专利名称：棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术(工程)领域，具体地说，涉及棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因、 其编码蛋白以及利用该基因改良棉花品种的方法。
背景技术：
棉花是最重要的天然纤维作物，纤维品质是棉纤维的重要性状指标，而棉纤维品质由纤维发育所决定的。棉纤维由胚珠外珠被表皮层分化的单细胞发育而来，其发育依次经过四个相互重叠的阶段纤维原始细胞分化突起、纤维细胞伸长(初生壁形成期)、次生壁加厚、脱水成熟。初生壁和次生壁的发育对棉纤维品质形成至关重要，因此分离和鉴定控制纤维伸长和次生壁发育的基因是了解纤维细胞发育的分子调控机制的基础，也是进行纤维品质分子改良的前提。磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)是真核细胞中主要的磷脂组分，分布于细胞膜的磷脂双分子层内侧，约占细胞磷脂总量的10%。PI可以经过磷脂酰肌醇4-激酶(Phosphatidylinositol 4-kinase，PI4K)的催化生成磷脂酰肌醇-4-磷酸(PIP)，而后经历一系列的反应途径，生成细胞内重要的双信使分子三磷酸肌醇 (Trisphosphateinositol, IP3)和二酯酰甘油(Diaeylglyeerol，DAG)，从而将胞外信号变为胞内信号。有研究表明，这一信号途径在包括花粉管和根毛的极性伸长、细胞的极性膨胀过程和细胞壁合成等多种发育过程中起着重要的信号传递和调节作用。例如在棉纤维的发育中，与次生壁的发育有关的PI信号途径的调节则控制细胞骨架的形成，或者通过调节质膜上纤维素复合体的作用而控制纤维素沉积的方向。可见棉纤维细胞壁的发育可能受到PI 信号途径的调节从而影响纤维品质的形成。磷脂酰肌醇4-激酶(Wiosphatidylinositol 4-kinase, PI4K)作为这一系列代谢路径中的关键环节，其对于PI信号途径的调控作用可能通过影响细胞壁的发育而影响纤维品质。关于磷脂酰肌醇4-激酶参与调节棉纤维发育更为重要的证据，在于我们探测到棉纤维的次生壁加厚期，在两个纤维品质差异较大的陆地棉“中棉所8号(CRI 8)”和海岛棉“Pima 90-53”之间，磷脂酰肌醇4-激酶基因具有转录多态性，其转录组标记TDF与纤维强力QTL表现共分离，说明(ΛΡΙ4Κ基因是控制海岛棉和陆地棉间棉纤维强力差异的重要候选基因；进一步研究发现，转化反义磷脂酰肌醇4-激酶基因的拟南芥植株细胞壁发育受到影响，而且茎秆断裂强度显著降低。综合以上分析认为，磷脂酰肌醇4-激酶基因对于了解棉纤维品质形成的内在机制有重要意义，在棉纤维品质改良中具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一个与棉纤维发育有关的磷脂酰肌醇4-激酶基因((ΛΡΙ4Κ) 及其编码蛋白。本发明的另一目的是提供利用(ΛΡΙ4Κ基因改良棉花品种的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因的编码蛋白，其为1)由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列构成的蛋白；或2) SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。例如，将第178 位的Arg取代为Gln，或是将第267位的Lys缺失，或是在183位增加His，均不会影响蛋白的功能。编码前述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列Q817bp)，其编码框 (ORF)为自5，端第547位至第M72位，编码具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白质。含有上述序列的基因工程载体、转基因细胞系和宿主菌、扩增其任意片段的引物以及其反义序列也属于本发明的保护范围。本发明提供的棉花品种的改良方法，是指利用转基因技术，将本发明的棉纤维发育相关基因(ΛΡΙ4Κ或该基因的部分片段导入棉花细胞或组织，导致该基因的表达特性发生改变(例如在棉株开花16天以后，检测到棉纤维中该基因的表达量增加)，从而获得棉纤维性状得到改良的转基因细胞或组织。