专利名称：蘑菇的液体种菌的生产方法
技术领域：
本发明涉及用于生产蘑菇子实体的蘑菇液体种菌的生产方法、以及使用该液体种菌生产蘑菇子实体的方法。
背景技术：
近年来，已开发了蘑菇的人工栽培技术，从而提供各种蘑菇子实体(占地菇、荷叶菇、真姬菇、杏鲍菇、香菇、金针菇等)。通常，这样对蘑菇进行人工栽培通过将蘑菇的种菌接种于碎块木或固体培养基中，经由培养、生长等工序，收获子实体。蘑菇的种菌包括使用锯屑等培养基的固体种菌和使用液体培养基的液体种菌。近年来，在蘑菇的人工栽培中正在推进机械化，例如，在大型设备的工厂系统中实施等。但是，为了商业上大量且稳定地生产蘑菇子实体，需要大量培养所使用的种菌。目前，从蘑菇的种菌保存性良好且可容易运输等理由考虑，可以使用固体种菌；但是从易于避免蘑菇子实体生产时的生产差异(其起因于固体种菌的批次差异)的风险、或有害菌·害虫对设备的严重污染(其起因于接种固体种菌时溢出的种菌所引起的瓶或集装箱的污染)等问题、能够大幅缩短种菌的生产时间、且易于扩大规模等方面考虑，液体种菌被认为是有利的，其使用正在增加。作为用于大量培养液体种菌的方法，对液体深部培养法(其为用于从菌丝体得到有用成分的大量培养方法)进行研究，为了严格地控制培养条件等，通用的是利用进行机械搅拌、通气、温度管理的小型发酵罐来通气搅拌的方法 (例如，非专利文献1)。但是，为了以商业规模生产蘑菇子实体，需要设置大容量的包含小型发酵罐的高价且大规模的培养设备。[非专利文献1]醌酵協会誌，第M卷，第7期，第四3_304页，1966年
发明内容
发明要解决的问题鉴于上述现状，本发明的目的在于提供一种在蘑菇子实体的大规模商业生产中廉价且有效地生产液体种菌的方法、以及使用该液体种菌生产蘑菇子实体的方法。本发明人对大量生产用于大规模商业生产的蘑菇液体种菌的方法进行了潜心研究，结果发现，令人惊奇的是，在搅拌中使用气泡的液体深部培养(无动力搅拌鼓气泡)意外地也对用于生产蘑菇子实体的液体种菌的生产有用。另外发现，在该培养中，通过在液体培养基中含有低浓度的植物油，从而可以在具有蘑菇子实体形成能力的状态下有效且稳定地大量生产菌丝体。进而，通过进一步提高迄今为止在固体种菌中使用的菌床栽培用培养基的菌座，且使菌座表面均勻地平面化，从而可以进行更稳定的菌循环(菌廻)，可以有效地进行由搔菌(菌+爸)所引起的发生诱导，与使用固体种菌的情况相比，可以生产优良的蘑菇子实体，该蘑菇子实体均勻且商品价值高，而该生产方法包含种菌生产时间在内的时间短，由此完成了本发明。本发明概述如下
[1] 一种蘑菇的液体种菌的生产方法，其为用于生产蘑菇子实体的蘑菇液体种菌的生产方法，其特征在于，在含有植物油的液体培养基中，通过使用气泡搅拌培养基来对蘑菇的菌丝体进行液体深部培养；[2]如[1]所述的生产方法，其中，基本上仅使用气泡来搅拌培养基；[3]如[1]或[2]所述的生产方法，其中，所述植物油为选自色拉油、米糠油、菜籽油、红花油、玉米油、橄榄油、芝麻油、大豆油及棉籽油中的1种或多种；[4]如[1] [3]中任一项所述的生产方法，其中，所述培养基中的植物油浓度为 0. 001 0. 1 体积 ％ ；[5] 一种蘑菇子实体的生产方法，其特征在于，使用通过[1] W]中任一项所述的生产方法所得到的蘑菇液体种菌；[6]如[5]所述的蘑菇子实体的生产方法，其为瓶栽法；[7]如[5]或[6]所述的蘑菇子实体的生产方法，其特征在于，使用菌座提高了的菌床栽培用培养基。[8]如[7]所述的蘑菇子实体的生产方法，其特征在于，使用菌座表面均勻平面化了的菌床栽培用培养基。发明效果根据本发明，可以提供一种用于蘑菇子实体的大规模商业生产的、在短时间内廉价地大量生产蘑菇液体种菌的方法。另外，也可以提供一种使用该液体种菌生产蘑菇子实体的方法。
[图1]是示出用于本发明生产方法的栽培瓶中菌座提高了的菌床栽培用培养基的菌座位置的图。
