专利名称：原发性开角型青光眼致病基因动物模型及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种表达致病基因的动物模型，尤其涉及一种在小鼠视网膜特异表达人突变型OPTN(E50K)基因原发性的开角型青光眼动物模型及其构建方法，属于动物模型的构建领域。
背景技术：
OPTN基因是原发性开角型青光眼(Primary open angle glaucoma, P0AG)致病基因之一，OPTN基因E50K突变可以导致视网膜神经节细胞(Retinal ganglial cells, RGCs) 的凋亡，但机制不清Chi ZL 等(Overexpression of optineurin E50K disrupts Rab8interaction and leads to a progressive retinal degeneration in mice. Chi ZL, Akahori M, Obazawa M, et al. Hum Mol Genet. 2010 ；19(13) :2606-15)公开了一种原发性开角型青光眼的动物模型，其所应用的OPTN(E50K)小鼠转基因基因模型的突变基因均为小鼠源性，由于小鼠的OPTN基因与人类的OPTN基因并不完全相同，这就限制了此类转基因模型在人类原发性开角型青光眼发病机制以及治疗研究中的应用；Kroeber M等(Transgenic studies on the role of optineurin in the mouse eye. Kroeber M, Ohlmann A, Russell P, et al. Exp Eye Res. 2006 ；82(6) :1075-85)公开的是一种βΒΙ-crystallin-OPTN转基因小鼠模型，即利用鸡晶体蛋白β Bl分别建立OPTN 转基因小鼠和转化生长因子TGF-β 1转基因小鼠，证实OPTN蛋白是一种细胞质蛋白。进一步对OPTN-TGF- β 1双转基因小鼠研究发现OPTN蛋白不能对抗TGF- β 1诱导的晶体上皮凋亡过程，表明OPTN蛋白可能不参与TGF- β 1基因调控路径，但此研究的重点不是青光眼，而且并未对0ΡΤΝ(Ε50Κ)突变模型进行制作和研究。小鼠在细胞和组织器官的生理结构、功能特征以及众多生化途径与人类相似；在一定程度上能够控制外界因素对表型的影响；小鼠同时拥有众多的近交系，可迅速繁殖，人们可在相对均一的遗传背景下分析转入目的基因的功能。利用转基因手段建立原发性开角型青光眼致病基因小鼠模型，有助于系统地研究人类OPTN(Ε50Κ)突变致POAG的发病机制及发生发展趋势。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的原发性开角型青光眼致病基因动物模型的构建中所存在的不足，提供一种新的原发性开角型青光眼致病基因动物模型及其构建方法。本发明鉴于鼠源的OPTN(Ε50Κ)基因与人类基因的不同，将人的OPTN(Ε50Κ)引入视网膜特异启动子，利用转基因技术，使小鼠的视网膜特异表达人的OPTN(Ε50Κ)基因，建立了 0ΡΤΝ(Ε50Κ)突变致原发性开角型青光眼的模型，为系统地研究人类OPTN(Ε50Κ)突变致 POAG的发病机制、发生发展趋势、疾病的转归以及治疗开辟了新的道路，提供了研究动物。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种原发性开角型青光眼致病基因动物模型，其构建方法包括以下步骤1、将人0PTN(E50K)突变基因克隆到带有视网膜启动子c_kit的表达载体中，构建得到重组哺乳动物表达载体；2、将所构建的重组哺乳动物表达载体导入到小鼠体内，筛选鉴定获得转基因小鼠，即得。其中，所述的人OPTN(E50K)突变基因是将OPTN的ORF区148位G突变为A ；所述的视网膜启动子c-kit是小鼠视网膜启动子c-kit ；所述的表达载体是pcDNA3. 0。本发明的一个优选的整体技术方案的详述l、pcDNA3-C-Kit_0PTN(E50K)转基因载体质粒构建(1)将视网膜启动子c-kit插入到表达载体；(2)将OPTN(E50K)突变基因克隆到带有c_kit的表达载体，获得 pcDNA3-C-Kit-0PTN (E50K)表达质粒2、小鼠受精卵品系C57*CBA F 1小鼠3、转基因小鼠制备方式小鼠受精卵细胞雄原核DNA显微注射，将注射卵分别移植到假孕母鼠的输卵管中，将出生小鼠经基因组DNA的PCR检测，获得转基因阳性小鼠，称作Rnmder，即首建鼠。