本发明首次公开了棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因((ΛΡΙ4Κ)、其编码蛋白以及利用该基因改良棉花品种的方法。由于磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)是催化磷脂酰肌醇生成细胞内重要的双信使分子三磷酸肌醇和二酯酰甘油的一个关键酶，通过转录组QTL定位，发现 (ΛΡΙ4Κ基因是控制海岛棉和陆地棉间棉纤维强力差异的重要候选基因。将反义的(ΛΡΙ4Κ基因转入Columbia型拟南芥，转基因的拟南芥茎秆机械组织细胞壁发育受到显著影响，根的伸长和茎秆强度降低。本发明获得的(ΛΡΙ4Κ基因可用于棉花遗传改良以改善棉纤维品质，具有潜在的经济效益和应用价值。
图1为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因ORF的扩增结果；图中M是11Λ ladder, 1是磷脂酰肌醇4_激酶基因ORF的扩增产物。图2为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因5’ RACE的扩增产物；图中M是DL 2000Marker, 1是第一轮PCR的产物；2是巢式PCR的产物。图3为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因3’ RACE的扩增产物；图中M是DL 2000Marker, 1是第一轮PCR的产物；2是巢式PCR的产物。图4为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因在不同器官的表达水平的半定量 RT-PCR分析结果；图中1、2和3分别代表根、下胚轴和叶片。图5为本发明棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因在纤维不同发育阶段表达水平的 RT-PCR分析结果；图中Pima90-53和CRI 8分别是海岛棉和陆地棉品种。图6为本发明E.coli BL21(DE3)中诱导前后目的基因重组融合蛋白表达的 SDS-PAGE检测结果；图中箭头所指为目标蛋白，1 经IPTG诱导处理的BL21 (DE3) plys空菌株；2 经IPTG诱导处理含有pET-32a(+)空载体的BL21 (DE3)plys菌株；3，4 未经IPTG诱导处理含有pET-32a(+)-GbPI4K载体的BL21 (DE3)plys菌株；5，6 经IPTG诱导处理含有 pET-32a(+)-GbPI4K载体的BL21(DE3)plys菌株(表达有目标融合蛋白)；7 蛋白标准分子量。图7为本发明转反义基因T3代拟南芥植株与野生型比较；图中A为萌发时期幼苗(上为野生型对照，下为转基因植株)，B为生长20天的幼苗(上为野生型对照，下为转基因植株)，C为抽薹期植株(左为野生型对照，右为转基因植株)，D为幼苗叶面积比较(左为野生型对照，右为转基因植株)。图8显示转基因拟南芥与野生型拟南芥6 8d的根长变化；图中各培养皿左侧为野生型对照，右侧为转基因植株。图9为本发明转基因型拟南芥与野生型拟南芥的茎杆机械组织细胞壁厚度比较；图中A为野生型拟南芥茎杆，B为转反义(ΛΡΙ4Κ拟南芥茎杆。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中无特别说明均为常规方法，涉及到的引物合成以及序列测定由上海生工生物工程技术公司(Sangon)完成；总RNA提取试剂盒(RNAplant Reagent)、质粒提取试剂盒、PGM-T克隆载体和克隆试剂盒、ToplO感受态细胞、DH5 α感受态细胞、表达菌株BL21 (DE3)pLysS感受态细胞均购自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)； PrimeScript 1st cDNA synthesis 反转录试剂盒、SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒 (Clontech)和STOR Green I试剂等其他分子生物学试剂购自大连宝生物公司(TAKARA)； 使用 NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop)测定核酸浓度，使用 LightCycler 1. 