具体实施例方式对于能够用于本发明的“蘑菇”没有特别的限定，可以列举荷叶菇、占地菇、真姬菇、平菇、香菇、金针菇、滑菇、平菇、舞茸、杏鲍菇、姬松茸、鲍鱼菇、黑耳平菇等食用蘑菇。 作为这些蘑菇的菌株，只要是可作为液体种菌进行培养且可生产子实体的菌株即可，可以为市售的菌株，也可以为来自野生子实体的组织分离株，还可以为通过筛选、杂交、细胞融合、基因重组等方法进行育种而得到的菌株。作为本发明的优选的一个实施方式，可以举出荷叶菇(Lyophyllum decastes)。作为荷叶菇，可以例示公知的菌株，例如，Lyophyllum decastes K-3303 株(FERM BP-4347)、Lyophyllum decastes K-3304 株(FERM BP-4348)、 Lyophyllum decastes K-3305 株(FERM BP-4349) > Lyophyllum decastes F-623 株(FERM P-13165)、Lyophyllum decastes F-1154 株(FERM P-13166)、Lyophyllum decastes F-1488株(FERM P-13167)及适于生产子实体的这些菌株的突变株等。另夕卜，作为本发明中优选的本占地菇(Lyophyllum shimeji)的菌株的实例， 可以例示LyophylIum shimeji La 01-27 (FERM BP—10960)、Lyophyllum shimeji La 01-20 (FERM BP-10959)、Lyophyllum shimeji LaO 1-37 (FERM P-17456)、Lyophyllum shimeji La 01-45 (FERM P-17457)、Lyophyllum shimeji La 01-46 (FERM P-17458)及适于生产子实体的这些菌株的突变株等。此外，作为本发明中优选的真姬菇的菌株，有表示为榆生离褶伞(Lyophyllum ulmarium)的菌株、表示为Hypsizygus marmoreus的菌株等，例如可以例示Lyophyllum ulmarium M-8171(FERM BP-1415) > Lyophyllum ulmarium K-0259(FERM P—12981)、 Lyophyllum ulmarium Lul-172 株(FERM BP-8354)、Lyophyllum ulmarium Lul-173 株 (FERM BP-8355)、LyophylIum ulmarium Lul-174株(FERM BP-8356)、LyophylIum ulmarium Lul-181^ (FERM BP-8357) >Hypsizygus marmoreus K-4975 (FERM BP-11321) >Hypsizygus marmoreus K-4979(FERM BP-11322)、Hypsizygus marmoreus K-4980(FERM BP-11323)、 Hypsizygus marmoreus K_4981(FERM BP-11324)及适于生产子实体的这些菌株的突变株寸。此外，作为本发明中优选的黑耳平菇的菌株，可以例示=Pleurotus cystidiosus subsp. abalonus K-4986(FERM P-22064)、Pleurotus cystidiosus subsp.abalonus K-4987(FERM P-22065) >Pleurotus cystidiosus subsp. abalonus K-4988(FERM P-22066) 及适于生产子实体的这些菌株的突变株等。对上述菌株没有任何限定，只要为可人工栽培的菌株、并且为可适用本发明的菌株即可。本申请说明书中，所谓“菌丝体”为上述蘑菇的菌丝体，对其没有特别的限定，只要为可在液体培养基中培养、且可用作用于生产蘑菇子实体的液体种菌即可。