专利名称：一种反刍动物微生态添加剂及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生态添加剂及其制备工艺，特别是涉及一种能够有效提高奶牛产奶量、降低乳汁体细胞数和提高肉羊增重率的反刍动物微生态添加剂及其制备工艺。
背景技术：
多年来，动物营养学家和微生物学家一直致力于反刍动物瘤胃微生态系统的研究，其目的就是想通过调控瘤胃微生物区系来提高反刍家畜生产效率。近年来，利用微生态制剂来调控瘤胃功能已成为该领域研究的热点。国内对微生态制剂的研究报道主要集中在单胃动物和家禽上，而在反刍动物上的报道较少，许多研究是将单胃动物成熟的技术照搬到反刍动物上应用，由于反刍动物具有多变的瘤胃内环境，而且瘤胃微生物种群结构十分复杂、数量特别庞大，各种益生菌在瘤胃内难以生存和保持活性，因而，在单胃动物上的应用成熟的理论和技术显然不适合反刍动物。研制反刍动物微生态制剂，必须从其生理特点出发，只有充分了解反刍动物瘤胃微生态环境和瘤胃微生物对机体的生理功能，才能研制出科学而有针对性的微生态制剂。因此，根据反刍动物的生理特点，开发研制有针对性的质优价廉微生态添加剂产品势在必行。现有技术中也有相关反刍动物饲料添加剂及其制备方法的记载，例如专利 ZL200810103485. 1 奶牛饲料用复合微生物添加剂及其制备方法，其特征主要描述3种菌 (纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌)的活性及其发挥的协同作用，并未涉及3种菌产生的代谢产物之功效。又例如硕士论文“奶牛复合菌培养物液态发酵培养基的优化及应用”，该研究以酿酒酵母、产朊假丝酵母和热带假丝酵母为菌种在固态培养基上进行混合发酵，由于酵母菌产生的淀粉酶较少，因而在固态培养基上2次增殖所需的糖类供应不足， 酵母细胞浓度也较低。
发明内容
本发明的一个目的是提供了一种反刍动物微生态添加剂，该添加剂是将酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌分别在液体培养基中培养后，得到酿酒酵母发酵菌液、产朊假丝酵母发酵菌液和枯草芽孢杆菌发酵菌液，将上述三种发酵菌液混合，然后在固态培养基上发酵而形成的混合培养物，所述的混合培养物中多肽含量> 5. 3g/Kg ； β -葡聚糖含量彡125mg/Kg;按质量百分比，氨基酸含量彡16.5% ；按质量百分比，有机酸含量彡 3. 45%。本领域用于培养酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的液体培养基均可用于对应菌种的培养，优选地所述液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖 2. 5%，硫酸铵0. 5% 1. 5%，酵母浸膏 2% 4%，KH2PO4O. 2% 0. 4%, MgSO4O. 01% 0. 05%, CaCl2O. 01% 0. 04%,KCl 0.02% 0.06%，其余为水，所述液体培养基的pH值为5.0 5. 5。优选的液体培养基相比常规公职的培养基更有利于菌种的培养。
本领域用于培养枯草芽孢杆菌的液体培养基均可用于对应菌种的培养，优选地所述液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖0. 5% 1. 5%，酵母浸膏0. 02% 0. 05%， 豆粕粉 1% 4%，KH2PO4O. 15% 0. 3%，MgSO4O. 05% 0. 15%，MnSO4O. 05% 0. 1%， CaCO3O. 01% 0. 03%，其余为水。优选的液体培养基相比常规的培养基更有利于菌种的培养。