5 (Roche)PCR 仪进行 Real-time PCR 分析。实施例1 (ΛΡΙ4Κ基因全长cDNA序列的获得GbPI4K基因全长cDNA序列的获得通过以下步骤完成(l)GbPI4K cDNA 的编码区(Open Reading Frame, 0RF)的克隆iJffi·岛丰帛(Gossypium barbadense) "Pima 90-53" Jf ^^ 21 ^ (days post anthesis, DPA)的纤维 mRNA 为材料，使用 PrimeScript 1st cDNA synthesis 反转录试剂盒获得cDNA，使用下列基因特异引物克隆(ΛΡΙ4Κ基因ORF序列。同时在上、下游引物中分别引入了 Mc I和Ml I酶切位点。基因的上下游引物分别为0RF_F 5 ’ GGCGAGCTCATGTCTCGCAAGTTGGA-3 ’，0RF_R:5’ GGCGTCGACCTATCTGGTAACGATAT-3’ ；PCR反应程序为94°C预变性2分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸3 分钟，共5个循环；94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸3分钟，共25个循环；72°C延伸 10 分钟。PCR 反应体系为cDNA 模板 50ng，IOXPCR Buffer (Mg2+) 2 μ L, dNTP (2. 5mmol/ L) 1· 6 μ L, lOumol/L 的上、下游引物各 1. O μ L，2. 5U/ μ L 的 PfuDNA 聚合酶 0. 25 μ L, dd H2O 补足至20 μ L0通过PCR获得目的条带1944bp (如图1所示)。扩增产物通过常规PCR产物回收、 TA克隆与序列测定，确认扩增结果的正确性，同时扩增产物也用于基因产物原核表达的载体构建。
(2)GbPI4K cDNA 的 5，和 3，UTR(非翻译区)的克隆使用cDNA 末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)扩增 GbP14K cDNA 的 5，和 3，UTR(非翻译区)。根据步骤(1)所获得的序列设计的RACE特异引物(3’ RACE引物为 5，-GAGCAGCTCCCAGGAAATGTGAGCT-3，，5，RACE 引物为 5，-CGTTCCGCACGGCACTAAGATCATT-3， )，使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒，按照说明书操作，进行3，RACE和5，RACE扩增。 RACE扩增的程序是94°C变性30秒，70°C退火30秒，72°C延伸3分钟，共5个循环；94°C变性30秒，68 °C退火30秒，72 °C延伸3分钟，共25个循环；72°C延伸10分钟。分别回收550bp和860bp的扩增产物。如果有必要，可使用巢式RACE引物按说明书操作，进行巢式 RACE 扩增。3，RACE 巢式引物为 5，-TTCCAGGAGTTGCTCTACCCGGGAT-3，，5， 巢式RACE引物为5’-AAAAACCCGTCTCCTCCCAACAGGT-3’。扩增程序与第一轮RACE扩增程序相同。相应的回收产物分别为480bp和700bp。GbPI4K cDNA的5，RACE扩增结果如图2所示，3，RACE扩增结果如图3所示。通过常规PCR产物回收、TA克隆与序列测定，并与步骤(1)所获得序列进行比较以确认(ΛΡΙ4Κ基因全长cDNA序列的正确无误，获得5，UTR片段长度为M6bp，3，UTR片段长度为34^p，基因ORF位于自5，端第547位至第M72位之间，编码具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白。实施例2 GbPI4K基因在不同器官的表达水平分析采用RT-PCR方法，对陆地棉“中棉所8号”和海岛棉“Pima 90-53"的棉花植株幼根、下胚轴和叶片的(ΛΡΙ4Κ基因表达水平进行半定量分析。