本申请说明书中，所谓“使用气泡的液体深部培养”是指通过在培养槽内产生的气泡来使培养液运动(流动)，从而对培养基实施搅拌的培养方法。优选基本上仅使用气泡来对培养基进行搅拌的培养方法，也可以包含通过搅拌器、螺旋桨形状的鼓风机之类的装置进行的机械搅拌，只要为不引起菌丝切断的程度即可。特别优选为不伴有机械性搅拌而仅使用气泡来对培养基进行搅拌的培养方法。对用于所述培养方法的培养槽而言，不需要用于搅拌或振荡的使用机械动力的装置，只要具备产生气泡的装置即可。本发明中，可以使用 (例如)文献“日本応用t O 二学会誌，第8卷，第1期，第1-11页Q000)”中记载的气泡塔型培养装置等，可以使用带有可从底面及/或侧面产生无菌气泡那样的装置的培养槽。另外，也可以将可以产生气泡的管子等直接加入到培养槽中。作为培养槽中的气泡的通气量， 优选0. 2 0. 8vvm(volume per volume per minute :每单位体积的气体通气量)，优选为 0. 2 0. 6vvm，或者也可以为10 50L/min(表示在1分钟内将10 50L无菌空气通气到 25 83L液体培养基中的量)，优选为20 40L/min。本发明中使用的培养槽只要是具有可以保持期望量培养液的容量、且能够防止微生物从外部混入的容器即可。优选的是，可以使用具有可对所保持的培养基进行加热加压杀菌的构造的培养槽，但是如果保持培养液的培养槽本身可由高压灭菌器等进行杀菌，则不需要用于加压杀菌的功能。另外，优选具有将无菌空气导入容器内的功能、或能够附加用于该功能的装置的培养槽。也可以使用通常的小型发酵罐，但在该情况下，培养时不需要使用机械搅拌功能。本发明中使用的培养槽的大小根据生产的液体种菌的量来适宜调整即可。在本发明的液体种菌生产中，可以为连续培养或单次培养中的任意一者，优选为单次培养，即，优选每次培养进行蘑菇子实体生产的每单位所使用的液体种菌。另外，在液体种菌的生产中进行大量培养(在本申请说明书中也称为“本培养”)的情况下，可以将在琼脂培养皿等中生长的菌丝体直接用于本培养。作为优选的实施方案， 首先通过使用烧瓶等对菌丝体进行搅拌或振荡来进行小规模的预培养，然后使用该预培养物进行本培养。在该情况下，通过在本培养时采用本发明的液体种菌生产方法，可以有效且廉价地大量生产液体种菌。本发明人发现，即使在上述通过使用烧瓶等的振荡来进行的小规模预培养中，通过使所使用的液体培养基中含有低浓度的植物油，与不含有低浓度的植物油的情况相比， 也可以较多地获得菌丝体。因此，通过使预培养时及本培养时所使用的液体培养基中含有低浓度的植物油，能够更有效且廉价地大量生产液体种菌。本申请说明书中使用的液体培养基使用通常用作蘑菇的液体培养营养源的那些物质作为营养源，可以使用(例如)含有碳源、氮源、无机盐等可以同化的营养源的液体培养基。例如，可以使用葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、糊精、甘油、淀粉等碳水化合物等碳源，以及蛋白胨、肉提取物、棉籽粉、大豆粉、酵母提取物、酪蛋白、玉米浆、NZ-胺、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等氮源，还可以含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钠、食盐、碳酸钙、硫酸镁、氯化锰等无机盐，只要是可培养上述蘑菇菌丝体的液体培养基即可。对本申请说明书中所谓的“植物油”没有特别的限定，只要为来自植物的油即可， 从安全性及获得难易的方面考虑，优选为食用油。作为食用油，可以列举(例如)米糠油、 菜籽油、红花油、玉米油、橄榄油、芝麻油、大豆油、棉籽油等。另外，以这些油为原料的色拉油等加工油也可用于本发明。这些植物油可以用公知的方法进行制备，也可以使用市售品。 本发明中，也可以将这些植物油中的1种或2种以上混合在培养基中而使用。本发明中，培养基中植物油的含量相对于液体培养基总量可以为低浓度，适宜为 0. 