所述固体培养基为麸皮、大豆皮、玉米粉、玉米皮和菜籽粕的混合物，五种混合物的比例依次为50% 65%、6% 12%、15% 19%、6% 12%和7% 10% ；或是麸皮、 米糠、玉米皮、芝麻饼和棉粕的混合物，五种混合物的比例依次为55% 65%、7% 15%、 12% 18%、6% 12%和7% 13%，所述固体培养基的碳氮比为10 3 1。所述有机酸包括苹果酸、琥珀酸和柠檬酸。所述酿酒酵母发酵菌液、所述产朊假丝酵母发酵菌液和所述枯草芽孢杆菌发酵菌液按体积比2 4. 5 1 2. 5 1 2. 5组成的混合菌液。所述酿酒酵母发酵菌液、所述产朊假丝酵母发酵菌液和所述枯草芽孢杆菌发酵菌液浓度均大于109cfu/mL。本发明的另一个目的在于提供了一种反刍动物微生态添加剂的制备方法，其特征在于，其包括步骤(1)菌种恢复培养；( 菌种扩大培养；C3)菌株分别进行液体富集发酵；(4)固体发酵；其中步骤(4)固体发酵液体富集发酵结束后，将酿酒酵母发酵菌液、产朊假丝酵母发酵菌液和枯草芽孢杆菌发酵菌液按2 4. 5 1 2. 5 1 2. 5的比例混合后，再将混合菌液以体积分数10% 15%的接种量与固体培养基混合，调节固体含水量为质量分数 40% 55%，开始固体发酵，固体发酵包括①有氧富集培养阶段调节发酵温度保持于30°C 35°C，有氧发酵对 30小时， 期间每隔6 10小时翻料一次；②厌氧发酵阶段有氧发酵结束后，停止翻料，用塑料布对固态发酵池表面进行封闭，于33°C 40°C厌氧发酵12 20小时；③复合酵母破壁发酵阶段将温度从35 40°C以2 5°C /小时的速度升至 45°C 60°C，保持该温度10 16小时，细胞破壁率达到80% -85%，停止发酵。进一步地，对于步骤(1)菌种恢复培养可以根据本领域常规的方法进行，优选地包括斜面接种，30°C下培养48小时，然后4°C保藏，2 3个月传代一次。进一步地，对于步骤⑵菌种扩大培养可以根据本领域常规的方法进行，优选地包括将步骤(1)恢复培养菌种接种到三角瓶中扩大培养，扩大培养后的菌液浓度大于 109cfu/mL进一步地，对于步骤C3)液体发酵包括将步骤( 培养出的菌液以体积分数 5% 10%的接种量接种到液体培养基中，于30 33°C培养18 沈小时。进一步地，对于步骤(3)中所述液体培养基，酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖 2. 5%，硫酸铵0. 5% 1. 5 %，酵母浸膏2% 4%, KH2PO4O. 2% 0. 4%, MgSO4O. 01% 0. 05%, CaCl2O. 01% 0. 04%, KCl 0. 02% 0. 06%，其余为水，所述液体培养基的pH值为5. 0 5. 5。培养枯草芽孢杆菌的液体培养基均可用于对应菌种的培养，优选地所述液体培养包括如下重量比原料，葡萄糖0.5%
51. 5%，酵母浸膏 0. 02% 0. 05%，豆粕粉 4%,KH2PO4O. 15% 0. 3%,MgSO4O. 05% 0. 15%, MnSO4O. 05% 0. 1 %, CaCO3O. 01% 0. 03%，其余为水。进一步地，对于步骤中所述固体培养基为麸皮、大豆皮、玉米粉、玉米皮和菜籽粕的混合物，五种混合物的比例依次为50% 65%、6% 12%、15% 19%、6% 12% 和7% 10% ；或是麸皮、米糠、玉米皮、芝麻饼和棉粕的混合物，五种混合物的比例依次为 55% 65%、7% 15%、12% 18%、6% 12%和7% 13%，所述固体培养基的碳氮比为10 3 1。进一步地，所述方法还包括步骤( 干燥，包括将固体发酵产物干燥到水分17% 以下。