶活性的微生物， 所述微生物选自肠细菌、棒状杆菌、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、嗜甲基菌属 (Methylophilus)的细菌、放线菌属(Actinomyces)的细菌、瘤胃细菌以及上述细菌的组合。还据报导(Sar，2005)大肠杆菌W3110可以用于减轻使用硝酸盐抑制反刍动物的产甲烷作用时的中毒。
已经研究了硫化合物、铜和钨对硝酸盐还原的抑制效果(Takahashi，1989)。其作者报道，在来自硝酸盐适应的阉羊(0.55g NaN03/kg体重，每天两次)的瘤胃液中，亚硝酸盐形成不受用硫酸盐-S孵育，也不受用亚硫酸盐-S孵育的影响。在含S氨基酸中，据证实甲硫氨酸在抑制硝酸盐的微生物还原中是无效的，而半胱氨酸则显著地减少亚硝酸盐形成。这篇文章没有涉及或提出任何产甲烷作用降低效果。半胱氨酸在防止亚硝酸盐积累中的效率则在后续研究中得到证实(Takahashi，1991 ；Takahashi 1998)。
本发明的主要目的是提供用于降低反刍动物的产甲烷作用，同时避免或克服与亚硝酸盐积累有关的具体问题的处理方法及其中所用的组合物。
发明概述
在一方面，如下文的实验部分所详述，本发明在于发现，硝酸盐还原途径以及硫酸盐还原途径在反刍动物中胜过胃肠产甲烷作用，并且硝酸盐和硫酸盐单独使用时所获得的产甲烷作用降低效果是完全加成的。硝酸盐和硫酸盐的单独效果看起来是独立的。
同时，如下文的实验部分所详述，据发现，联合给予硝酸盐和硫酸盐完全有效地避免或缓解通常单独使用硝酸盐所遇到的亚硝酸盐中毒的潜在问题。
令人惊讶的是，尽管据发现给予硝酸盐降低肠甲烷微生物数目，但是给予硫酸盐或联合给予硝酸盐和硫酸盐却不这样。然而，联合给予硝酸盐和硫酸盐明显地降低总细菌中甲烷微生物的比例。
尽管本发明的范围不受任何此类潜在理论或假设的限制或缩减，但是认为通过硝酸盐降低产甲烷作用(方程式1)是由硝酸盐还原成氨中替代使用H2而导致的。据认为，瘤胃中硝酸盐还原采用方程式2所述的还原途径。这表明，8摩尔的H重定向至硝酸盐还原， 由此理论上对于饲喂的每摩尔硝酸盐，减少1摩尔的甲烷产生。以这种方式，饲喂的每IOOg 的N03会减少25. 8g的CH4。
C02+4H2 — CH4+2H20 (方程式 1)
N03>4H2+2H+ — NH4++3H20 (方程式 2)
硝酸盐还原成氨比CO2还原成CH4产生更多的能量，因此如果瘤胃中有足够的硝酸盐，则预期其可以是H2清除的主要途径。NO3完全还原成NH3消耗8个电子，因此每摩尔还原的硝酸盐降低1摩尔甲烷排放。反应的终产物氨可以视为对低蛋白饲料饲喂的反刍动物有价值的营养。
如上文所述，本发明人发现硫酸盐自身还是通过与硝酸盐还原无关的机制有效降低甲烷排放的强还原剂。硫酸盐还原成H2S(方程式3)也消耗8个电子，因此提供与每摩尔硝酸盐降低甲烷排放相同的潜力。
S042>4H2+2H+ — H2S+4H20 (方程式 3)
硫酸盐也有效地降低产甲烷作用这一发现可以由热力学角度的事实来解释，硫酸盐还原比产甲烷作用可能更容易发生。从化学计量比而言，IOOg硫酸盐完全还原成硫化氢会减少16. 7g CH4产生。
硫化氢( 看起来在NO2还原成NH4+中充当电子供体，因此向饲料补充硫酸盐可以额外地缓解瘤胃中的亚硝酸盐积累。
而且还发现，通过额外给予有效量的亚硝酸盐还原益生微生物甚至可以进一步增强这种结果。如下文的实验部分所详述，在亚硝酸盐还原开始的时候观察到硫酸盐引起的初始延滞，这可以通过饲料摄入后立即可得的的延滞来解释。这又导致饲料摄入的减少，因此本发明的另一目标是避免这种情况。如下文的实验部分所详述，本发明人发现这可以通过共给予某些亚硝酸盐还原益生微生物来实现。


图1示出接受基础饲料或三种实验饲料之一的雄性Texel杂交羔羊中随Mh (小时)时间段的甲烷产生(1/hr)，所述实验饲料补充了硝酸盐化合物、硫酸盐化合物或者硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。
图2示出接受基础饲料或三种实验饲料之一的雄性Texel杂交羔羊中随24h时间段的氧气消耗(1/kg MW/hr)，所述实验饲料补充了硝酸盐化合物、硫酸盐化合物或者硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。
图3示出接受4种实验饲料之一的奶牛(cow)血液中的高铁血红蛋白的浓度，所述实验饲料补充了硝酸盐或者硝酸盐和量渐增的硫酸盐的三种组合之一。
图4示出用各种测试产品模拟的瘤胃中的气体产生。图A-C示出所示时间点的累积气体产生。误差棒表示重复模拟容器之间的SE，星号表示包含Ca(NCXB) 2+MgS04的对照 (表示为“无”)与t检验的统计学差异。
