专利名称：一种辅助鉴别玉米单倍体诱导系的方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴别玉米单倍体诱导系的方法。
背景技术：
玉米单倍体产生的主要途径是诱导系杂交诱导途径产生母本(雌性)单倍体，简称为孤雌生殖单倍体。孤雌生殖单倍体可以通过生物诱导和非生物诱导(如化学诱导)等途径产生，但非生物诱导的问题与花药组培一样存在很多困难，很难在育种上应用。生物诱导是利用生物诱导材料使诱导对象产生单倍体。Coe (Coe E H.A line of maize withhigh haploid frequency [J].Am Nat, 1959,93:381-382)在 1959 年发现了玉米孤雌生殖诱导系Stock6。后来在其基·础上不断改造,如转入Navajo (ACR-nj)遗传标记基因，通过籽粒颜色和植株颜色鉴定出单倍体，从而使杂交诱导单倍体进行单倍体育种成为了可能。但是在实践应用中也发现，Stocke的诱导率也很低(约为3% )，并且存在很多严重的缺陷，如雄花对温度敏感，自交结实性差，穗粒腐病严重，Navajo遗传标记较弱。因此，利用Stocke诱导单倍体的关键是要在保持其诱导能力的前提下克服上述缺点。国外在这方面起步较早，并已取得了较大进展，选育出了一些优良的诱导系，如法国的WS14(LashermesP, Beckert M.Genetic control of maternal haploidy in maize (Zea mays L.) andselection of haploid inducing lines[J].Theor Appl Genet,1988,76 (3):405-410)、前苏联的KEMS (Shatskaya 0 A.et al,Mass induction of maternal haploids in corn [J].Maize Genet Coop Newslett, 1994,68:51),摩尔多瓦的 MHI (Chalyk S T.Creating newhap1id-1nducing lines of maize[J].Maize Genet Coop Newslett, 1999, 73:53-54),德国的 RWS(F.K.Rober et al., In vivo haploid induction in maize-Performance ofnew inducers and significance of doubled haploid lines in hybrid breeding[J].Maydica，2005，50:275-283)等等。这些新选的诱导系不但适应当地的环境，而且其诱导率及遗传标记也进一步提高，利用价值已经大大超出了 Stock6。诱导系的选育是耗时费力的过程，一个诱导系的选育往往要花费7-10年时间。由于诱导系的选育需要每代单株测验诱导率，选育规模越大所需的工作量越大。例如某世代测验规模为400个株系，每个株系有10株，每株测验3穗测验种，就将测验12000个果穗，仅田间种植就将需要5亩试验地。收获后，对得到的杂交果穗挑选单倍体，测定单株诱导率。单倍体的筛选在世界范围内均为手工操作，一个熟练工每日可完成30个果穗的单株诱导率测定工作，那么仅考种一项，就需要10个熟练工连续工作40天。如果缩小育种规模在常规选育条件下往往会丢失掉诱导性状。由于诱导性状选育的复杂性，很难在选择诱导率的同时兼顾农艺性状等，造成诱导系本身适应性差。我国各生态区域气候条件复杂，现有的诱导系很难在全国各地广泛使用，加之在不适合的气候条件下，诱导系可能会不散粉、不结实等，造成巨大经济损失。因此有必要在不同生态区域选育适合当地气候条件的诱导系，有必要突破常规方法，降低单倍体诱导性状的选育难度，提高诱导系选育效率，使得诱导系的选育过程中诱导率与农艺性状能够被兼顾。
发明内容