本发明的优点在于(1)本发明采用液体-固体两相发酵工艺，通过液体富集培养、固体有氧增殖、厌氧变温自溶等过程，生产出的微生态添加剂富含多种营养活性物质，用于反刍动物饲料添加剂，可以提高动物的生产性能；(2)本发明为多菌株混合发酵生产酵母代谢物，高活性淀粉酶的芽孢杆菌能将固态料中的大量淀粉分解为单糖以为酵母菌的2次增殖提供丰富的碳源；同单一菌种发酵的酵母培养物产品相比，复合菌发酵利用的底物更为广泛，产生代谢产物更为丰富；(3)利用“微生物代谢组学”原理和技术来研制复合酵母的固态发酵工艺，使酵母菌在厌氧条件下产生多量代谢产物，并完成酵母细胞壁的裂解和释放活性物质；(4)实际生产中，使用本发明产品后，奶牛乳汁体细胞数下降15% -20%，乳房炎下降7% -16% ；产奶量提高3% -5% ；奶牛饲料转化率提高6% -15% ；羔羊育肥增重提高 7% -14%，显著增加经济效益。
具体实施例方式实施例1(1)菌种恢复培养分别将酿酒酵母、产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌进行斜面接种，30°C下培养48小时，然后4°C保藏，2个月传代一次；(2)菌种扩大培养将步骤(1)恢复培养菌种接种到三角瓶中扩大培养，扩大培养后的菌液浓度大于IO9CfuAiL ；(3)菌株分别进行液体富集发酵将步骤( 培养出的菌液以体积分数5%的接种量接种到液体培养基中，于30°C培养18小时；其中酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖丨^，硫酸铵化日^，酵母浸膏*1^，KH2PO4O. 4%, MgSO4O. 01%, CaCl2O. 01%, KCl 0. 06%,其余为水，培养枯草芽孢杆菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖0.5%，酵母浸膏0.02%，豆粕粉4%，KH2PO4O. 3 %，MgSO4O. 05 %， MnSO4O. 05%, CaCO3O. 03%，其余为水。(4)固体发酵液体富集发酵结束后，将酿酒酵母发酵菌液、产朊假丝酵母发酵菌液和枯草芽孢杆菌发酵菌液按2 1 1的比例混合后，再将混合菌液以体积分数10% 的接种量与固体培养基混合，调节固体含水量为质量分数40%，开始固体发酵，固体发酵包括①有氧富集培养阶段调节发酵温度保持于30°C，有氧发酵M小时，期间每隔6小时翻料一次；②厌氧发酵阶段有氧发酵结束后，停止翻料，用塑料布对固态发酵池表面进行封闭，于33°C厌氧发酵12小时；③复合酵母破壁发酵阶段将温度从35°C以2°C /小时的速度升至45°C，保持该温度10小时，细胞破壁率达到80%，停止发酵；其中所述固体培养基为麸皮、大豆皮、玉米粉、玉米皮和菜籽粕的混合物，五种混合物的比例依次为60%、12%、15%、6%和7%;(5)干燥将固体发酵产物干燥到水分17%以下，得到反刍动物微生态添加剂。对步骤(4)得到的固体发酵混合物进行成分测定，其中多肽含量5. 3g/Kg ； β -葡聚糖含量125mg/Kg ；按质量百分比，氨基酸含量16. 5%；按质量百分比，有机酸含量3. 45%实施例2(1)菌种恢复培养分别将酿酒酵母、产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌进行斜面接种，30°C下培养48小时，然后4°C保藏，2个月传代一次；(2)菌种扩大培养将步骤(1)恢复培养菌种接种到三角瓶中扩大培养，扩大培养后的菌液浓度大于IO9CfuAiL ；(3)菌株分别进行液体富集发酵将步骤( 培养出的菌液以体积分数8%的接种量接种到液体培养基中，于32°C培养22小时；其中酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖2%，硫酸铵1%，酵母浸膏3%，KH2PO4O. 3%, MgSO4O. 03%, CaCl2O. 02%, KCl 0. 04 %，其余为水，培养枯草芽孢杆菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖1%，酵母浸膏0. 