专利名称：一种检测豆科植物病毒的基因芯片、核苷酸序列及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测豆科植物病毒的基因芯片、核苷酸序列及试剂盒，属于检验检疫领域。
背景技术：
食品安全问题是一个历史性的问题，也是一个全球化的问题。历史上，由于缺少必要的检测手段，使得病原生物从一地传入另一地，从而造成传入地的病原生物蔓延，给当地人类的生存、健康和农业的生产安全造成巨大的影响和损失。如著名的“爱尔兰饥荒”就是由于从美洲引进马铃薯，造成马铃薯晚疫病的大流行，仅有800万人口的爱尔兰岛，就有20多万人因饥荒而死亡，164万人因饥荒而外逃。
在世界许多国家都曾出现过由病原生物引起植物源性食品的安全问题。如由麦角菌(Claviceps purpurra)引起的麦角病可使人们食用后发生中毒，并可以引起流产；20世纪40年代在美国流行的板栗疫病摧毁了全部的美洲板栗；1970年在美国大流行的玉米小斑病造成10亿美元的损失；在非洲和美洲发生的柑橘速衰病(CTV)使得数百万株柑橘树死亡；在美国，每年由马铃薯X病毒引起的损失达总产量的10％左右。
就植物源性食品而言，往往一种植物源性食品可同时受到多种病原生物的侵染。如番茄，可受到80种真菌、11种细菌、16种病毒及一些菌植体的侵染；苹果和马铃薯都可受到200种以上病原生物的侵染。
随着经济全球化和世界食品贸易量持续增长(最新统计，目前全球食品贸易额约为每年5000亿美元)危及食品安全的病原性疾病出现了新的特点流行速度快、影响范围广。在进口的植物源性食品中，检验检疫部门已检出了危及植物源性食品的病原生物，如从进口的大豆中检出大豆疫病；从进口的小麦中检出TCK；从进口的蔬菜中检出辣椒轻斑驳病毒、黄瓜花叶病毒。
目前，我国出入境植物检疫所采用的检测技术手段相对比较落后，所采用的手段主要是口岸现场检疫、生长季隔离检疫、指示植物鉴定、血清学检验。这些手段存在的诸多不足1、耗时、费力且检测周期长，不符合国务院提出的“加快通关速度”的精神；2、非特异性反应是检测过程中普遍出现的情况；3、有些病原生物(特别是植物病毒)缺乏有效的检测手段。这些都不能适应我国经济快速发展的需要。因此，建立新的快速有效的检验检疫技术手段已经迫在眉睫。
基因芯片技术是90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术，是各学科交叉综合的崭新科学。其原理是将大量DNA探针片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析。它最大的优点在于高通量、并行化和微型化。在基因芯片上，单位面积可以高密度地排列大量的生物探针，一次试验就可以同时分析多种生物样品。基因芯片在核酸序列测定、基因突变的检测、基因表达情况的分析等诸多领域的研究中得到了广泛应用，受到人们的普遍重视。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种灵敏度高、特异性强、经济实用的检测豆科植物病毒的基因芯片。
本发明的第二个目的是提供一组检测豆科植物病毒的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供一种可实现商品化的检测豆科植物病毒的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种检测豆科植物病毒的基因芯片，在固相载体表面固定有若干检测和质控对照探针，其中检测探针具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列中的任意组合；质控对照由表面化学对照探针、荧光标记对照探针、阳性对照探针、阴性对照探针、杂交对照探针和空白对照组成。
所述的表面化学对照探针，为一段带有荧光标记的探针，优选具有序列表SEQ IDNo.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修饰，3’端Cy3或Cy5修饰；其作用为监控固相载体与探针的结合。
所述的荧光标记对照探针，优选为随机生成一段与所有待检病毒没有同源性的序列，并据此序列设计标记的对照探针，优选具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；荧光标记对照的作用为监控待检样品序列荧光标记有效性，以确定产生的阴性信号是由于荧光标记失败引起还是由于样品本身不含待检病毒。
所述阳性对照探针，优选为根据植物核糖体18S RNA序列设计，优选具有序列表SEQID No.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；阳性对照的作用为监控系统样品RNA提取情况，如果阳性对照有信号就说明从植物中提取的总RNA质量良好，病毒探针阴性信号是由于不含该病毒。