4、转基因小鼠繁殖每个Rnmder鼠单独建系，可获得大量的同一Rnmder鼠的转基因阳性小鼠。5、转基因小鼠鉴定及表型分析获得一定数量转基因小鼠后，通过RT-PCR及 ffestern-blot等手段对每个系的基因表达情况进行检测，将表达的系进行传代及表型分析，在两种以上的Founder小鼠品系上都进行了眼压检测，视网膜厚度测量及视网膜神经节细胞计数，并观察到POAG同样的表型，说明表型是由于转基因引起的。本发明在体外构建了带有视网膜特异性启动子c-Kit的人OPTN(E50K)突变表达载体，通过转基因技术，获得了能够在视网膜特异表达人OPTN(E50K)突变基因的小鼠，建立了人原发性开角型青光眼致病基因模型。小鼠在细胞和组织器官的生理结构、功能特征以及众多生化途径与人类相似；在一定程度上能够控制外界因素对表型的影响；小鼠同时拥有众多的近交系，繁殖周期短，生长迅速，可供研究者在相对均一的遗传背景下分析转入目的基因的功能，并在短期内获得一定数量的研究模型。
图10PTN基因的克隆及OPTN(E50K)突变点碱基(G — A)测序。图2pcDNA3-C-Kit_0PTN(E50K)质粒在突变基因前加入视网膜启动子c_kit。图3DNA blot鉴定0PTN(E50K)转基因小鼠Fl代。图4转基因小鼠视网膜厚度F0小鼠< Fl <小鼠野生型小鼠。图5转基因小鼠与野生型小鼠眼内压转基因小鼠眼内压与野生型小鼠无差别图6荧光金逆行标记视网膜神经节细胞转基因小鼠视网膜神经节细胞凋亡明显。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例原发性开角型青光眼动物模型的构建及鉴定l、pcDNA3-C-Kit_0PTN(E50K)转基因载体质粒构建(1)质粒 pBluescriptSK、pcDNA3. 0 和含小鼠 c-Kit 基因的 BAC 克隆(bMQ257I19)， 含人的OPTN cDNA的p0TB7 (GenBank Accession :BC013876)克隆购自上海业力生物公司， “QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit，，购自 Stratagene 公司。(2)以c-Kit-promoter-Up :5’ -CACAGATCAAGGGAGAGTGCTAGGAGGAAGAGGAT-3， (SEQ ID No. 1)和c-Kit-promoter-Down :5’ -GCCGGTACCCGCGGTGGCTGCGCTAGACTCTGAGC-3’ (SEQ ID No. 2)为引物，BAC DNA为模板，运用TaKaRa Ex Taq进行PCR，琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增片段，得到两侧具有BglII和KpnI酶切位点的c-Kit-promoteHO. 3kp)片段。(3)BglII和KpnI双酶切pcDNA3. 0，琼脂糖凝胶电泳分离去除CMV-promoter片段，胶回收其余的载体片段，并与BglII和KpnI双酶切回收的c-Kit-promoter片段经 T4Iigase发生连接反应，转化感受态大肠杆菌，涂平板。(4)挑取单克隆振荡培养过夜，碱裂解法抽提质粒DNA，用BglII和KpnI双酶切鉴定。酶切正确的克隆经由美国英杰生命技术有限公司anvitrogerODNA序列测定进一步证实，构建完成的载体命名为pcDNA3-c-Kit Promoter ο(5)EcoRI.XhoI双酶切pBluescript和p0TB7质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳胶回收产生的pBluescript载体和OPTN-cDNA插入片段，经连接和转化反应，获得pBluescript-OPTN克隆。