专利名称：促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法。
背景技术：
豆科植物-根瘤菌可以形成根瘤共生体，其固氮量是生物总固氮量的50%以上， 远远高于世界化工合成氨的总和。豆科植物生长所需氮量的75%来自于豆科植物-根瘤菌的共生固氮作用。豆科植物富含有丰富的蛋白质，全世界消费的植物蛋白的三分之一来自于豆科植物。共生体形成的数量和根瘤的有效性是影响豆科植物共生固氮最主要的方面。 提高豆科植物根瘤形成的数量，提高共生体的固氮效率是促进豆科植物固氮的重要措施， 在减少化学氮肥施用、保护生态环境、促进农业可持续发展等方面具有重要意义。芽孢杆菌(Bacillus sp. ) Y-25CGMCC 4092分离自秸秆堆肥，为木质素降解菌，具有液化褐煤的能力。该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号CGMCC No. 4092，保存时间:2010年08月18日。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种促进植物结瘤固氮的组合物。本发明提供的组合物，包括发酵提取物、钼酸铵和柠檬酸铁；该组合物中的发酵提取物按照如下方法制备将芽孢杆菌(Bacillus sp.) Y-25CGMCC 4092、煤、麦麸、秸秆和水混勻发酵，收集发酵产物，即得到发酵提取物。上述的组合物还可以包括硼酸和硫酸锌；上述的组合物由所述发酵提取物、所述钼酸铵、所述柠檬酸铁、所述硼酸和所述硫酸锌组成。上述组合物中的所述发酵提取物、所述钼酸铵、所述柠檬酸铁、所述硼酸、所述硫酸锌的质量比为 10-1000 100 10-1000 0-50 0-1000。在上述发酵产物的制备方法中，所述芽孢杆菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、 所述煤、所述麦麸、所述秸秆和所述水的配比为IX IO12Cfu 9kg-12kg 4kg-6kg 4kg_6kg5kg-8kg ；上述发酵产物的制备方法中，所述发酵的温度为^°C，所述发酵的时间为7天-9 天，所述发酵为好氧发酵。上述发酵产物的制备方法中，在所述发酵的步骤后还包括处理所述发酵产物得到所述发酵提取物的步骤；上述处理所述发酵产物得到所述发酵提取物的方法为如下1)或2):1)将所述发酵产物经水溶解后过滤，收集滤液，即得到发酵提取物；2)将所述发酵产物经甲醇加热溶解后、离心收集上清液，即得到发酵提取物；
1)中，所述过滤采用截流分子量5KDa的滤膜；在所述发酵产物经水溶解前还包括将所述发酵产物干燥的步骤；在所述收集滤液后还包括干燥所述滤液得到发酵提取物的步骤；上述所述发酵产物干燥为在60°C烘干；上述干燥所述滤液为60°C烘干滤液。2)中，所述加热的温度为60°C，所述加热的时间为2小时；在所述发酵产物经甲醇加热溶解前还包括将所述发酵产物干燥的步骤；所述将所述发酵产物干燥为自然风干。在所述离心收集上清液后还包括去除所述上清液中的甲醇，得到发酵提取物的步
马聚ο2)中，所述离心的转速为6000rpm，所述离心半径为11. 5cm，所述离心的时间为 10min-15min ；所述去除甲醇采用旋转蒸发方式。上述组合物中，所述煤为褐煤或风化煤；其中该褐煤的有机质含量70%-85% (质量百分含量)、腐植酸(质量百分含量) 含量60-75% ；该风化煤的有机质含量60-80%、腐植酸含量50-70% ；在本发明的实施例中，该促进植物结瘤固氮的组合物中的植物为豆科植物，豆科植物是大豆，豌豆，蚕豆，落花生，菜豆，绿豆，红豆，紫花苜蓿或三叶草等农作物或野生植物，经常规育种或基因工程或两者结合得到的豆科植物。在本发明的实施例中具体为大豆或绿豆。本发明的第二个目的是提供一种制备促进植物结瘤固氮产品的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤先将上述的组合物中所述发酵提取物、所述钼酸铵、所述檬酸铁、所述硼酸和所述硫酸锌溶于水中，再调PH至6. 