所述阴性对照探针，优选为与所有病毒序列无同源性的60nt核苷酸序列，优选具有序列表SEQ ID No.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；阴性对照的作用为监控反应系统的污染情况，如果阴性对照探针有荧光信号则表明系统被污染。
所述杂交对照探针，为一条60nt序列，5’端氨基修饰，与固相载体结合，另合成一条与之互补配对的60nt序列，5’端Cy3或Cy5荧光标记，作为试剂盒中杂交对照试剂。杂交对照探针优选具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，杂交对照试剂优选具有序列表SEQ ID No.86所示的序列；杂交对照的作用为监控系统杂交反应的有效性，如果杂交对照探针没有信号说明是由于系统杂交反应失败，不能根据检测探针的阴性信号判断样品中没有该病毒。
所述空白对照，为点样缓冲液，用于监控点样针清洗及探针有无交叉污染。
本发明中的固相载体可以选用本领域公知的载体，例如硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、载玻片等。
芯片每条探针横向重复2点，每点的探针的量为0.002-0.02pmol，点直径约180μm，点间距300μm。
所述芯片每张具有4个相同矩阵，探针排布方式为每个矩阵17行10列。
所述芯片片基(固相载体)、围栏和盖片购于北京博奥生物芯片有限责任公司。
本发明以《中华人民共和国进出境动植物检疫法》所规定的必须实施检疫的有害生物(病毒部分)为基础，结合检疫口岸各种病毒检出的频率统计、病毒的性质(RNA病毒/DNA病毒)和国内植物病毒爆发情况，确定以豆科植物的RNA病毒为检测对象设计检测芯片，豆科植物病毒检测芯片上点制40种病毒的探针，具体名称如下苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaic virus，AMV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、黑眼豇豆花叶病毒(Blackeye cowpea mosaic virus，BlCMV)、豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)、香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus，CRSV)、茄子花叶病毒(Eggplantmosaic virus，EMV)、莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus，LMV)、李矮缩病毒(Prunedwarf virus，PDV)、豌豆早枯病毒(Pea early-browning virus，PEBV)、李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)、花生矮化病毒(Peanut stunt virus，PSV)、悬钩子环斑病毒(Raspberryringspot virus，RpRSV)、草莓潜环斑病毒(Strawberry latent ringspot virus，SLRSV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus，TBRV)、番茄丛矮病毒(Tomato bushystunt virus，TBSV)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattie virus，TRV)、番茄斑萎病毒(Toma tospotted wilt virus，TSWV)、白三叶草花叶病毒(White clover mosaic virus，WClMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus，ToRSV)、李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、小西葫芦花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaicvirus，SCMV)、白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus，PenMV)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaicvirus，BCMV)、菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus，BPMV)、豇豆重花叶病毒(Cowpeasevere mosaic virus，CPSMV)、蚕豆坏死黄化病毒(Faba bean necrotic yellows virus，FBNYV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、花生斑驳病毒(Peanut mottlevirus，PeMoV)、豌豆种传花叶病毒(Pea seed borne mosaic virus，PSbMV)、大豆矮缩病毒(Soybean dwarf virus，SbDV)、南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus，SBMV)、葡萄卷叶病毒-2(Grapevine leaf-roll associated virus 2，GLRaV-2)、木槿褪绿环斑病毒(Hibiscus chlorotic ringspot virus，HCRSV)。