本发明的一个目的是提供第一种辅助鉴别玉米单倍体诱导系的方法。本发明所提供的种辅助鉴别玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤:检测待测玉米的结实率、胚乳败育率和胚败育率，若所述待测玉米的结实率、胚乳败育率和胚败育率满足如下条件1)、2)或3)，则确认所述待测玉米候选为玉米单倍体诱导系;1)为如下1、II和III所示:1、结实率为80%以下；11、胚乳败育率为4%以上；II1、胚败育率为3.5%以上；2)为如下1、II和III所示:1、结实率为70%以下；I1、胚乳败育率为10%以上；II1、胚败育率为3.5%以上；3)为如下1、II和III所示:1、结实率为70%以下；I1、胚乳败育率为8%以上；II1、胚败育率为1.5%以上。所述结实率、胚乳败育率和胚败育率为本领域常用的指标，均可用现有方法检测。本发明的另一个目的是提供另一种辅助筛选玉米单倍体诱导系的方法。本发明的提供的辅助筛选玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤:(1)杂交1:以已知单倍体诱导系为父本，以目标玉米自交系为母本，进行杂交，得到Fl代杂交玉米果穗；(目标玉米自交系一般指根据实际需要而选择的具有目标性状的玉米，如适合于在目的区域内生长的玉米)(2)自交 1:将所述Fl代杂交玉米果穗中的杂交玉米籽粒进行播种，得到Fl代玉米植株；将Fl代植株进行自交，得到F2代果穗。(3)自交 2:种植F2代果穗，得到F2代植株；对F2代玉米植株进行自交，得到F3代自交玉米果穗；选取满足如下条件的F3代自交玉米果穗，记作目的F3代自交玉米果穗；所述条件为1、II和III所示:1、结实率为80 %以下；I1、胚乳败育率为4%以上；II1、胚败育率为3.5%以上；种植所述目的F3代自交玉米果穗中的籽粒，得到F3代玉米植株，即得到玉米单倍体诱导系。上述另一种辅助筛选玉米单倍体诱导系的方法中，所述步骤中，在所述步骤(3)之后，包括如下步骤(4):将所述目的F3代自交玉米果穗中的玉米籽粒均进行播种，得到F3代玉米植株；将F3代玉米植株进行自交，得到F4代自交玉米果穗；选取满足如下条件的F4代自交玉米果穗，记作·目的F4代自交玉米果穗；所述条件为1、I1、III和IV所示:1、结实率为70 %以下；I1、胚乳败育率为10%以上；II1、胚败育率为3.5%以上；IV、来自于同一个F3代杂交玉米果穗的F4代自交玉米果穗的结实率、胚乳败育率和胚败育率均一致。上述另一种辅助筛选玉米单倍体诱导系的方法中，所述已知单倍体诱导系为玉米自交系CAU5 ；上述另一种辅助筛选玉米单倍体诱导系的方法中，所述目标玉米自交系为玉米自交系N1680。上述第一种辅助鉴别玉米单倍体诱导系的方法在筛选玉米单倍体诱导系中的应用也属于本发明的保护范围。上述第一种辅助鉴别玉米单倍体诱导系的方法在玉米育种中的应用也属于本发明的保护范围。本发明为培育玉米单倍体诱导系的方法，是利用自交籽粒结实与败育性状筛选玉米单倍体诱导系，可以不通过单株诱导率测验，淘汰掉大量无诱导率或低诱导率单株，增大单倍体诱导系的选育效率，加速单倍体诱导系的选育过程。在与以往相同选育规模下，可以更加注重对农艺性状的筛选。本发明方法尤其适合于培育在目的区域环境内能够进行单倍体诱导的单倍体诱导系，即以适合于在目的区域内生长的玉米为母本，用已知的单倍体诱导系作为父本，按照本发明方法进行操作，便可以得到既具有父本的单倍体诱导性状又具有母本的适应于目的区域环境的性状的单倍体诱导系。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1、高油单倍体诱导系CAUHO1:CAUH0I为高油单倍体诱导系(Liang Li, XiaoweiXu, Weiwei Jin, Shaojiang Chen.Morphological and molecular evidences for DNAintrogression in haploid induction via a high oil inducer CAUHOI in maize.Planta，2009，230:367-376)，诱导率在2 %，具有R_nj标记，公众可以从中国农业大学获得。2、高频单倍体诱导系CAU5、CAU079:单倍体诱导系CAU5、CAU079为中国农业大学选育的二代单倍体诱导系，平均诱导率均达到10%以上，具有R-nj标记，在“陈绍江，黎亮，李浩川.玉米单倍体育种技术[M].中国农业大学出版社，2009.”一书中公开过，公众可以从中国农业大学获得。