图5表示用各种测试产品模拟的瘤胃中的甲烷产生。图A表示12小时模拟后的累积甲烷产生，图B表示所有产生的气体中的甲烷比例。误差棒表示重复模拟容器之间的 SE，星号表示包含Ca(N03)2+MgS04的对照(表示为“无”)与t检验的统计学差异。
图6表示用各种测试产品模拟的瘤胃中硝酸盐的残留浓度。图A-C分别表示2、4 和12小时发酵后的硝酸盐的残留浓度。误差棒表示重复模拟容器之间的SE，星号表示包含 Ca(N03)2+MgS04的对照(表示为“无”)与t检验的统计学差异。
图7表示用各种测试产品模拟的瘤胃中亚硝酸盐的残留浓度。图A-C分别表示2、 4和12小时发酵后的亚硝酸盐的残留浓度。误差棒表示重复模拟容器之间的SE，星号表示包含Ca(N03)2+MgS04的对照(表示为“无”)与t检验的统计学差异。
图8表示用各种测试产品模拟的瘤胃中铵的残留浓度。图A-C分别表示2、4 和12小时发酵后的铵的残留浓度。误差棒表示重复模拟容器之间的SE，星号表示包含 Ca(N03)2+MgS04的对照(表示为“无”)与t检验的统计学差异。
发明详述
本发明的第一方面涉及一种动物饲料补充剂，其包含10-100%的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。
在本文及其权利要求书中，动词“包含”及其变形以非限制性的含义使用，表示包括该词语之后的物品，但是不排除未特别指出的物品。此外，不定冠词“一个(a)”或“一个(an) ”所指的元素不排除存在多于一个所述元素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个所述元素。不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”因此通常表示“至少一个”。
本文所用的术语“动物饲料补充剂”表示包含活性成分的浓缩的添加剂预混合物 (premix)，所述预混合物或补充剂可以加入动物饲料或口粮中以形成本发明的补充饲料。 术语“动物饲料预混合物”、“动物饲料补充剂”和“动物饲料添加剂”通常视为具有类似或相同的含义，并且通常视为可以互换。通常，本发明的动物饲料补充剂为粉末或者压缩或颗粒固体的形式。实际上，家畜通常可以通过将动物饲料补充剂直接加入口粮来进行饲养，如所谓的施肥(top-dress)；或者所述动物饲料补充剂可以用于制备或制造诸如复合动物饲料或舔块(lick block)的产品，这在下文会有更详细的描述。本发明并不特别地局限于此。 本发明的补充剂通常以16-2500g/动物/天的量饲喂动物。
本发明的动物饲料补充剂包含硝酸盐化合物，通常是生理可接受或耐受的硝酸盐化合物。根据本发明，硝酸盐-N需要对于通过瘤胃或肠微生物还原是容易可得的，并且所述硝酸盐化合物在水中应当具有足够的溶解度。因此，根据本发明，所述硝酸盐化合物优选为离子硝酸盐化合物，最优选无机硝酸盐，例如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵，这些盐在标准温度和压力下全部都易溶于水。此外，从健康和安全的角度出发，通常优选使用复合无机硝酸盐，例如式5. Ca(NO3)2 · NH4NO3 · IOH2O所表示的化合物，其可商购自Yara，商品名为 “Calcinit”。
本发明的动物饲料补充剂还包含硫酸盐化合物，通常是生理可接受或耐受的硫酸盐化合物。根据本发明，所述硫酸盐化合物优选为离子硫酸盐化合物，最优选选自无机硫酸盐，其中除了硫酸钙以外，许多是高度溶于水的。特别优选地，本发明的硫酸盐化合物选自可溶性无机硫酸盐，包括硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜和硫酸亚铁。
在本发明的优选实施方案中，所述补充剂包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其基于干重的量为IO-IOOwt %，优选地，所述量大于10、20、30、40、50、60、70、80、90、 95、97 或 99wt%。
由于本发明部分地基于这样的发现，对于降低反刍动物中的胃肠产甲烷作用的目的，硝酸盐和硫酸盐是部分地可交换的，所述补充剂中硝酸盐和硫酸盐的摩尔比通常为 100 1-1 50，更优选 50 1-1 10,25 1-1 5 或 10 1-1 2. 5，最优选 5:1-1: 1。