芯片上各种豆科植物病毒的检测探针根据GenBank公布的待检病毒CP基因(植物病毒基因组中最保守的基因)序列设计，经过同源性比对找出保守区段，再以比较严格且均一的条件(Tm值、GC含量、二级结构等)计算出符合这些种病毒保守区段的60mer探针，并在5’端以氨基修饰，每种病毒设计两条特异检测探针，每条探针为60nt；表1 豆科植物病毒检测探针序列
表面化学对照探针序列如表2(5’端氨基修饰，3’端Cy3或Cy5修饰)。
表2 表面化学对照探针序列(SEQ ID No.81)
荧光标记对照探针序列如表3(5’端氨基修饰)。
表3 荧光标记对照探针序列(SEO ID No.82)
阳性对照探针序列如表4。
表4 阳性对照探针序列(SEQ ID No.83)
阴性对照探针序列如表5(5’端氨基修饰)。
表5 阴性对照探针序列(SEQ ID No.84)
杂交对照探针序列如表6(5’端氨基修饰)。
表6 杂交对照探针序列(SEO ID No.85)
本发明提供了一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，由下述组分组成其中基因芯片、芯片盖片和芯片杂交盒室温贮存，其它试剂需-20℃贮存；(1)基因芯片、芯片盖片和芯片杂交盒其中基因芯片的固相载体表面固定有若干探针和质控对照，探针具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列；质控对照由表面化学对照、荧光标记对照、阳性对照、阴性对照、杂交对照和空白对照组成；其中，基因芯片的规格为25mm×75mm，每盒10-20片；基因芯片的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片；基因芯片的表面化学对照，具有序列表SEQ ID No.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修饰，3’端Cy3或Cy5修饰；基因芯片的荧光标记对照，具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；基因芯片的阳性对照具有序列表SEQ ID No.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；基因芯片的阴性对照具有序列表SEQ ID No.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；基因芯片的杂交对照具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，5’端氨基修饰；基因芯片的空白对照为点样缓冲液；基因芯片的每条探针横向重复2点，每点的探针的量为0.002-0.02pmol，点直径约180μm，点间距300μm；基因芯片每张具有4个相同矩阵，探针排布方式为每个矩阵17行10列；(2)DEPC水428ul-856ul(3)反转录试剂405ul-810ul，购于Promega公司(4)反转录酶45ul-90ul，购于Promega公司(5)RNA酶抑制剂23ul-46ul，购于Promega公司(6)PCR酶15-30ul，购于TAKARA公司(7)40种病毒PCR引物及试剂每种423ul-846ul，在北京奥科生物技术有限责任公司合成，包括苹果褪绿叶斑病毒PCR试剂、苜蓿花叶病毒PCR试剂、南芥菜花叶病毒PCR试剂、菜豆普通花叶病毒PCR试剂、黑眼豇豆花叶病毒PCR试剂、菜豆荚斑驳病毒PCR试剂、黄瓜花叶病毒PCR试剂、豇豆花叶病毒PCR试剂、豇豆重花叶病毒PCR试剂、香石竹环斑病毒PCR试剂、茄子花叶病毒PCR试剂、蚕豆坏死黄花病毒PCR试剂、葡萄卷叶病毒-2 PCR试剂、木槿褪绿环斑病毒PCR试剂、莴苣花叶病毒PCR试剂、百合无症病毒PCR试剂、李矮缩病毒PCR试剂、豌豆早枯病毒PCR试剂、花生斑驳病毒PCR试剂、白草花叶病毒PCR试剂、李属坏死环斑病毒PCR试剂、李痘病毒PCR试剂、豌豆种传花叶病毒PCR试剂、花生矮化病毒PCR试剂、悬钩子环斑病毒PCR试剂、大豆矮缩病毒PCR试剂、南方菜豆花叶病毒PCR试剂、甘蔗花叶病毒PCR试剂、草莓潜环斑病毒PCR试剂、南瓜花叶病毒PCR试剂、番茄不孕病毒PCR试剂、番茄黑环病毒PCR试剂、番茄丛矮病毒PCR试剂、烟草花叶病毒PCR试剂、番茄环斑病毒PCR试剂、烟草环斑病毒PCR试剂、烟草脆裂病毒PCR试剂、番茄斑萎病毒PCR试剂、白三叶草花叶病毒PCR试剂、小西葫芦花叶病毒PCR试剂；(8)阳性对照PCR引物及试剂423ul-846ul(9)标记对照15ul-30ul(10)标记PCR引物及试剂342ul-684ul(11)杂交对照45ul-90ul(12)2x杂交缓冲液495ul-990ul，购于Roche公司其中，(8)阳性对照PCR试剂的引物序列如表7。