3、高频单倍体诱导系UH400:UH400单倍体诱导率达到8%左右，在文献“PriggeV, Sanchez C, Dhillon BS, Schipprackff, Araus JL, Banziger M, Melchinger AE.Doubledhaploids in tropical maize:1.Effects of inducers and source germplasm on invivo haploid induction rates.Crop Sci, 2011, 51:1_9 ”中公开过，由德国霍恩海姆大学选育，公众可以从中国农业大学获得。4、高油玉米自交·系N1680在文献“陈绍江，姜海鹰，宋同明.玉米显性高油基因存在的若干证据[J]，中国农业大学学报，2004，9 (6) 7-8”中公开过，公众可以从中国农业大学获得。5、BY815，GY923，GY302, GY220为高油玉米自交系，在文献“姜海鹰，陈绍江，高兰锋，邢吉敏，宋同明，戴景瑞.高油玉米自交系的杂种优势群划分和优势模式分析[J]，作物学报，2005，31 (3):361-367"中公开过，公众可以从中国农业大学获得。6、Mol7、178、黄C、综3、综31、P138为常规自交系，在“曹广才，徐雨昌.实用玉米自交系[M].气象出版社，2000.” 一书中详细介绍。公众可以从中国农业大学获得。7、自交系 B73 为常规玉米自交系，在 “HallauerA R.Specialty Corns [M].CRCPress.2001” 一书中详细介绍。公众可以从中国农业大学获得。8、玉米自交系1145，在“陈绍江，宋同明.利用高油分的花粉直感效应鉴别玉米单倍体[J]，作物学报，2003，29 (4):587-590”中公开过，公众可以从中国农业大学获得。玉米杂交种郑单958购自北京德农种业有限公司。1、结实率定义为:(即雄穗花粉、雌穗花丝均处于正常活力状态下)，雌穗上的结实数占总胚囊数的比率；检测方法为自交果穗未脱粒之前，单穗统计自交果穗上的籽粒数与胚囊数；结实率=果穗中的籽粒数目/果穗中的胚囊数目；I1、胚乳败育率定义为:胚乳败育的籽粒数量占所有籽粒数量的比率；检测方法为自交果穗未脱粒之前，单穗统计自交果穗上的胚乳败育的籽粒数量与总籽粒数量；胚乳败育率=果穗中胚乳败育的籽粒数目/果穗中的籽粒总数目；胚乳败育的籽粒的判定标准:胚胎在发育过程中，胚乳发育中途停止，而呈现出籽粒明显较小，籽粒皱缩或空泡化的现象。II1、胚败育率定义为:是指胚败育的籽粒数量占所有籽粒数量的比率；检测方法为自交果穗脱粒后，单穗统计自交果穗中胚败育的籽粒数量与胚乳正常籽粒数量；胚败育率=果穗中胚败育的籽粒数目/果穗中的胚乳正常籽粒数目；胚败育的籽粒的判定标准:胚败育籽粒具有正常的胚乳外形，因此籽粒大小与正常籽粒无显著差别，但其胚部凹陷，种皮与胚乳紧贴，无胚或胚发育不全。IV、单倍体诱导率定义为:是指果穗中单倍体籽粒数量占有R-nj标记籽粒数量的比率。其中胚乳呈紫颜色且胚无颜色的玉米籽粒为单倍体籽粒，胚乳呈紫颜色且胚呈紫颜色的玉米籽粒为杂交籽粒。实施例1、不同自交系中，单倍体诱导率与自交果穗的结实性、胚乳败育性、胚败育性显著相关玉米自交系CAU5、CAUHO1、CAU079、UH400、N1680、B73，Mo 17，BY815，GY923，GY302，GY220, P138，综 3，综 31，178，黄 C，1145。其中 CAU5、CAUHO1、CAU079、UH400 为单倍体诱导系，其余均为常规自交系。