本发明的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合通常提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于50g/kg。在优选的实施方案中，所述硝酸盐和硫酸盐的总量大于75g/kg， 更优选大于90g/kg，最优选大于100g/kg。实际上，所述量通常小于750g/kg。在另一优选实施方案中，所述饲料补充剂中硫酸盐的量基于干重大于25g/kg，更优选大于40g/kg，最优选大于50g/kg。通常，所述量不大于250g/kg，优选不大于200g/kg，最优选不大于165g/ kg。在另一优选实施方案中，所述饲料补充剂中的硝酸盐的量基于干重大于20g/kg，更优选大于30g/kg，最优选大于40g/kg。通常，所述量基于干重小于600g/kg，更优选小于550g/kg ο
本领域技术人员应当理解，除非另外指明，本文所用的“硝酸盐”和/或“硫酸盐” 的所有量和/或剂量指硝酸盐和/或硫酸盐化合物所包含或提供的相对于组合物总干重的硝酸盐和/或硫酸盐的重量。确定所述补充剂所包含的组分的确切的理想量以及用于制备口粮或复合动物饲料等的补充剂的量，属于训练的专业人员的技能，例如考虑动物的具体类型及其所保持的环境。每种组分的优选剂量如下文所示。
本发明的动物饲料补充剂可以包含任何其他成分而不偏离本发明的范围。其通常可以包含制备期望的产品形式所需的已知赋形剂，并且其可以包含旨在改善饲料的质量和 /或改善消耗补充剂的动物的性能的其他添加剂。这样的赋形剂的合适实例包括载体或填充剂，例如乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、碳酸氢钠、氯化钠等；以及粘合剂，例如阿拉伯树胶、黄蓍胶、藻酸钠、淀粉、PVP和纤维素衍生物等。本领域技术人员已知的饲料添加剂的实例包括维生素、氨基酸和微量元素、消化增强剂以及肠道菌群稳定剂等。
在一优选实施方案中，所述动物饲料补充剂还包含亚硝酸盐还原益生微生物。如上文所解释的，本文所用的术语“亚硝酸盐还原益生微生物”指这样的活微生物，当以合适的量给予时其通过将在瘤胃和/或肠中积累的亚硝酸盐还原成铵来赋予宿主健康益处。这样的亚硝酸盐还原微生物的许多实例为本领域技术人员已知。亚硝酸盐还原益生微生物的优选实例包括具有亚硝酸盐还原酶活性的瘤胃细菌和肠细菌、产丙酸丙酸杆菌、 棒状杆菌、枯草芽胞杆菌、嗜甲基菌属的细菌、放线菌属的细菌和大肠杆菌(Escherichia coli)W3110。根据本发明，最优选地，亚硝酸盐还原益生微生物选自埃氏巨球形菌 (Megasphaera elsdenii)，特别是其瘤胃菌株；以及产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)，特别是产丙酸丙酸杆菌菌株P5，其在美国典型培养物保藏中心(ATCC) 的微生物保藏登录号为昍467，并且可以以“Bova-Pro concentrate”商购自Agtech Products Inc0
在一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的动物饲料补充剂，其还包含所述亚硝酸盐还原益生微生物，其量基于干重为1. 0*108-1. 0*1014cfu/kg，更优选 1. 0*109-1. 0*1013cfu/kg，最优选 1. 0*1010-1. 0*1012cfu/kg，例如 1. 0*10ncfu/kg。本领域技术人员已知，集落形成单位(CFU)是活细菌或真菌数的量度。与计数所有死和活细胞的直接显微镜计数不同，CFU测量活细胞，并且例如通过将(稀释的)样品在琼脂或胰胨豆胨琼脂平板在扩充并计数由此获得的菌落而测定。
而且，本发明人发现当给予乳酸或乳酸盐化合物时获得良好的结果。在不期望被任何具体理论束缚的情况下，认为补充乳酸或乳酸盐可以增强益生微生物的效率。因此，在一优选实施方案中，本发明提供上文所定义的复合动物饲料，其还包含有效量的乳酸盐或乳酸，优选地，所述复合动物饲料所包含的乳酸或乳酸盐的量基于干重大于20g/kg，更优选大于30g/kg，最优选大于40g/kg。
本发明的另一方面涉及诸如复合动物饲料和舔块的产品，其包含上文所定义的补充剂。
因此，在一方面，本发明提供了一种复合动物饲料组合物，其包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，所述组合提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于10g/kg。