001 0. 1体积％ (ν/ν)，优选为0. 005 0. 1体积％ (ν/ν)，进一步优选为0. 01至小于 0.05体积％ (ν/ν) 0利用该低浓度的植物油，可以在液体培养中在不覆盖液体培养基表面的条件下进行使用。本发明的液体种菌培养可以通过公知的方法进行，培养温度和培养时间可以在蘑菇菌丝体可繁殖的范围内来适宜地决定。作为一个例子而不是对本发明的特别限定，例如， 可以按照下述工序进行。在200mL PGY液体培养基[组成葡萄糖1.49% (w/v)、蛋白胨 0. 15% (w/v)、酵母提取物 0. 15% (w/v)、KH2PO4O. 0373 % (w/v)、及 MgSO4 · 7Η200· 0373 % (w/v),pH 6.0]中接种荷叶菇的菌丝体，在25°C培养14天，制备预培养物。接着，在另行制备的430L PGY液体培养基中以相对于培养基为0.001 0.04体积％的量添加植物油(例如，色拉油[日清色拉油，日清才4 1J才夕·^一株式会社制])，制备本培养用的液体培养基。将该液体培养基填充到培养槽中，在118°C下进行90分钟高压蒸气灭菌。自然冷却开始后立即利用无菌空气进行通气，将培养槽内调成正压。将该培养基冷却后，接种上述全部的预培养物，在培养温度25°C、通气量0. ^vvm、内压0. 075MPa、无动力搅拌(鼓泡)的培养条件下，进行6 7天培养，生产液体种菌。将如上生产的液体种菌无菌转移到适当的容器(例如，聚丙烯制的圆形瓶等)中， 直到摄取至菌床培养基为止的这一期间，可以保持在控制为3 -1°C范围的环境下以保存。接着，使用上述液体种菌，可以通过(例如)作为菌床栽培方法的瓶栽、袋栽、箱栽等来生产蘑菇子实体。作为一个例子，对利用瓶栽的本发明的使用液体种菌的蘑菇子实体的生产方法进行描述，该方法由菌床培养基的制备、装瓶、灭菌、液体种菌的接种、菌床培养、(如果需要，搔菌)、发芽、(如果需要，插芽的分离、插芽的移植)、生长繁殖、收获等各工序组成。例如，可以将通过本发明的方法所生产的液体种菌用作以下种菌如果为荷叶菇， 则用作进行日本特开平04-211308号公报所述的菌床栽培时的种菌；如果为香菇，则用作进行日本特开平04-075538号公报所述的菌床栽培时的种菌；如果为真姬菇，则用作进行日本特开平05-268942号公报所述的菌床栽培时的种菌；或者，如果为本占地菇，则用作进行日本特开2000-106752号公报所述的菌床栽培时的种菌。另外，如果为进行插芽的分离及插芽的移植的菌床栽培的情况，则也可以将通过本发明的方法所生产的液体种菌用作进行日本特开2009-017872号公报所述的菌床栽培时的种菌。但是，与使用固体种菌时的菌床栽培用培养基或通常使用的菌床栽培用培养基相比，本发明的蘑菇子实体的生产方法中使用的菌床栽培用培养基优选使菌座提高，适当的是，使菌座位于比瓶口低2 IOmm的下方。另外，优选将菌座表面均勻地平面化。进而，瓶中央部的穴(也称为孔或接种孔)不是特别需要的，可以使用在每个瓶的瓶渊附近(即，瓶中央部的周边)开2 6处、优选4处口径3 IOmm左右、优选5mm左右、深度100 200mm 左右、优选110 150mm左右的小穴(也称为孔或接种孔)的菌床栽培用培养基。在此，本申请说明书中，所谓“菌座”是指栽培用培养基上部表面的菌接种部位。 例如，在瓶栽用培养基中，将瓶开口部的露出的培养基表面称为菌座。本发明中，优选的是， 与使用固体种菌时的菌床栽培用培养基(也称为菌床栽培用固体培养基、菌床栽培用培养基)相比，使菌座提高(即距离瓶口近)，例如，在瓶栽的情况(如图1所示使用固体种菌的情况)下，推荐的是，将通常的瓶栽所使用的市售的850mL瓶或IlOOmL瓶的瓶口(瓶渊) 下方15mm处设为菌座，但本发明中，优选的是，与使用固体种菌时的菌床栽培用培养基的菌座相比，使菌座提高，优选将位于瓶口下方2 IOmm处、进一步优选瓶口下方5 9mm处设为菌座。