所使用的(ΛΡΙ4Κ基因特异引物是Specific_F 5' -TGAAGCTGGCTGACATGAATG-3，，Specific_R 5' -CCTCTGTATCTGCTTCTGACCTA-3，；扩增使用一个内标基因EFl α作参照，其特异引物是EF1 α _F 5 ’ -GGTGGGATACAACCCTGACA-3 ’，EFl α _R :5，-TTGGGCTCATTGATCTGGTC-3，；PCR反应程序为94°C预变性1分钟；94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸30 秒，共25个循环；最后72°C延伸5分钟。PCR反应体系为cDNA模板50 200ng，10XPCR Buffer (Mg2+) 2 μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 1. 6μ L, lOumol/L 的上、下游引物各 1. 0μ L,2. 5U/μ L 的 Ex Taq DNA 聚合酶 0. 25 μ L, dd H2O 补足至 20 μ L。扩增产物经过琼脂糖电泳分析，其结果如图4所示。表明(ΛΡΙ4Κ基因在“中棉所8号”和“Pima 90-53”的幼苗根、下胚轴和叶的组织中，均有类似的表达量，幼苗的根中的表达量略低于下胚轴、叶中该基因的表达量。实施例3 GbP14K基因在纤维不同发育阶段表达水平的Real-time PCR分析使用陆地棉“中棉所8号”和海岛棉“Pima 90-53”为试材，提取开花当天胚珠以及开花后5、10、15、20、25、30、35*40DPA的纤维RNA，并反转录为单链cDNA。使用与实施例 2相同的基因特异引物和内标基因及其引物。按照STOR Green I和LightCycler 1. 5PCR 仪的说明进行分析。分析结果如图5所示，表明(ΛΡΙ4Κ基因在纤维发育中的表达水平前高后低，在20DPA以前表达较高，海岛棉中PI4K基因在25DPA表达量最高，并在35DPA时亦表现明显的活性；而陆地棉在15DPA表达活性较高，在25DPA时表达活性明显下降。海岛棉持续表达时间比陆地棉长近10天。海岛棉与陆地棉之间PI4K基因表达差异位于次生壁加厚期。实施例4 GbPI4K基因原核表达载体构建及诱导表达GbPI4K基因原核表达载体构建及诱导表达包括以下环节(1)原核表达载体的构建与转化子获得按照实施例1所述的引物引入限制性酶切位点，扩增(ΛΡΙ4Κ基因完整的编码框， 扩增产物克隆至PGM-T载体。提取阳性克隆的质粒，与原核表达载体pET-32a(+)使用相同的Mc I和Ml I酶处理，经过连接、转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选含重组质粒的阳性克隆，并经过测序验证以后，将成功构建的表达载体pET-32a(+)-GbPI4K通过热激法转入BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，获得含有重组质粒的大肠杆菌工程菌株。(2)重组蛋白的诱导表达与鉴定将含有以上重组质粒和含有空质粒(对照)的BL21(DE3)pLysS菌株在^°C、IPTG 的终浓度为1. Ommol/L的条件下诱导4. 5小时后，在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后经考马斯亮蓝R250染色分析。结果如图6所示，经IPTG诱导的含有重组质粒pET-32a(+)_GbPI4K的大肠杆菌 BL21 (DE3)与含空质粒对照相比，在大约92. OKDa出现一条特异带，未经诱导的对照不能得到该诱导蛋白。生物信息学预测可表达的目的融合蛋白包括(ΛΡΙ4Κ蛋白(约72.36KDa) 和ρΕΤ-3^ι标签蛋白(约20. 4KDa)。因此该特异蛋白就是是pET_32a (+) _GbPI4K在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的目的融合蛋白。实施例5反义(ΛΡΙ4Κ基因转化拟南芥(1)(ΛΡΙ4Κ反义载体的构建为构建反义表达载体，设计扩增(ΛΡΙ4Κ基因开放阅读框的引物，在引物两端添加酶切位点)(ba I和Me I，引物序列如下Pl :5’ -TCTGAGCTCTATATGTCTCGCAGGTTGGAC-3，P2 :5’ -TCGTCTAGAAAACTGGCACGAAGTACCG-3’PCR产物电泳回收，与pGEM-T fesy载体连接。