本文所用的术语“复合动物饲料组合物”表示这样的组合物，其适合用作动物饲料，并且从各种天然或非天然基质或原料和/或添加剂混合而成。因此，特别地，本文使用术语“复合”来区分本发明的动物饲料与任何天然存在的原料。这些混合物或复合饲料根据靶动物的具体需求而进行配制。商业制备的复合饲料所用的主要成分通常包括小麦麸； 稻麸；玉米粉；谷粒，如大麦、小麦、黑麦和燕麦；大豆粉；苜蓿粉；小麦粉等。商业复合饲料通常包含不低于15%的粗蛋白和不低于70%的可消化的总营养，尽管本发明并不特别地局限于此。液体、固体以及半固体复合动物饲料组合包括于本发明的范围内，固体和半固体形式是特别优选的。这些组合物通常制备为粉末形式、颗粒或碎屑。实际上，通常饲喂家畜复合饲料的组合例如本发明的复合饲料和青贮饲料或干草等的组合。通常，复合动物饲料以0. 3-10kg/动物/天的量进行饲喂。确定所述复合动物饲料所包含的这些组分合适量属于训练的专业人员的技能，例如考虑动物的类型及其所保持的环境。
本发明的复合动物饲料中硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合通常提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于10g/kg。在一优选实施方案中，所述硝酸盐和硫酸盐的总量大于15g/kg，更优选大于17. 5g/kg，最优选大于20g/kg。实际上，所述量通常小于750g/ kg，优选小于500g/kg，更优选小于250g/kg。在另一优选实施方案中，所述复合动物饲料中硫酸盐的量基于干重大于5g/kg，更优选大于7. 5g/kg、10g/kg或12g/kg。通常，所述量不大于200g/kg，优选不大于175g/kg，最优选不大于150g/kg。在另一优选实施方案中，所述复合动物饲料中硝酸盐的量基于干重大于5g/kg，更优选大于7. 5g/kg，最优选大于IOg/ kg。通常，所述量基于干重小于600g/kg，更优选小于500g/kg，最优选小于250g/kg。而且，在一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的复合动物饲料，其还包含亚硝酸盐还原益生微生物，其量为 1. 0*108-1. 0*1014cfu/kg，更优选 1. 0*109-1. 0*1013cfu/kg，最优选 1. O^lO10-I. 0*1012cfu/kgo而且，在一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的复合动物饲料，其还包含有效量的乳酸盐或乳酸，其量优选大于5g/kg，更优选大于7. 5g/kg，最优选大于10g/kg。
本发明的复合动物饲料组合物可以包含本领域常用的任何其他饲料添加剂。本领域技术人员已知，该语境中的术语“饲料添加剂”指动物营养中所用的产品，其用于改善饲料的质量和动物来源的食物的质量，或者改善动物的性能，例如提供饲料材料增强的可消化性。非限制性实例包括工艺添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、酸性调节剂和青贮饲料添加剂；感官添加剂，特别是调味剂和着色剂；(其他)营养添加剂，如维生素、氨基酸和微量元素；以及(其他)畜牧学添加剂，如消化增强剂和肠道菌群稳定剂
本领域技术人员应当清楚，本发明的复合动物饲料组合物可以包含任何其他成分或添加剂，而不偏离本发明的范围。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的补充剂的舔石(lick stone)或舔块。本领域技术人员已知，这样的舔石或舔块特别方便用于向在天然或耕作牧场或者天然和耕作牧场放牧的反刍动物饲喂无机补充剂(以及蛋白质和碳水化合物)。除了本发明的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合和任选的亚硝酸盐还原益生微生物以外，本发明的这样的舔石或舔块通常包含各种类型的粘合剂，例如水泥、石膏、石灰、磷酸钙、碳酸盐和/或明胶; 以及任选地包含其他添加剂，例如维生素、微量元素、无机盐、感官添加剂等。
本发明的舔块中的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合通常提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于15g/kg。在一优选实施方案中，所述硝酸盐和硫酸盐的总量大于 25g/kg，更优选大于30g/kg。实际上，所述量通常小于450g/kg，优选小于400g/kg。在另一优选实施方案中，所述舔块中硫酸盐的量基于干重大于3g/kg，更优选大于5g/kg，最优选大于6g/kg。通常，所述量不大于150g/kg，优选不大于100g/kg，最优选不大于75g/kg。在另一优选实施方案中，所述舔块中硝酸盐的量基于干重大于10g/kg，更优选大于20g/kg，最优选大于25g/kg。通常，所述量基于干重小于400g/kg，更优选小于300g/kg。在一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的舔块，其还包含亚硝酸盐还原益生微生物，其量为 1. 0*108-1. 0*1014cfu/kg，更优选 1. 0*109-1. 0*1013cfu/kg，最优选 1. 0*1010_1· 0*1012cfu/kg