将通过发明的方法生产的液体种菌接种在菌床栽培用培养基中时，对于每瓶 850mL的广口培养瓶，无菌地移植(例如)约10 20mL即可。作为接种上述液体种菌的方法，不需要使用特殊的机械以喷雾状地在菌座及接种孔上均勻地进行接种，仅直接将必需量的液体种菌无菌地添加在菌座上即可。添加液体种菌的菌座上的位置优选位于菌座的中央部附近。与用于大规模蘑菇子实体的商业生产的固体种菌相比，根据本发明，能够在极短时间内生产用于蘑菇子实体的商业生产的液体种菌。例如，在生产上述固体种菌的情况下， 将预培养后的液体菌丝或固体菌丝接种在固体培养基中。然后，使菌丝在固体培养基中蔓延约30 60天。将得到的蔓延有菌丝的固体培养基作为固体种菌，用于蘑菇子实体的商业生产。与此相对，在通过本发明方法得到液体种菌的情况下，将预培养后的液体菌丝接种于本发明的液体培养基。然后，通过进行约3 7天、优选6 7天的培养，从而可以生产液体种菌，且可以用于蘑菇子实体的商业生产。另外，将通过本发明方法生产的液体种菌用于大规模的蘑菇子实体的商业生产， 由此可以避免由固体种菌的批次差造成的蘑菇子实体生产时的生产差异，并且可以稳定地生产优良的蘑菇子实体。以上列举实例对瓶栽方法进行了说明，但是通过本发明的方法生产的液体种菌并不限定于在利用上述瓶栽的菌床栽培中的使用。[实施例]下面通过实施例对本发明进行更具体说明，但本发明并不仅限定于以下实施例的范围。实施例1在200mL PGY液体培养基组成葡萄糖1. 49% (w/v)、蛋白胨0. 15% (w/v)、酵母提取物 0. 15% (w/v)、KH2PO4O. 0373% (w/v)、及 MgSO4 · 7H20 0. 0373% (w/v)，pH 6· 0中接种 Lyophyllum decastes K-3304 (FERM BP-4348)的菌丝体，在 25°C下进行 14 天振荡培养(IOOrpm)，制备预培养物。接着，在另行制备的430L PGY液体培养基中，以相对于培养基为约0. 02% (ν/ν) 的比率添加作为植物油的色拉油(日清色拉油，日清才^ 'J才夕·^一株式会社制)，制备本培养用的液体培养基。培养槽使用的是没有搅拌能力的非第一类压力容器。将加入有本培养用液体培养基的培养槽在118°C下进行90分钟高压蒸汽杀菌，自然冷却开始后立即进行利用无菌空气的通气，将培养槽内调成正压。将该培养基冷却后，接种上述全部的预培养物，在培养温度25°C、通气量0. 26vvm,内压0. 075MPa、无动力搅拌(鼓泡)的培养条件下， 进行6 7天培养，制备液体种菌。同时，仅利用PGY液体培养基进行无动力搅拌(鼓泡)培养，作为比较对照。其他的培养条件与上述条件相同，比较菌体的收获量。将其结果示于表1。[表 1]
条件干燥菌体重量(g/L)有色拉油4. 1无色拉油3. 0表1表明，在使用本发明的添加有色拉油的培养基的、使用不伴有机械搅拌的气泡所进行的培养中，与没有添加时的情况相比，可以得到约多1. 36倍的菌体。实施例2为了确认通过本发明的方法生产的液体种菌的子实体形成能力，进行如下的子实
体生产。液体种菌通过与实施例1同样的方法进行制备。作为比较对象，固体种菌如下进行制备。首先，在聚丙烯制的广口培养瓶(850mL，信越农材株式会社制)中加入IOOg锯屑 (杉材)、86g米糠、2g硅酸铝镁(富士化学工业株式会社制，商品名Neusilin FH1)、5g碳酸钙(Nacalai Tesque株式会社制，一级试剂)、3g—水柠檬酸(Nacalai Tesque株式会社制，一级试剂)，并将水分含量设定为63 65重量％，充分混合，压实成为湿润状态的物质。 在压实物表面的中央开直径Icm左右的接种孔部，盖上盖子后，在118°C下进行90分钟高压蒸汽杀菌，自然冷却至20°C。对这样得到的固体培养基接种约10 20mL的实施例1所述预培养物。然后，在暗处，在温度25°C、湿度55%的条件下培养菌丝体约60天，使菌丝蔓延到固体培养基整体，制备固体种菌。