5-7. 0，得到产品；或先将上述的组合物中所述发酵提取物、所述钼酸铵和所述檬酸铁溶于水中，再调pH至6. 5-7.0，得到产品；所述发酵提取物、所述钼酸铵、所述柠檬酸铁、所述硼酸、所述硫酸锌和所述水的质量比具体为 10-1000 100 10-1000 0-50 0-1000 97900-98920。由上述的方法制备的产品也是本发明保护的范围。上述的组合物或上述的产品在促进植物结瘤固氮中的应用也是本发明保护的范围；在上述应用中，该植物为豆科植物，在本发明的实施例中豆科植物为大豆或绿豆。本发明的实验证明，本发明提供的组合物，由发酵提取物和其他添加物组成，其他的添加物及其功能具体为钼酸盐及铁盐为豆科植物固氮酶中钼铁蛋白所必需的元素，硼与锌为豆科植物所必需的元素，添加上述物质可以保证豆科植物结瘤及固氮的正常进行。 本发明得到的组合物溶于水中，制备得到产品，该产品用来直接处理豆科植物或植物部分， 可以刺激根瘤菌生长，刺激豆科植物结瘤量增加，提高单株植物结瘤固氮能力。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、促进植物结瘤固氮的产品(小于5KDa)的制备
1、褐煤发酵的发酵提取物的获得1)培养将芽孢杆菌(Bacillus sp. ) Y-25CGMCC 4092按常规方法接种到种子罐培养12小时，再接种到发酵罐37°C培养，所用培养基为LB培养基，配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， 氯化钠10g/L ；12小时后得到的培养液，菌浓度为2X108cfu/mL，备用；2)发酵将褐煤(采自内蒙古自治区霍林河地区，有机质含量78% (质量百分含量)、腐植酸含量67% (质量百分含量))、麦麸、秸秆和水加入发酵罐内，同时再将上述制备的芽孢杆菌培养液接入并充分混勻，在温度下好氧发酵9天，得到发酵产物。上述发酵中，上述的芽孢杆菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、褐煤、麦麸、秸秆和水的配比为 IXlO12Cfu 9kg 4kg 4kg 5kg ；将上述的发酵产物在60°C烘干得到粉末物质。将上述的粉末物质溶于水中后再经5KDa的滤膜进行过滤，收集滤出部分(滤液)， 60°C烘干，即为发酵提取物1，备用。发酵提取物的分子量小于5KDa。2、促进植物结瘤固氮的产品(小于5KDa)的获得将50g由上述1得到的发酵提取物1溶于98. 92kg水中，添加钼酸铵100g，柠檬酸铁400g，硼酸30g，硫酸锌500g，共100L，用盐酸或氢氧化钠调节pH至6. 5，得到产品1 ；将IOOOg由上述1得到的发酵产物1溶于97. 9kg水中，添加钼酸铵100g，柠檬酸铁lOOOg，共100L，用盐酸或氢氧化钠调节PH至6. 5，制成产品2。实施例2、促进植物结瘤固氮的产品(小于5KDa)的应用1、促进植物结瘤固氮的产品1的应用将慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium liaoningense CCBAU 05525(购自中国农业大学根瘤菌研究中心)使用YMA培养基，种子罐培养3天，接入发酵罐相同条件发酵 7天后，将发酵液稀释至IX 106CfU/ml的大豆根瘤菌培养液，备用。以蛭石为栽培基质种植大豆(品种冀豆17，拉丁文=Glycine max)，并接种上述大豆根瘤菌培养液1ml，待幼苗出芽时根灌0. 2ml由实施例1得到的促进植物结瘤固氮的产品(小于5KDa)l，温室(白天25°C，夜晚17°C )条件下正常培养35天后，测定单株大豆的根瘤数及固氮活性(乙炔还原酶活性)。实验重复三次，结果取平均值。以不使用产品1为对照。检测大豆的根瘤中的乙炔还原酶活性，其测定方法见周平贞，邓金兰，张学江，吴生堂.豆科植物结瘤试验-水培法介绍.中国油料作物学报，1979，2 :60-62.结果如表1 表1本发明使用在大豆上的使用结果
权利要求