本发明的另一方面涉及一种降低反刍动物的胃肠甲烷产生的方法，所述方法包括向所述反刍动物给予有效量的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其中所述方法是非治疗性的。
本文所用的术语“降低胃肠产甲烷作用，，指降低胃肠道中的甲烷气体产生。如上文所解释的，反刍动物的瘤胃和肠中的发酵通过所谓的甲烷微生物产生甲烷气体。本发明意图降低这一过程，从而降低胃肠道的直接甲烷排放。评价动物的甲烷排放在本领域技术人员的知识和技术范围内。如上文所解释的，瘤胃和肠中的甲烷产生是通常发生在健康动物中的过程，并且降低产甲烷作用并不增强或削弱反刍动物的整体健康状态或生活质量 (well-being)。然而，利用硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合降低甲烷形成可以增加动物营养利用的效率，从而本发明的方法可以增强动物生长和/或产率。
本领域技术人员应当容易地理解，本发明的处理方法在治疗称为“膨胀病”的疾病状况中是无效的。膨胀病是通常描述为由于瘤胃中的气体积累而产生的瘤胃异常膨胀。气体(二氧化碳、甲烷和其他气体)通常在瘤胃发酵过程中产生，并且通常通过食道排出，从而防止气体积累。在膨胀病发病期间，食道被一层泡沫堵塞。如果感觉到液体(或泡沫)， 则食道的开口包含阻塞食道的受体。膨胀病期间形成的泡沫源自小饲料颗粒的快速发酵。 膨胀病的原因是泡沫的形成，并非是瘤胃气体的产生，瘤胃气体的产生是反刍动物中天然存在的过程。因此，甲烷产生不能视为膨胀病的原因，并且降低甲烷不能视为治疗膨胀病。 针对膨胀病的治疗性处理旨在防止瘤胃中泡沫层的形成或除去泡沫层，而不是防止瘤胃气体的产生。而且，二氧化碳是瘤胃发酵期间产生的主要气体。因此，本发明的方法既不意图也不适合于治疗膨胀病或缓解其症状。
因此，本发明的处理方法是处理的非治疗性方法，即所述方法不改善患有特定疾病状况的动物的健康，即与不接受本发明的处理方法的反刍动物相比，其不预防特定的疾病或疾病状况，也不在任何程度上影响反刍动物的健康情况。如上文所述，本发明的方法的优势限于环境和/或经济方面。
从分类学上而言，反刍动物是偶蹄目的哺乳动物，其通过以下过程消化基于植物的食物首先将其在动物称为瘤胃的第一胃中软化，然后将现在称为食团的半消化的食物回流并再次咀嚼。再咀嚼食团以进一步破碎植物物质并刺激消化的过程称为“反刍”。反刍哺乳动物包括牛(cattle)、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、角马、羚羊、叉角羚和蓝牛羚。本发明主要涉及处理驯养的反刍动物的方法，特别是用于商业家畜饲养的反刍动物。因此，在本发明的一优选实施方案中，所述反刍动物选自牛、山羊、绵羊和水牛。
本发明的一优选实施方案提供了上文所定义的方法，其中向反刍动物给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其量提供大于每天0. 05g/kg体重的硝酸盐和硫酸盐的总剂量。在一优选实施方案中，本发明方法的所述硝酸盐和硫酸盐的总剂量为每天0. 05-10g/ kg体重，更优选每天0. l-5g/kg体重，最优选每天0. 2-2. 5g/kg体重。
在另一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的方法，其中硫酸盐的剂量为每天0. 025-1. 8g/kg体重，更优选每天0. 05-0. 9g/kg体重，最优选每天0. 1-0. 45g/kg体重。
在另一优选实施方案中，本发明提供了上文所定义的方法，其中硝酸盐的剂量为每天0. 025-8g/kg体重，更优选0. 05-4g/kg体重，最优选每天0. l_2g/kg体重。
本文所定义的每天每kg体重的量，指给定处理时间段期间各种化合物的平均量， 例如在一周或一个月的处理期间。因此，可以每天、每隔一天、每隔两天等给予所述化合物， 而不偏离本发明的范围。尽管优选地，所述方法包括每天给予指定剂量的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。甚至更优选地，在每次饲喂动物的饲喂期间给予所述组合物，以获得上述每日剂量的量进行给予。