03%，豆粕粉3 %，KH2PO4O. 2%, MgSO4O. 1%, MnSO4O. 07%, CaCO3O. 02%，其余为水。(4)固体发酵液体富集发酵结束后，将酿酒酵母发酵菌液、产朊假丝酵母发酵菌液和枯草芽孢杆菌发酵菌液按3 2 2的比例混合后，再将混合菌液以体积分数12% 的接种量与固体培养基混合，调节固体含水量为质量分数50%，开始固体发酵，固体发酵包括①有氧富集培养阶段调节发酵温度保持于33°C，有氧发酵观小时，期间每隔8 小时翻料一次；②厌氧发酵阶段有氧发酵结束后，停止翻料，用塑料布对固态发酵池表面进行封闭，于37°C厌氧发酵16小时；③复合酵母破壁发酵阶段将温度从37°C以4°C /小时的速度升至48°C，保持该温度14小时，细胞破壁率达到82%，停止发酵；其中所述固体培养基为麸皮、米糠、玉米皮、芝麻饼和棉粕的混合物，五种混合物的比例依次为56%、15%、15%、7%和7%%,；(5)干燥将固体发酵产物干燥到水分17%以下，得到反刍动物微生态添加剂。对步骤(4)得到的固体发酵混合物进行成分测定，其中多肽含量6. Og/Kg ； β -葡聚糖含量13aiig/Kg ；按质量百分比，氨基酸含量16. 8%;按质量百分比，有机酸含量3. 77%实施例3(1)菌种恢复培养分别将酿酒酵母、产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌进行斜面接种，30°C下培养48小时，然后4°C保藏，3个月传代一次；
(2)菌种扩大培养将步骤(1)恢复培养菌种接种到三角瓶中扩大培养，扩大培养后的菌液浓度大于IO9CfuAiL ；(3)菌株分别进行液体富集发酵将步骤(2)培养出的菌液以体积分数10%的接种量接种到液体培养基中，于33°C培养沈小时；其中酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖2. 5 %，硫酸铵1.5%，酵母浸膏2 %，KH2PO4O. 2 %， MgSO4O. 05%, CaCl2O. 04%, KCl 0. 02%，其余为水，培养枯草芽孢杆菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖1.5%，酵母浸膏0. 05%，豆粕粉2%，KH2PO4O. 15%, MgSO4O. 15%, MnSO4O. 1%，CaCO3O. 01%，其余为水。(4)固体发酵液体富集发酵结束后，将酿酒酵母发酵菌液、产朊假丝酵母发酵菌液和枯草芽孢杆菌发酵菌液按4. 5 2.5 2. 5的比例混合后，再将混合菌液以体积分数 15%的接种量与固体培养基混合，调节固体含水量为质量分数55%，开始固体发酵，固体发酵包括①有氧富集培养阶段调节发酵温度保持于35°C，有氧发酵30小时，期间每隔10 小时翻料一次；②厌氧发酵阶段有氧发酵结束后，停止翻料，用塑料布对固态发酵池表面进行封闭，于40°C厌氧发酵20小时；③复合酵母破壁发酵阶段将温度从40°C以5°C /小时的速度升至60°C，保持该温度16小时，细胞破壁率达到85%，停止发酵；其中所述固体培养基为麸皮、米糠、玉米皮、芝麻饼和棉粕的混合物，五种混合物的比例依次为60%、10%、15%、7%和8% ；(5)干燥将固体发酵产物干燥到水分17%以下，得到反刍动物微生态添加剂。对步骤(4)得到的固体发酵混合物进行成分测定，其中多肽含量6. 5g/Kg; β-葡聚糖含量140mg/Kg ；按质量百分比，氨基酸含量17. 5%;按质量百分比，有机酸含量3. 90%实施例4反刍动物微生态添加剂在奶牛饲喂中的应用1、试验动物选择与分组试验在内蒙古奶联社第一示范牧场进行。选择2 4胎次、处于泌乳前期和中期的荷斯坦奶牛80头，按照年龄、日产奶量、泌乳天数、胎次相近的原则进行分组配对，随机分为4组，每组20头，试验期35天。