表7 阳性对照引物序列
(9)标记对照模板序列如表8(克隆至pMD-18T载体)。
表8 标记对照模板序列(SEQ ID No89)
(10)标记PCR试剂的标记引物序列如表9。
表9 标记引物序列
(11)杂交对照的序列如表10(5’端Cy3或Cy5修饰)。
表10 杂交对照序列(SEQ ID No86)
(7)40种病毒PCR试剂中的豆科植物病毒检测引物序列如表11表11 豆科植物病毒检测引物序列
基因芯片试剂盒的使用流程为植物总RNA的提取→RT-PCR→病毒特异性片段扩增→标记扩增→杂交→清洗芯片→扫描→结果判读。
上述所有的引物、探针、对照序列分别具有SEQ ID No1-SEQ ID No178所示的碱基序列，均属于本发明的保护范围。
本发明的优点和创新之处在于(1)高通量豆科植物病毒基因芯片和检测试剂盒，整合了目前国家规定的豆科植物病毒检验检疫领域最常见的豆科病毒的检测序列和试剂，实现了对豆科植物中常见的40种病毒的同时检测，实用性强；(2)快速检测时间仅为1.5个工作日；(3)特异对探针序列进行了严格筛选，使芯片上所有探针仅与其相对应的某一种病毒的核酸扩增产物反应，有效避免了交叉反应导致的假阳性问题；(4)灵敏芯片的检测灵敏度为108病毒颗粒/g组织样品(大约相当于1ng病毒核酸/g组织样品)，比RT-PCR灵敏度高至少1～2个数量级；(5)反应成本低采用了独特设计的标记引物序列5’-CACGAGGAGTCTGCTAC-3’进行标记反应，将标记反应步骤中dNTP(1mM，含Cy3/Cy5-dCTP)的用量降到0.2μL，使反应成本降至通用方法的7％左右，利于推广应用；(6)重复性好，结果稳定可靠经过重复性和稳定性实验证明该检测系统可以保证检测结果的重现性和精确性，可广泛应用于出入境检验检疫系统的植物检疫、植物源性食品安全监察、植保站植物病毒病的诊断以及植物病毒分类学研究中病原体鉴定等领域。豆科植物病毒基因芯片检测试剂盒可以用于600多种豆科植物源性食品的日常检疫工作中。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为芯片点样区域的矩阵位置图。
图2为商品化的豆科植物病毒检测基因芯片探针排列。
图3-1为TRSV样品RNA稀释RT-PCR检测结果图。
图3-2为TRSV样品研磨液倍比稀释ELISA检测结果图。
图3-3至3-5为TRSV样品RNA稀释芯片检测结果图。
具体实施例方式
实施例1、制备基因芯片一、材料和方法1、材料离心机购自Heraeus公司。
PCR仪购自Techne公司。
点样仪购自GeneMachines公司，型号OminiGrid。
芯片装配工具购自北京博奥生物芯片有限责任公司。
杂交盒购自北京博奥生物芯片有限责任公司。
芯片扫描仪购自Axon公司，型号GenePix4100A。
生物信息学及芯片分析软件免费版本或试用版本，ClustalX1.83，VectorNTI9.1，ArrayDesigner2.02，GenePix Pro4.0(购自Axon公司)。
探针、引物、标记对照模板见表1-表11，合成于北京奥科生物技术有限责任公司。
空白对照50％DMSO，购自Sigma公司。
片基醛基化玻璃片基，购自CEL公司和北京博奥生物芯片有限责任公司。
点样缓冲液50％DMSO。
点样后洗液0.2％SDS。
点样后封闭液0.2％NaBH1。
Trizol试剂购自Invitrogen公司。
反转录试剂盒购自Promega公司。
TagDNA聚合酶购自Takara公司。
dNTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
Cy3/Cy5-dCTP购自Amersham Biosciences公司。
3X杂交缓冲液15×SSC，0.3％SDS，3×Blocking杂交洗液I(0.3×SSC，0.2％SDS)杂交洗液II(0.06×SSC)二、方法1、探针的设计与合成收集GenBank公布的待检病毒CP基因(植物病毒基因组中最保守的基因)和植物的18S基因序列，经过同源性比对找出保守区段，再以比较严格且均一的条件(Tm值、GC含量、二级结构等)计算出符合这些种病毒保守区段的60mer探针，并在5’端以氨基修饰，每种病毒分别设计2条。本发明涉及的80条检测豆科植物病毒的探针序列具有序列表SEQ ID.No.1-SEQ ID.No.80所示的核苷酸序列；表面化学对照，具有序列表SEQ ID No.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修饰，3’端Cy3或Cy5修饰；荧光标记对照，为随机生成一段与所有待检病毒没有同源性的序列，并据此序列设计标记的对照探针，具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；