(6)按照”Mutagenesis Kit” 的操作流程，应用 OPTN Mutation Primer-I :5，-AT GAAAGAGCTCCTGACCAAGAACCACCAGCTGAAAGAAGC-3，(SEQ ID No. 3)和 Primer-2 :5，_GCTTCTT TCAGCTGGTGGTTCTtGGTCAGGAGCTCTTTCATC-3，(SEQ ID No. 4)作引导，将 OPTN 的 ORF 区 148 位G突变为A，及OPTN (E50K)突变，并经DNA序列测定进一步证实(图1)。(7)EcoRI, XhoI 双酶切含突变 OPTN cDNA 的 pBluescript_0PTN(E50K)，胶回收纯化后克隆于EcoRI、XhoI双酶切的pcDNA3-c-Kit Promoter载体片段，获得pcDNA3_c_Kit Promoter-OPTN(E50K)克隆，该克隆的组成结构经DNA序列测定证实(图2)。(8) PvuI 和 BstlIO7I 双酶切 pcDNA3_c-Kit Promoter-OPTN(E50K)质粒 DNA，胶回收产生的5530bp片段用于显微注射，制备转基因小鼠。2、小鼠受精卵品系C57*CBA F 1小鼠。3、转基因小鼠制备方式小鼠受精卵细胞雄原核DNA显微注射，共获得445枚注射卵，这些卵分别移植到16只假孕母鼠的输卵管中，其中10只母鼠怀孕，移植成功率为 62. 5 %仔鼠，小鼠出生总数81只，经基因组DNA的PCR检测，其中11小鼠为阳性，阳性率为 13. 58%这些转基因阳性小鼠被称作Founder,即首建鼠(图3)。4、转基因小鼠繁殖每个Rnmder鼠单独建系。具体方法如下性成熟Rnmder鼠(8周龄)与8周龄的野生型小鼠(如C57BL/6J))交配，2周龄仔鼠脚趾编号并剪尾抽取基因组DNA，PCR检测出生小鼠的基因型，阳性鼠即为转基因阳性小鼠。如此反复，即可获得大量的同一 Rnmder鼠的转基因阳性小鼠。 5、转基因小鼠鉴定及表型分析每个Rnmder鼠中，插入片段不一定均表达，本发明在获得一定数量转基因小鼠后，通过RT-PCR及ffestern-blot等手段对每个系的基因表达情况进行检测，将表达的系进行传代及表型分析。考虑到不同的转基因Rnmder小鼠具有不同的插入位点，为排除转基因小鼠的表型受插入位点的影响，本发明在两种以上的 Founder小鼠品系上都进行了眼压检测(图幻，视网膜厚度测量(图4)及荧光金逆行标记检测视网膜神经节细胞凋亡(图6)，并观察到POAG同样的表型，说明表型是由于转基因引起的，此发明成功的建立的原发性开角型青光眼致病基因模型。
权利要求
1.一种原发性开角型青光眼致病基因动物模型的构建方法，包括以下步骤(1)、将人0PTN(E50K)突变基因克隆到带有视网膜启动子C-kit的表达载体中，构建得到重组哺乳动物表达载体；O)、将所构建的重组哺乳动物表达载体导入到小鼠体内，筛选鉴定获得转基因小鼠， 即得。
2.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的人0PTN(E50K)突变基因是将 OPTN的ORF区148位G突变为A。
3.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的视网膜启动子c-kit是小鼠视网膜启动子c-kit。
4.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的表达载体是PCDNA3.0。
5.由权利要求1-4任何一项构建方法所得到的原发性开角型青光眼致病基因动物模型。
全文摘要
本发明公开了原发性开角型青光眼致病基因动物模型及其构建方法，包括(1)将人OPTN(E50K)突变基因克隆到带有视网膜启动子c-kit的表达载体中，构建得到重组哺乳动物表达载体；(2)将重组哺乳动物表达载体导入到小鼠体内，筛选鉴定获得转基因小鼠。本发明鉴于鼠源的OPTN(E50K)基因与人类基因的不同，将人的OPTN(E50K)引入视网膜特异启动子，利用转基因技术，使小鼠的视网膜特异表达人的OPTN(E50K)基因，建立了OPTN(E50K)突变致原发性开角型青光眼的模型，为系统地研究人类OPTN(E50K)突变致POAG的发病机制、发生发展趋势、疾病的转归以及治疗提供了研究动物。
文档编号A01K67/027GK102229959SQ20111014375
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者原慧萍, 沈婧, 邵正波 申请人:哈尔滨医科大学