四个试验组分别为I组试验组，饲喂奶牛基础日粮，同时饲喂本发明的奶牛微生态添加剂，饲喂量为 300g/ 头 /d ；II组阳性对照一，饲喂奶牛基础日粮，同时饲喂进口某品牌酵母添加剂，添加量为 120g/ 头 /d ；III组阳性对照二，饲喂奶牛基础日粮，同时饲喂国产某品牌酵母添加剂，添加量为80g/头/d ；IV组空白对照组，仅饲喂奶牛基础日粮。2、日粮组成与饲喂供试牛每天分两次饲喂，精粗比为1 1，采用TMR混合喂养技术，奶牛基础日粮组成，按重量百分比，配方为玉米40 %，麸皮12 %，小麦10 %，啤酒糟 11%，胚芽粕13%，棉粕5%，胡麻饼5%，磷酸氢钙1.5%，食盐1%，石粉0.5%，预混料1%。
3、测定指标试验奶牛产奶量、乳品质指标及乳汁体细胞数(见表1)。表1不同酵母添加剂对奶牛产奶量及乳成分的影响
权利要求
1.一种反刍动物微生态添加剂，其特征在于，该添加剂是将酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌分别在液体培养基中培养后，得到酿酒酵母发酵菌液、产朊假丝酵母发酵菌液和枯草芽孢杆菌发酵菌液，将上述三种发酵菌液混合，然后在固态培养基上发酵而形成的混合培养物，所述的混合培养物中多肽含量> 5. 3g/Kg ； β -葡聚糖含量> 125mg/ Kg;按质量百分比，氨基酸含量彡16.5% ；按质量百分比，有机酸含量彡3. 45%。
2.权利要求1所述的一种反刍动物微生态添加剂，其特征在于，所述培养酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖 2.5%，硫酸铵 0. 5 % 1. 5 %，酵母浸膏 2% 4%，KH2PO4O. 2 % 0. 4%，MgSO4O. 01 % 0. 05%， CaCl2O. 01% 0. 04%，KC10. 02% 0. 06%，其余为水，所述液体培养基的pH值为5. 0 5. 5 ；所述培养枯草芽孢杆菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖0. 5% 1. 5%，酵母浸膏 0. 02% 0. 05%，豆粕粉 4%,KH2PO4O. 15% 0. 3%,MgSO4O. 05% 0. 15%, MnSO4O. 05% 0. 1 %, CaCO3O. 01% 0. 03%，其余为水。
3.权利要求1所述的一种反刍动物微生态添加剂，其特征在于，所述固体培养基为麸皮、大豆皮、玉米粉、玉米皮和菜籽粕的混合物，五种混合物的比例依次为50% 65%、 6% 12%、15% 19%、6% 12%和7% 10% ；或是麸皮、米糠、玉米皮、芝麻饼和棉粕的混合物，五种混合物的比例依次为55% 65%、7% 15%、12% 18%、6% 12%和 % 13%，所述固体培养基的碳氮比为10 3 1。
4.权利要求1所述的一种反刍动物微生态添加剂，其特征在于，所述有机酸包括苹果酸、琥珀酸和柠檬酸。
5.权利要求1所述的一种反刍动物微生态添加剂，其特征在于，所述酿酒酵母发酵菌液、所述产朊假丝酵母发酵菌液和所述枯草芽孢杆菌发酵菌液按体积比2 4. 5 1 2.5 1 2. 5组成的混合菌液。
6.权利要求1所述的一种反刍动物微生态添加剂，其特征在于，所述酿酒酵母发酵菌液、所述产朊假丝酵母发酵菌液和所述枯草芽孢杆菌发酵菌液浓度均大于109cfu/mL。