如上文所解释的，瘤胃微生物菌落将之前未适应它们饲料中的硝酸盐的动物的硝酸盐还原成亚硝酸盐的能力，超过它们将亚硝酸盐还原成氨的能力。这可能导致瘤胃中亚硝酸盐的净积累，其容易通过瘤胃壁吸收并将血液血红蛋白从亚铁形式转化为三价铁形式即高铁血红蛋白，使得血红蛋白分子不能将氧气运送至组织。所导致的疾病状况即高铁血红蛋白血症是一般缺氧的状态，在轻度情况下，可以抑制动物的性能，但是在严重情况下， 可能导致动物死亡。本发明人确立，在本发明的方法中，在绵羊饲料中小心、逐步地引入硝酸盐允许瘤胃微生物菌落适应并提高它们还原硝酸盐和亚硝酸盐的能力。据证实，缓慢适应高硝酸盐饲料的绵羊不经历高铁血红蛋白血症的临床指征。因此，在本发明的一优选实施方案中，所述方法包括硝酸盐适应的第一阶段和继续处理的第二阶段所述第一阶段包括至少3天、优选至少4天、最优选至少5天的两个或更多个、优选三个或更多个连续时间段，其中每个时间段内的硝酸盐的平均每日剂量小于100%的在所述第二阶段给予的平均每日剂量，并且其中每个时间段内的平均每日剂量高于该时间段之前的时间段内的平均每日剂量。在一优选实施方案中，一个时间段至下一个时间段的硝酸盐评价每日剂量的增加小于每天lg/kg体重，优选小于每天0. 5g/kg体重，更优选小于每天0. 25g/kg体重，最优选小于每天0. lg/kg体重。优选地，所述第二阶段包括大于5、10、25、50、100、250或350天的给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合的时间段，其平均每日剂量为0. 15-3g/kg体重。
在一优选实施方案中，具有或不具有初始适应阶段的上述方法还包括向反刍动物给予上文所定义的亚硝酸盐还原益生微生物。特别优选的是，给予的所述益生微生物的量为每天1. O^lO5-L 0*1014cfu/kg体重，更优选每天1. O^lO7-L 0*1013cfu/kg体重，最优选每天1. O^lO9-L 0*1012cfu/kg体重。在一优选实施方案中，所述方法包括给予益生微生物和给予乳酸或乳酸盐。特别优选的是，给予的乳酸或乳酸盐的量为每天至少0. 025g/kg体重， 更优选每天0. 05-5g/kg体重，最优选每天0. 1-2. 5g/kg体重。
本发明的方法可以包括根据上文所述的剂量方案给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，以及任选地给予亚硝酸盐还原益生微生物，达至少5、10、25、50、100、250或 350天。如上文所述，本发明令人感兴趣的方面在于这样的事实，即本发明的方法提供了非常持续的降低肠产甲烷作用的效率，即该效果不随处理的延长时间段而降低，如由于瘤胃或肠微生物渐增的抗性，由此使得反刍动物的长期处理特别可行。
从上文明显可知，本发明的方法包括口服给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，以及任选地给予亚硝酸盐还原益生微生物。优选地，所述处理包括口服给予上文所定义的复合动物饲料组合物和/或动物饲料补充剂产品，本领域技术人员应当理解，即使可以使用其他液体、固体或半固体口服可吸收的组合物也不偏离本发明的范围。
根据上文，本发明的又一方面涉及包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合的组合物在非治疗性降低反刍动物的胃肠甲烷产生中的用途。优选地，所述用途包括向所述反刍动物给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其量提供的硝酸盐和硫酸盐的总剂量大于每天0.05g/kg体重。优选地，硝酸盐化合物和硫酸盐化合物所用的剂量如上文所述。在另一优选实施方案中，所述用途还包括向所述反刍动物给予亚硝酸盐还原益生微生物，其剂量如上文所述。仍然更优选地，本发明提供了上文所定义的组合物中的任一种在非治疗性降低反刍动物的胃肠甲烷产生中的用途。
本发明的另一方面涉及补充硝酸盐的反刍动物的治疗性处理。如上文所解释的， 已知反刍动物的补充硝酸盐有助于降低胃肠产甲烷作用，但是也增加亚硝酸盐积累即所谓的“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症的风险或发作，从而降低血液将氧气运送至动物组织的能力。此外，瘤胃中亚硝酸盐积累已知降低瘤胃中的微生物活性，这又可能降低动物的食物吸收。如上文所解释的，本发明人确立，向这样的补充硝酸盐的反刍动物给予硫酸盐化合物，优选地与亚硝酸盐还原益生微生物组合，大大降低或者甚至防止这些副作用。
