专利名称：一种杀虫Bt蛋白Cry8Pa1、其编码基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的Bt蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO 统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14%，病害损失达12%，草害损失达11%。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。农业类害虫主要集中在鳞翅目与同翅目之中，鞘翅目金龟甲总科内部分昆虫，如蛴赠，也是重要的世界性分布地下害虫，危害双子叶和单子叶粮食作物、多种蔬菜、油料、芋、棉、牧草以及花卉和果、林等播下的种子及幼苗，并且为害期长，从播种到收获均能为害，造成缺苗断垄，甚至绝收，还会影响品质。大量调查表明，蛴螬在地下害虫中为害居首位，占总地下害虫量的 70-80%上。主要有暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela Motschulsky)、华北大黑鳃金龟 (Holotrichia oblita faldermann)、铜绿_金龟(Anomala carpulenta Motsch)等，在我国华北地区如河北、山东等地危害较为严重。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白Gnsectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，该蛋白对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。自1981年khn印f从菌株HD-IDipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了 470多种ICPs的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N.，et al. 1998. Microbiol Mol Biol Rev, 62 :807-813 ；http://www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。迄今发现的对蛴螬具有杀虫活性的Bt基因主要有cry3、cry8、cryl8、cry23、cry37、cry43等类基因(Shu C.，et al. 2009. Current Microbiology, 58 (4) :389-392.)，其中研究最多的是 cry8 类基因，cry8类基因由1160-1210个氨基酸组成，分子量为U8_137kDa，对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有特异的杀虫活性(Crickmore N.，et al. 1998. Microbiol Mol Biol Rev, 62 :807-813)。1992年，OtAa等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(Bt. subsp. japonensis BuiBui) (Ohba Μ. , et al. 1992. Letters in Applied Microbiology, 14 :54-57)，1994年从中克隆了一种新的杀虫基因 cry8Ca (Sato R.，et al. 1994. Curr· Microbiol. 28 :15-19)。美国 Mycogen 公司从 Bt 菌株 PS50C 分离的 Cry8Aal和Cry8Bal对花金龟Cotinis sp有明显的杀虫活性(US Patent 55545 )。美国从 Bt菌株中分离了两种基因crySBbl和crySBcl基因，发现对马铃薯甲虫，西方玉米根叶甲，南方玉米根叶甲具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad，et al. 2002. WO 02/34774A》。在我国，河北省农科院植保所和河北农业大学近年先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(A. exoleta)和铜绿丽金龟(A. corpulenta)的幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株，室内生测死亡率均达100% (冯书亮等.2000. —株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株.中国生物防治，16(2) :74-78) 0 2004年中国农业科学院植物保护所 Btl85分离了一株对暗黑鳃金龟幼虫高效(LC50，0. 94cfu/ml)的菌株Btl85，并从中克隆了四个种新的cry8类基因cry8fel，cry8fe2，cry8Fal, cry8Hal0目前绝大部分此类杀虫基因均被国外科研究机构或种子公司进行了专利保护；因此，对这些Bt资源进行挖掘和开发是一项紧迫而又有价值的工作，拥有自主知识产权，对于基因克隆、工程菌构建和抗虫转基因植物均具有重要的理论意义和应用价值。自本世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是频繁地使单一 Bt杀虫蛋白的必然结果是因害虫的适应而产生对Cry类蛋白的抗性；目前，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(Mc Gaughey，W. H. 1985. Science. 229 :193-195)， 原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，Mc Gaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia
subsp. kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15 代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik B. E.，et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究.昆虫学报，39 (3) =238-244 ；Hofte H. ,et al. 1988. Appl. Environ. Microbiol. 54 :2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf Ε. , et al. 1998. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65(3) :775-806)。为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力Bt菌株及基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治也有着十分重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新的Bt毒力蛋白资源，以克服上述不足。本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。本发明的目的还在于提供上述蛋白及基因的应用。本发明从四川省成都平原地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌新菌株ST8。该菌株已于2010年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为 CGMCC No. 3923。通过对ST8的毒力测试表明，ST8对鳞翅目棉铃虫、甜菜夜蛾等无杀虫活性；对鞘翅目昆虫具有较高的杀虫活性。根据cry8类基因保守序列设计1对通用引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株存在cry8类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到crySI^l 基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示，全长为3531bp，分析表明，GC含量为 37. 18%，编码1176个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为CrySI^al。CrySPal蛋白的氨基酸组成如表1。该蛋白的活性中心位于O)区段。表1 Cry8Pal蛋白的氨基酸组成
权利要求
1.一种杀虫Bt蛋白CrySI^l，其氨基酸序列是1)SEQID No. 2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQID No. 1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
5.由权利要求4所述表达载体转化的宿主细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其为植物宿主细胞。
7.含有权利要求1所述蛋白的杀虫剂。
8.权利要求1所述的蛋白或其编码基因或权利要求4所述表达载体在制备杀虫剂中的应用
9.权利要求1所述的蛋白或其编码基因或权利要求4所述表达载体在制备转基因植物中的应用。
10.权利要求1所述的蛋白或其编码基因或权利要求4所述表达载体在提高植物抗虫性中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种新的Bt蛋白Cry8Pa1及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。本发明提供的Bt蛋白Cry8Pa1可以用于制备Bt杀虫剂，编码该蛋白的基因可以转化粮食、棉花、油料、蔬菜，以及其他经济作物、花卉、草坪等多种植物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。
文档编号A01P7/04GK102363630SQ20111035205
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者刘怀年, 朱军, 李双成, 李巧, 李平, 王世全, 王玲霞, 邓其明, 郑爱萍 申请人:四川农业大学