连接产物经热激转化E. coli DH5ci。经PCR与酶切检测获得阳性克隆，并提取质粒测序验证，获得中间载体 pGEM-GbPI4K。提取中间载体质粒与真核表达载体pBI121的质粒DNA，使用相同的限制性内切酶为Xba I和Mc I进行酶切处理，回收目的片段并连接，连接产物通过热激法转入大肠杆菌 E. coli DH5a中。经PCR与酶切检测获得阳性克隆，并提取质粒测序验证，获得反义的真核表达载体 pBI121-GbPI4K。将构建好的重组载体pBI 121-GbPI4K转化农杆菌GV3101，经菌液PCR验证，获得含有重组质粒的农杆菌工程菌株。(2) GbPI4K反义载体转化拟南芥采用农杆菌浸花法(floral dip)进行Columbia型拟南芥的转化。成熟的拟南芥种子(转基因T1代)经干燥和春化后，种植于MS筛选培养基。使用100mg/L卡那霉素筛选，转基因阳性苗，移栽于蛭石培养。通过PCR检测初步确定转基因阳性植株。单株收获，MS培养获得T3代阳性拟南芥转基因植株，经Northern Blot检测确认和表型分析。在幼苗生长初期，转反义基因的拟南芥萌发较野生型晚，而且同一生长时期(生长20天)的幼苗比野生型要小(图7A、B)，另外，转反义基因的拟南芥抽薹时间较野生型晚约12天左右(图7C)，叶面积比野生型小(图7D)。在MS培养机上种植拟南芥，待其长到一定程度后(6天、7天和8天)测量根长，每组设三次重复，并在统计学0. 01水平下存在的极显著差异(图8)，转基因材料比野生型的根长短。例如第8天，转基因拟南芥平均根长为5. 07mm，而同期野生型平均根长为7. 90mm。分别对野生型拟南芥和转反义基因拟南芥的茎杆强度进行测量，发现在统计学 0. 01水平下存在的极显著差异，转基因材料的茎杆强度明显降低。例如试验中野生型拟南芥的茎杆平均断裂强度为8. 05N，而转反义基因型拟南芥的茎杆平均断裂强度仅为5. 72N。对野生型拟南芥和转反义基因拟南芥同时期茎段横切面进行观察发现转反义基因拟南芥的茎杆机械组织细胞壁厚度比前两者明显变小(图9)。上述分析结果表明抑制该基因的表达影响了拟南芥细胞壁的形成、根的极性生长、组织强度以及发育进程。而利用(ΛΡΙ4Κ基因转录组标记进行QTL定位的研究结果已经确认其是控制棉纤维强度的重要基因，具有提高纤维强度的潜力。综合以上分析结果， (ΛΡΙ4Κ基因表达对纤维强度表型的贡献可能是通过促进纤维细胞壁的发育而起作用。因此可以通过遗传重组(例如转基因或杂交转育)提高棉纤维品质，具有潜在的经济效益和应用价值。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因的编码蛋白，其为1)由SEQID No. 2所示的氨基酸序列构成的蛋白；或2) SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2或3所述基因的转化植物细胞。
7.权利要求2或3所述的基因在棉花品种改良中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其是利用基因工程的方法，将棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因导入到棉花细胞或组织中，得到棉纤维品质改善的棉花品种。
全文摘要
本发明公开了棉花磷脂酰肌醇4-激酶基因(GbPI4K)、其编码蛋白以及利用该基因改良棉花品种的方法。由于磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)是催化磷脂酰肌醇生成细胞内重要的双信使分子三磷酸肌醇和二酯酰甘油的一个关键酶，且有证据表明GbPI4K基因在控制细胞壁发育和组织强度中起重要作用，因此本发明获得的GbPI4K基因可用于棉花遗传改良以改善棉纤维品质，具有潜在的经济效益和应用价值。
文档编号A01H5/00GK102417898SQ201110338869
公开日2012年4月18日 申请日期2011年10月31日 优先权日2010年11月1日
发明者刘恒蔚, 吴立强, 张桂寅, 李志坤, 李翠斌, 王省芬, 马峙英 申请人:河北农业大学