1.一种促进植物结瘤固氮的组合物，包括发酵提取物、钼酸铵和柠檬酸铁；所述发酵提取物按照如下方法制备将芽孢杆菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、煤、 麦麸、秸秆和水混勻发酵，收集发酵产物，即得到发酵提取物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物还包括硼酸和硫酸锌；所述组合物由所述发酵提取物、所述钼酸铵、所述柠檬酸铁、所述硼酸和所述硫酸锌组成。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于所述发酵提取物、所述钼酸铵、所述柠檬酸铁、所述硼酸、所述硫酸锌的质量比为10-10 00 100 10-1000 0-50 0-1000。
4.根据权利要求1-3中任一所述的组合物，其特征在于所述发酵提取物的制备方法中，所述芽孢杆菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、所述煤、所述麦麸、所述的秸秆和水配比为IX IO12Cfu 9kg-12kg 4kg-6kg 4kg_6kg 5kg_8k g ；所述发酵的温度为^°C，所述发酵的时间为7天-9天。
5.根据权利要求1-4中任一所述的组合物，其特征在于在所述发酵的步骤后还包括处理所述发酵产物得到所述发酵提取物的步骤； 所述处理所述发酵产物得到所述发酵提取物的方法为如下1)或2)1)将所述发酵产物经水溶解后过滤，收集滤液，即得到发酵提取物；2)将所述发酵产物经甲醇溶解后加热、离心收集上清液，即得到发酵提取物。
6.根据权利要求1-5中任一所述的组合物，其特征在于1)中，所述过滤采用截流分子量5KDa的滤膜；在所述发酵产物经水溶解前还包括将所述发酵产物干燥的步骤； 在所述收集滤液后还包括干燥所述滤液得到发酵提取物的步骤；2)中，所述加热的温度为60°C，所述加热的时间为2小时；在所述发酵产物经甲醇加热溶解前还包括将所述发酵产物干燥的步骤； 在所述离心收集上清液后还包括去除所述上清液中的甲醇，得到发酵提取物的步骤。 所述离心的转速为6000rpm，所述离心半径为11. 5cm，所述离心的时间为10-15min ；所述去除甲醇采用旋转蒸发方式。
7.根据权利要求1-6中任一所述的组合物，其特征在于 所述煤为褐煤或风化煤；所述植物为豆科植物，所述豆科植物具体为大豆或绿豆。
8.一种制备促进植物结瘤固氮产品的方法，包括如下步骤先将权利要求1-7中的组合物中所述发酵提取物、所述钼酸铵、所述檬酸铁、所述硼酸和所述硫酸锌溶于水中，再调PH至6. 5-7. 0，得到产品；或先将权利要求1-7中的组合物中所述发酵提取物、所述钼酸铵和所述檬酸铁溶于水中，再调PH至6. 5-7.0，得到产品；所述发酵提取物、所述钼酸铵、所述柠檬酸铁、所述硼酸、 所述硫酸锌和所述水的质量比具体为10-1000 100 10-1000 0-50 0-1000 97900-98 920。
9.由权利要求8所述的方法制备的产品。
10.权利要求1-7中任一所述的组合物或权利要求9所述的产品在促进植物结瘤固氮中的应用；所述植物为豆科植物，所述豆科植物为大豆或绿豆。
全文摘要
本发明公开了一种促进豆科植物结瘤提高固氮能力的组合物及其制备方法。本发明提供组合物，包括发酵提取物、钼酸铵和柠檬酸铁；所述发酵产物按照如下方法制备将芽孢杆菌(Bacillus sp.)Y-25CGMCC 4092、煤、麦麸和秸秆混匀，发酵，收集产物，即得到发酵提取物。上述的组合物还包括硼酸和硫酸锌。本发明的实验证明，本发明得到的组合物溶于水中，制备得到产品(活力素)，该产品用来直接处理豆科植物或植物部分，可以刺激根瘤菌生长，刺激豆科植物结瘤量增加，提高单株植物结瘤固氮能力。
文档编号C05G1/00GK102515890SQ20121000187
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者杨金水, 袁红莉, 高同国 申请人:中国农业大学