所述阳性对照，为根据植物核糖体18S RNA序列设计，监控样品RNA提取，具有序列表SEQ ID No.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；所述阴性对照，为与所有病毒序列无同源性的60nt核苷酸序列，具有序列表SEQ IDNo.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；所述杂交对照，具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，探针5’端氨基修饰；空白对照点样缓冲液(50％DMSO)。
2、芯片的制备探针用点样缓冲液溶解，浓度为50μM，每条探针横向重复2点，每点约0.25nL，点直径约180μm，点间距300μm，点样均匀度的标准方差约为15％。
探针排布一张芯片上4个相同矩阵，矩阵位置如图1所示。豆科芯片每个矩阵17行10列，探针排列如图2所示。
点样后洗片点样后洗液中搅拌清洗2min；点样后封闭液中搅拌封闭5min；去离子水中搅拌清洗2min，重复三次，2000rpm离心1min。
利用芯片装配工具将四区域芯片围栏贴于芯片表面，置于暗盒室温保存。
实施例2、基因芯片的使用方法1.待测样品总RNA的提取(推荐方法)取0.1g待测样品，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，加入1mL的Trizol试剂继续研磨匀浆，移入灭菌的1.5mL离心管中室温静置5min；4℃12000g(约12000rpm)离心10min，将上清液转入一新的1.5mL离心管中；加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持2-3min后，4℃12000g(约12000rpm)离心15min；将上层水相(大约0.6mL)转移到新的1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温下保持10min；4℃12000g(约12000rpm)离心10min，弃去上清液，加入1mL75％的乙醇(DEPC水配置)洗涤沉淀，然后4℃7500g(约10000rpm)离心5min，弃去乙醇；沉淀于室温下干燥后，溶于20μL DEPC水中，-20℃保存RNA。
2.逆转录反应反应体系及程序如下待测样品总RNA2μLDEPC水(D)7.5μL混合均匀后70℃10min→冰浴5min，然后加入反转录试剂(RT)9μLRNA酶抑制剂(I)0.5μL反转录酶(E) 1μL混合均匀后，室温10min→42℃ 30min→95℃，5min→冰浴，-20℃保存cDNA。
3.特异性扩增根据样品感染病毒的可能和检测需求选择检测的病毒种类，然后分别进行不同病毒的特异性PCR扩增。反应体系及程序如下逆转录得到的cDNA 0.5μL需检病毒或阳性对照PCR试剂 9.4μLPCR酶(PE) 0.1μL95℃ 5min 72℃ 10min4.标记扩增将待检样品的多个扩增产物(包括需检病毒和阳性对照的所有特异性PGR产物，PCR产物的管数记为N)混合均匀。反应体系及程序如下特异性PCR产物混合物(N×0.05)μLDEPC水(D) (2-N×0.05)μL标记PCR试剂(L) 7.6μLPCR酶(PE) 0.1μL标记对照(LC) 0.3μL95℃ 5min 72℃ 10min
5.杂交反应体系及程序如下标记反应产物10μL2×杂交缓冲液(2×HB)11μL杂交对照(HC)1μL95℃5min→冰浴5min芯片杂交盒中加入200μL去离子水，将芯片正面朝上放进杂交盒中，对准方向放入盖片，通过加样孔将变性后的杂交液取15μL一次性注入，使其充满盖片和芯片之间空隙，封闭杂交盒，置于65℃恒温环境30min，同时于65℃恒温环境中预热杂交洗液I和杂交洗液II。
杂交完毕后，弃去盖片，芯片探针面向下在少量预热的杂交洗液I中漂去残余杂交液(注意避免四个矩阵的杂交液交叉污染)，撕去芯片上的橡胶围栏，在预热的杂交洗液I搅拌清洗5min，再在预热的杂交洗液II搅拌清洗5min，2000rpm离心1min，置于暗盒室温保存。
6.扫描将芯片置于芯片扫描仪中进行扫描分析，Cy3标记用532nm激光管扫描(如未另外说明，该试剂盒中荧光标记物均为Cy3)，Cy5标记用635nm激光管扫描(如用户需要可以提供荧光标记物为Cy5的试剂盒)，PMT设为900。获得各点荧光强度、背景强度等数据。