按照以上定义对上述17个材料的自交结实率、胚乳败育率、胚败育率、单倍体诱导率进行分析，其中4个诱导系的单倍体诱导率按上述定义方法进行。对于剩余的13个常规自交系未统计单倍体诱导率。有研究表明玉米也是二倍体(2n = 20)，单倍体(2n =10)的自然发生频率很低，只有 0.1 (Chase SS.Monoploid frequencies in commercialdouble cross hybrid maize and in its component single cross hybrids and inbredlines.Genetics，1949，34:328 332)，而上述的13个常规自交系都是生产上大规模应用的骨干自交系，未见任何报道指出这些自交系具有单倍体诱导能力，因此此处这13个常规自交系的单倍体诱导率被视为0，统计结果如下:表1、17个玉米自交系自交果穗性状统计表
权利要求
1.一种辅助鉴别玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤: 检测待测玉米的结实率、胚乳败育率和胚败育率，若所述待测玉米的结实率、胚乳败育率和胚败育率满足如下条件I)、2)或3)，则确认所述待测玉米候选为玉米单倍体诱导系； 1)为如下1、II和III所示: 1、结实率为80%以下； I1、胚乳败育率为4%以上； II1、胚败育率为3.5%以上； 2)为如下1、II和III所示: 1、结实率为70%以下； I1、胚乳败育率为10%以上； II1、胚败育率为3.5%以上； 3)为如下1、II和III所示:实率为70%以下； I1、胚乳败育率为8%以上； II1、胚败育率为1.5%以上。
2.一种辅助筛选玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤: (1)杂交1:以已知单倍体诱导系为父本，以目标玉米自交系为母本，进行杂交，得到Fl代杂交玉米果穗； (2)自交I: 将所述Fl代杂交玉米果穗中的杂交玉米籽粒进行播种，得到Fl代玉米植株；将Fl代植株进行自交，得到F2代果穗； (3)自交2: 种植F2代果穗，得到F2代植株；对F2代玉米植株进行自交，得到F3代自交玉米果穗；选取满足如下条件的F3代自交玉米果穗，记作目的F3代自交玉米果穗； 所述条件为1、II和III所示: 1、结实率为80%以下； I1、胚乳败育率为4%以上； II1、胚败育率为3.5%以上； 种植所述目的F3代自交玉米果穗中的籽粒，得到F3代玉米植株，即得到玉米单倍体诱导系。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述步骤中，在所述步骤(3)之后，包括如下步骤⑷: 将所述目的F3代自交玉米果穗中的玉米籽粒均进行播种，得到F3代玉米植株； 将F3代玉米植株进行自交，得到F4代自交玉米果穗；选取满足如下条件的F4代自交玉米果穗，记作目的F4代自交玉米果穗； 所述条件为1、I1、III和 IV所示: 。1、结实率为70%以下； I1、胚乳败育率为10%以上； II1、胚败育率为3.5%以上；IV、来自于同一个F3代杂交玉米果穗的F4代自交玉米果穗的结实率、胚乳败育率和胚败育率均一致。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述已知单倍体诱导系为玉米自交系 CAU5 ； 所述目标玉米自交系为玉米自交系N1680。
5.权利要求1所述方法在筛选玉米单倍体诱导系中的应用。
6.权利要求1所述方法在玉米育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴别玉米单倍体诱导系的方法。本发明方法包括如下步骤检测待测玉米的结实率、胚乳败育率和胚败育率，若所述待测玉米的结实率、胚乳败育率和胚败育率满足如下条件1)、2)或3)，则确认所述待测玉米候选为玉米单倍体诱导系。本发明方法尤其适合于培育在目的区域环境内能够进行单倍体诱导的单倍体诱导系，即以适合于在目的区域内生长的玉米为母本，用已知的单倍体诱导系作为父本，按照本发明方法进行操作，便可以得到既具有父本的单倍体诱导性状又具有母本的适应于目的区域环境的性状的单倍体诱导系。
文档编号A01H1/02GK103081802SQ20111033216
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者陈绍江, 徐小炜, 黎亮, 董昕 申请人:中国农业大学