因此，本发明的一方面涉及治疗或预防补充硝酸盐的反刍动物的亚硝酸盐积累、 “硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症的方法，所述方法包括向所述反刍动物给予有效量的硫酸盐化合物，任选地与有效量的亚硝酸盐还原益生微生物组合。
本发明的另一方面涉及包含硫酸盐化合物，任选地与亚硝酸盐还原益生微生物组合的制剂，其用于治疗或预防补充硝酸盐的反刍动物的亚硝酸盐积累、“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症的方法。
本发明的又一方面涉及硫酸盐化合物，任选地与亚硝酸盐还原益生微生物组合， 在制备用于治疗或预防补充硝酸盐的反刍动物的亚硝酸盐积累、“硝酸盐毒性综合征”和/ 或高铁血红蛋白血症的方法的制剂中的用途。
根据上文的描述，治疗和/或预防亚硝酸盐积累、“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症的方法通常包括给予所述组合物，其量足以提供的硫酸盐的总剂量为每天0. 025-1. 8g/kg体重，更优选每天0. 05-0. 9g/kg体重，最优选每天0. 1-0. 45g/kg体重； 以及任选的所述益生微生物，其总剂量为每天1. O^lO5-L 0*1014cfu/kg体重，更优选每天 1. O^lO7-L 0*1013cfu/kg体重；最优选每天1. O^lO9-L 0*1012cfu/kg体重。在一优选实施方案中，所述方法包括给予益生微生物和给予乳酸或乳酸盐。特别优选的是，给予乳酸或乳酸盐的量为每天至少0. 025g/kg体重，更优选每天0. 05-5g/kg体重，最优选每天0. 1-2. 5g/kg 体重。
本文所用的术语“补充硝酸盐的反刍动物”指通常通过饲喂接受大量硝酸盐的反刍动物。优选地，所述反刍动物补充的硝酸盐的量足以降低胃肠产甲烷作用，更优选的量大于每天0. 025g/kg体重，最优选为每天0. 05-8g/kg体重。本领域技术人员应当理解，所述方法可以等同地适合于治疗或预防反刍动物的亚硝酸盐积累、“硝酸盐毒性综合征”和/或高铁血红蛋白血症，所述反刍动物接受大量的硝酸盐用于其他目的或者甚至无意地接受， 例如由于环境条件。
上文所限定的发明在下文的实验部分会更详细地示例和解释，这并非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例1甲烷减少中的硝酸盐和硫酸盐
材料与方法
动物和豢养(housing)
在本实验中，评价了饲料硝酸盐和硫酸盐的甲烷降低性质。在4周的适应时间段内，向饲料缓慢引入硝酸盐和硫酸盐。在实验期间监测饲料摄入和生长。假设饲料硝酸盐和硫酸盐会降低肠发酵的甲烷排放。
Animal Care and Use Committee of the Animal Sciences Group,WUR,Lelystad 批准本实验的实验方案。实验用20头雄性Texel杂交羔羊进行，其重量在实验开始时为 42. 9士4. 3kg(平均值士标准偏差)。在对饲料添加剂的4周适应阶段中，将动物豢养于单独的牛棚中以允许单独饲喂。每周将绵羊称重以在整个实验期间监测生长。
适应时间段后，将4只动物(一组)豢养于间接呼吸量热室中一周来测定气体交换。在接下来的周中，每周将新的一组绵羊引入该室中。每个呼吸室容纳一只绵羊。所用的呼吸量热室详细描述于Verstegen et al. (1987)。将温度保持于15°C，相对湿度设定为 70%。一种类型的室的通气速率为701/min，其他类型的为901/min。
以9-min的间隔分析进出室的空气的C02、O2和CH4。通过进出空气之间的浓度差乘以气流来计算这些气体的净产生和消耗，随后再计算为标准环境(0°C，101kPa，无水蒸气)。
实验设计
实验设计为2x2阶乘设计，以硝酸盐和硫酸盐为因数。动物通过重量分组，随后在组内随机分配为四种饲料处理之一 C0N、NO3> SO4或N03+S04。
饲喂
基础饲料由基于DM的74%玉米青贮饲料、16%铡碎的大麦秸秆、9%甲醛处理的大豆粉以及矿物预混合物组成。饲料添加剂包含于混合物中(表1)，其以10%的饲料 DM加入基础饲料。在饲喂时，将预混合物手工混合成饲料。在实验期间自由取水。从可商购的来源(CalcinitJara)补充硝酸盐，并且以无水MgSO4的形式向饲料中加入补充的S04。
在适应阶段内，以每周25%的步骤将绵羊引入实验预混合物。每天8:30饲喂羔羊。早晨饲喂之前，从饲料筐除去残屑，并称重以确定主动饲料摄入。在呼吸室的一周内， 将饲料有效性限制为在豢养于呼吸室之前的一周中在组内消耗最少饲料的动物所消耗的饲料的95%。进行饲料限制以避免添加剂对DMI的效果与对甲烷产生的效果之间的相互作用。