7.结果判读依据以下原则判读检测结果a.每个检测点信号值＝该点荧光强度值-该点背景强度值；b.空白对照平均信号值＝2个空白对照点信号值的平均值；c.阴性对照平均信号值＝2个阴性对照点信号值的平均值-空白对照平均信号值；d.每条探针的每个检测点信号值-空白对照平均信号值＞2倍阴性对照平均信号值即判读该检测点为阳性；e.每条探针的两个重复检测点均为阳性即判读该条探针为阳性；e.每种病毒的一条以上探针为阳性即判读待测样品携有该种病毒；f.如探针结合对照的27个点中任何一个为阴性，则表明探针与片基结合存在问题，实验结果不准确；g.如杂交对照为阴性，则表明杂交环节存在问题，实验结果不准确；h.如标记对照为阴性，则表明标记扩增环节存在问题，实验结果不准确；
i.如阳性对照为阴性，则表明总RNA提取环节存在问题，实验结果不准确。
实施例3、芯片检测灵敏度试验一、方法将携有烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)的植物样品(北京出入境检验检疫局提供)提取RNA，分别进行101～103倍梯度稀释，分别进行RT-PCR检测、ELISA(购于北京赛恩思科贸有限责任公司)和芯片检测。
二、结果TRSV样品RNA稀释RT-PCR检测结果见图3-1，其中110-3稀释；210-4稀释；3.10-5稀释；n空白对照；MMarker DL2000，只有10-3稀释能够检出病毒。
TRSV样品研磨液倍比稀释ELISA检测结果见图3-2，TRSV样品研磨液作1∶4稀释时阳性信号值就接近临界值，1∶8稀释就判读不出阳性。
TRSV样品RNA稀释芯片检测结果见图3-3至3-5，其中图3-3为10-3稀释，图3-4为10-1稀释，图3-5为10-5稀释，在10-4稀释时依然能够检出病毒。
可见，用带毒样品杂交，芯片检测灵敏度比RT-PCR法高了1-2个数量级，比ELISA检测高4-5个数量级。
实施例5、芯片的稳定性试验一、方法将三张芯片分别于室温放置，37℃放置1周，37℃放2周，用TRSV样品RNA分别进行杂交反应。
二、结果实验结果表明即使在37℃放置2周，依然不影响检测结果，芯片具有很好的稳定性。
实施例6、基因芯片在检验检疫实务中的试用用研制的基因芯片对多种植物进行病毒筛查，筛查结果与ELISA实验比较，结果有差异的再用两步法RT-PCR验证。
一、材料和方法1、试验材料大豆、四季豆、豇豆、南瓜、丝瓜、黄瓜、西葫芦、番茄、甜椒、向日葵等种子以及百合种球和葡萄接穗取自北京出入境检验检疫局植检实验室，这些种子、种球和接穗分别来自荷兰、法国、美国、以色列和菲律宾。苹果、桃、香瓜、油菜、苋菜、烟草、苦瓜、菠菜、萝卜、玉米、分别来自中国检验检疫科学研究院植物隔离场和农田。
本研究使用的TMV、SCMV、CMV、ZYMV、TRSV、ToRSV、PNRSV抗血清购自美国Agdia公司。
2、实验方法(1)样品的采集和前处理将西葫芦、南瓜等植物种子种植于防虫网室内花盆中，待二叶期取植物叶片用于DAS-ELISA、PCR和芯片检测，对于苹果、葡萄接穗待展叶取柔嫩叶片检测，百合种球直接取其组织检测。田间植物样品选取柔嫩叶片用于检测。植物体组织总RNA提取方法见第一部分。
(2)DAS-ELISA检测A.包被酶联板用待测病毒抗血清的提纯IgG(即一抗)，以使用工作浓度稀释于包被缓冲液中，每孔加100μL稀释的IgG。37℃孵育3个小时或者4℃冰箱中孵育过夜；B.洗板将反应板快速反扣，弃去孔中液体于废水容器中(注意不要让孔与孔之间溶液相混以免发生交叉污染)，然后每孔加200μL PBST液，静置3min后快速弃去孔中液体，如此重复至少3～5次；C.加样除空白孔加100μL PBST+2％PVP缓冲液，其余每孔加100μL样品抽提液，一个样品设两个重复，同时设阳性对照，阴性对照；加样后于4℃冰箱中孵育过夜或37℃温箱中保湿静置2h；D.洗板同(2)；E.加酶标IgG用PBST+2％PVP稀释酶标抗体(即二抗)至合适工作浓度，每孔样品加100μL酶标IgG；F.孵育37℃温箱中静置2h；G.洗板同(2)；H.加底物用底物缓冲液1mg/mL溶解底物PNP(现配现用)，每孔加100μL(含空白对照)；I.孵育室温避光显色30～60min；目测以颜色深浅记录+++，++，±，-；或用酶联读数仪在405nm下读数；J.读数的判断标准为，阳性I/H≥2，阴性I/H＜2。
I/H＝(样品的平均吸光值-空白对照的平均吸光值)/(健康对照的平均吸光值-空白对照平均吸光值)K.注意均设置空白对照、阴性对照(即健康对照)和阳性对照；对酶联板读数或目测结果时应及时，否则读数不准确。不能接触PNP药片(剧毒)或把PNP溶液曝露于强光下，光线或污染物能够引起阴性孔呈现背景颜色。
(3)芯片检测同实施例2。
(4)两步法RT-PCR检测第一步RT-PCR方法，用鉴定引物；第二步PCR用通用引物，方法见实施例2。将ELISA和芯片检测存在差异的样品用两步法RT-PCR方法进行再次验证。