7.—种权利要求1-6的反刍动物微生态添加剂的制备方法，其特征在于，其包括步骤 ⑴菌种恢复培养；⑵菌种扩大培养；(3)菌株分别进行液体富集发酵；⑷固体发酵；其特征在于，其中步骤(4)固体发酵液体富集发酵结束后，将酿酒酵母发酵菌液、产朊假丝酵母发酵菌液和枯草芽孢杆菌发酵菌液按2 4. 5 1 2.5 1 2. 5的比例混合后，再将混合菌液以体积分数10% 15%的接种量与固体培养基混合，调节固体含水量为质量分数40% 55 %，开始固体发酵，固体发酵包括①有氧富集培养阶段调节发酵温度保持于30°C 35°C，有氧发酵M 30小时，期间每隔6 10小时翻料一次；②厌氧发酵阶段有氧发酵结束后，停止翻料，用塑料布对固态发酵池表面进行封闭， 于33°C 40°C厌氧发酵12 20小时；③复合酵母破壁发酵阶段将温度从35 40°C以2 5°C/小时的速度升至45°C 60°C，保持该温度10 16小时，细胞破壁率达到80% -85%，停止发酵。
8.权利要求7所述的制备方法，其中所述的步骤(1)菌种恢复培养包括斜面接种， 30°C下培养48小时，然后4°C保藏，2 3个月传代一次。
9.权利要求7所述的制备方法，其中所述步骤( 菌种扩大培养包括将步骤(1)恢复培养菌种接种到三角瓶中扩大培养，扩大培养后的菌液浓度大于109cfu/mL。
10.权利要求7所述的制备方法，其中所述步骤C3)液体发酵包括将步骤( 培养出的菌液以体积分数5% 10%的接种量接种到液体培养基中，于30 33°C培养18 沈小时。
11.根据权利要求7所述的一种反刍动物微生态添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述液体培养基，酿酒酵母菌和产朊假丝酵母菌的液体培养基包括如下重量比原料，葡萄糖 2. 5%，硫酸铵0. 5% 1. 5%，酵母浸膏2% 4%,KH2PO4O. 2% 0. 4%, MgSO4O. 01 % 0. 05 %，CaCl2O. 01 % 0. 04 %，KC10. 02 % 0. 06 %，其余为水，所述液体培养基的pH值为5. 0 5. 5 ；培养枯草芽孢杆菌的液体培养基均可用于对应菌种的培养，优选地所述液体培养包括如下重量比原料，葡萄糖0. 5% 1. 5%，酵母浸膏0. 02% 0. 05%，豆粕粉 1% 4%，KH2PO4O. 15% 0. 3%，MgSO4O. 05% 0. 15%，MnSO4O. 05% 0. 1 %, CaCO3O. 01% 0. 03%，其余为水。
12.根据权利要求7所述的一种反刍动物微生态添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述固体培养基为麸皮、大豆皮、玉米粉、玉米皮和菜籽粕的混合物，五种混合物的比例依次为50% 65%、6% 12%、15% 19%、6% 12%和7% 10% ；或是麸皮、 米糠、玉米皮、芝麻饼和棉粕的混合物，五种混合物的比例依次为55% 65%、7% 15%、 12% 18%、6% 12%和7% 13%，所述固体培养基的碳氮比为10 3 1。
13.权利要求7所述的制备方法，其中包括所述步骤( 干燥将固体发酵产物干燥到水分17%以下。
全文摘要
本发明涉及一种反刍动物微生态添加剂，该添加剂是将酿酒酵母菌、产朊假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌分别在液体培养基中培养后，得到酿酒酵母发酵菌液、产朊假丝酵母发酵菌液和枯草芽孢杆菌发酵菌液，将上述三种发酵菌液混合，然后在固态培养基上发酵而形成的混合培养物，所述的混合培养物中多肽含量≥5.3g/Kg；β-葡聚糖含量≥125mg/Kg；按质量百分比，氨基酸含量≥16.5％；按质量百分比，有机酸含量≥3.45％。本发明还涉及制备该反刍动物微生态添加剂的方法。
文档编号A23K1/16GK102228138SQ20111016186
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月4日 优先权日2011年6月4日
发明者刘大程, 卢德勋, 殷兆丽, 王晓宏, 高民 申请人:内蒙古农业大学