将实验饲料中的硝酸盐换为对照饲料的尿素以保持等氮(isonitrogenous)饲料。向对照饲料中加入石灰石以保证处理之间相等的Ca摄入。向饲料中加入MgO以获得饲料之间相似的Mg水平。对于每个处理而言，向饲料的不同添加体积不同，并用木纤维素进行平衡。
表1 包含实验添加剂的混合物的组成(DM的％ )
权利要求
1.降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，所述方法包括向所述反刍动物给予有效量的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合。
2.如权利要求1所述的降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，其中向所述反刍动物给予的所述硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合的量提供的硝酸盐和硫酸盐的总剂量大于每天0. 05g/kg体重。
3.如权利要求2所述的降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，其中向所述反刍动物给予的所述硝酸盐化合物的量提供的硝酸盐的剂量为每天0. 025-8g/kg体重，并且其中向所述反刍动物给予的所述硫酸盐化合物的量提供的硫酸盐的剂量为每天 0. 025-1. 8g/kg 体重。
4.如权利要求1-3中任一项所述的降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，其还包括向所述反刍动物给予亚硝酸盐还原益生微生物，其量为l*105-l*1014cfu/kg/天。
5.如权利要求4所述的降低反刍动物的胃肠甲烷产生的非治疗性方法，其还包括向所述反刍动物给予有效量的乳酸盐化合物。
6.包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合的组合物用于非治疗性降低反刍动物的胃肠甲烷产生的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述用途包括向所述反刍动物给予硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其量提供的硝酸盐和硫酸盐的总剂量大于每天0. 05g/kg体重。
8.如权利要求5和6中任一项所述的用途，其中所述用途还包括向所述反刍动物给予亚硝酸盐还原益生微生物，其量为l*105-l*1014cfu/kg/大。
9.复合动物饲料，其包含硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，所述组合提供的硝酸盐和硫酸盐的总量基于干重大于10g/kg，并且所述硫酸盐的量基于干重大于7. 5g/kg。
10.如权利要求9所述的复合动物饲料，其中所述硝酸盐的量基于干重大于7.5g/kg。
11.如权利要求9或10所述的复合动物饲料，其还包含亚硝酸盐还原益生微生物，其优选地选自埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)和产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)。
12.动物饲料补充剂，其包含10-100%的硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，其中所述动物饲料补充剂中的硫酸盐的量基于干重大于25g/kg。
全文摘要
本发明涉及借助于在摄取的饲料的正常发酵期间竞争甲烷微生物所需的氢原子的试剂来降低反刍动物的胃肠产甲烷作用。本发明一方面在于发现硝酸盐还原途径以及硫酸盐还原途径在反刍动物胜过胃肠产甲烷作用，并且硝酸盐和硫酸盐的产甲烷作用降低效果是完全加成的。同时，据发现，联合给予硝酸盐和硫酸盐完全有效地避免或缓解通常单独使用硝酸盐所遇到的亚硝酸盐中毒的潜在问题，当需要时，所述效果通过加入亚硝酸盐还原益生微生物而进一步增强。因此，本发明提供这样的产品，其包含大量硝酸盐化合物和硫酸盐化合物的组合，和任选地，亚硝酸盐还原益生微生物；以及利用这样的组合物来降低反刍动物的胃肠产甲烷作用的方法。
文档编号A23K1/00GK102497786SQ201080041128
公开日2012年6月13日 申请日期2010年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者兴德里克·贝尼·波多克, 大卫·戴斯韦森, 扬·迪耶克斯特拉, 桑德尔·马特金·万子耶德韦尔德, 沃尔特·扬·约瑟夫·格里斯, 约翰·理查德·纽博德, 罗布·伯纳德·安东·胡尔沙弗, 罗纳德·阿尔佛雷德·梁 申请人:普乐维美控股公司