接着，在聚丙烯制的广口培养瓶(llOOmL，山田产业株式会社制)中加入134g锯屑(杉材)、130g米糠、2. 6g硅酸铝镁[富士化学工业株式会社制，商品名Neusilin FH1], 6. 5g碳酸钙(Nacalai Tesque株式会社制，一级试剂)、3. 9g—水柠檬酸(Nacalai Tesque 株式会社制，一级试剂)，将水分含量设定为63% 65重量％，充分混合，将菌座设定在距瓶口约15mm的下方，压实成为湿润状态的物质。在压实物表面的瓶中央开直径2cm左右的接种孔部，盖上盖子后，在118°C下进行90分钟高压蒸汽杀菌，将自然冷却至20°C的培养基作为菌床栽培用培养基。在该菌床栽培用培养基上接种约20mL上述制备的液体种菌。作为比较对象，准备接种有约35g上述制备的固体种菌的培养基。各制作16瓶分别接种有液体种菌及固体种菌的菌床栽培用培养基。将它们在暗处，在温度25°C、湿度55%的条件下下培养菌丝体约60天，使菌丝蔓延到菌床栽培用培养基整体。然后，取下盖子，进行菌床面上部的搔菌，接着，加入自来水至瓶口后，立即排水，供于发芽工序。发芽工序在发芽室中在以下条件下进行照度50勒克司、温度16°C、湿度控制在作为一 S τ 4 100(鹭宫制作所制)的示值的115% 120%范围内、二氧化碳浓度控制在1000 1500ppm的范围。另外，为了避免结露，将瓶倒置，继续培养11天，形成子实体原基。然后，将瓶反转 正置，过渡到前期生长工序。在前期生长工序中，在生长室中在以下条件下培养6天照度500勒克司、温度16°C、湿度控制在作为t-一 S τ 4 100的示值的 115% 120%范围内、二氧化碳浓度控制在1000 2000ppm的范围。接着，过渡到后期生长工序。在后期生长工序中，在生长室中在以下条件下继续培养7天照度500勒克司、温度16°C、湿度控制在作为匕工一 7、100的示值的95 105%范围内、二氧化碳浓度控制在1000 2000ppm的范围。收获这样得到的成熟子实体后，比较子实体的平均收获量(g/ 瓶)。将其结果示于表2。[表 2]
权利要求
1.一种蘑菇的液体种菌的生产方法，其为用于生产蘑菇子实体的液体种菌的生产方法，其特征在于，在含有植物油的液体培养基中，通过使用气泡搅拌培养基来对蘑菇的菌丝体进行液体深部培养。
2.如权利要求1所述的生产方法，其中，基本上仅使用气泡来对培养基进行搅拌。
3.如权利要求1所述的生产方法，其中，所述植物油为选自色拉油、米糠油、菜籽油、红花油、玉米油、橄榄油、芝麻油、大豆油及棉籽油中的1种或多种。
4.如权利要求1 3中任一项所述的生产方法，其中，所述培养基中的所述植物油浓度为0. 001 0. 1体积％。
5.一种蘑菇子实体的生产方法，其特征在于，使用了通过权利要求1 4中任一项所述的生产方法而得到的蘑菇的液体种菌。
6.如权利要求5所述的蘑菇子实体的生产方法，其为瓶栽法。
7.如权利要求5或6所述的蘑菇子实体的生产方法，其特征在于，使用菌座提高了的菌床栽培用培养基。
全文摘要
本发明提供一种蘑菇子实体的大规模商业生产中廉价且有效的液体种菌生产方法、以及使用该液体种菌的蘑菇子实体生产方法。本发明涉及一种蘑菇的液体种菌的生产方法，其为用于生产蘑菇子实体的蘑菇液体种菌的生产方法，其特征在于，在含有植物油的液体培养基中，通过使用气泡搅拌培养基来进行液体深部培养。另外，本发明还涉及一种蘑菇子实体的生产方法，其特征在于，在瓶栽中，使用菌座进一步提高了的菌床栽培用培养基。根据本发明，可以大幅缩短种菌生产时间，另外，可以避免使用固体种菌的蘑菇子实体生产时的生产不均匀性的风险，并且可以稳定地生产优良的蘑菇子实体。
文档编号A01G1/04GK102369838SQ20111023156
公开日2012年3月14日 申请日期2011年8月11日 优先权日2010年8月11日
发明者喜多昭彦, 大岛健一, 日下部克彦, 桥元勇二 申请人:宝生物工程株式会社