三、结果1、基因芯片筛查植物感病情况统计如表12所示。
表12 基因芯片筛查植物感病情况统计
2、ELISA筛查植物感病情况见表13。
表13 ELISA筛查植物感病情况统计
3、比较两种方法在不同植物中检出病毒的情况，结果如表14所示。
表14 两种方法检出植物带毒情况比较
4、芯片检测显阳性而ELISA检测显阴性的样品通过两步法RT-PCR方法的验证结果，证实了芯片的检测结果是正确的。
根据以上实验结果可知，基因芯片检测结果与ELISA的检测结果两者具有一致性，凡是ELISA检测出的病毒，用基因芯片也都能检测出；对于植物中含量甚微的病毒，用ELISA方法检测不出，用基因芯片却能检测到阳性信号，经两步RT-PCR验证，样品确实为阳性。说明基因芯片检测技术比ELISA方法具有更高的灵敏度。基因芯片技术还能同时检测一份样品中存在的4种病毒，体现了芯片杂交技术的高通量和并行性。
实施例7、检测试剂盒1.豆科植物病毒检测基因芯片表15
室温避光保存，贮存12个月不影响使用效果。
2.“豆科植物病毒基因芯片检测试剂盒”表16
-20℃避光保存，贮存12个月不影响使用效果。
40种病毒PCR试剂中的豆科植物病毒检测引物序列具有序列表SEQ ID N091至SEQID N0178所示的序列；阳性对照PCR试剂的引物序列具有序列表SEQ ID N087和SEQ IDNo88所示的序列；标记对照模板序列具有序列表SEQ ID No89所示的序列；标记PCR试剂的标记引物序列具有序列表SEQ ID No90所示的序列；杂交对照的序列具有序列表SEQ ID No86所示的序列。
使用方法(同实施例2)本发明主要完成了用于豆科植物源性食品病毒检测的基因芯片检测系统，该检测系统选用醛基基片，通过实验室优化，形成稳定的基因芯片制备工艺；通过优化荧光标记和芯片杂交装置，形成成熟的反应体系。
本发明研究结果表明，豆科植物源性食品病毒基因芯片检测试剂盒可以用于600多种豆科植物源性食品的日常检疫工作中。本发明改变了传统的植物源性食品病毒检疫方式，在植物源性食品病毒检测技术中，引入了生物芯片技术，建立了多种病毒同时检测的方法，极大地提高了检测灵敏度和检测效率，为加快出入境植物源性食品的通关速度、加大国家对食品安全的监测力度提供了有力的保障。
序列表<110>中华人民共和国北京出入境检验检疫局本元正阳基因技术股份有限公司中国检验检疫科学研究院浙江大学生物技术研究所<120>一种检测豆科植物病毒的基因芯片、核苷酸序列及试剂盒<130>
<160>178<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>1tcactacaat gccagaggtt gggagtaaat acccggagct gatgtttgat ttcaataagg 60<210>2<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>2catgaacaag gctcagcaga aggtgataac taatatgaac cgtcgtcttt tacagactga 60<210>3<211>60<212>DNA
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权利要求
1.一种检测豆科植物病毒的基因芯片，在固相载体表面固定有若干探针和质控对照，其中探针选自具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列中的任意组合；质控对照由表面化学对照、荧光标记对照、阳性对照、阴性对照、杂交对照和空白对照组成表面化学对照，优选具有序列表SEQ ID No.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修饰，3’端Cy3或Cy5修饰；荧光标记对照，优选具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；阳性对照优选具有序列表SEQ ID No.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；阴性对照优选具有序列表SEQ ID No.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；杂交对照优选具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，5’端氨基修饰；空白对照为点样缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种检测豆科植物病毒的基因芯片，其特征在于所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片。
3.根据权利要求1或2所述的一种检测豆科植物病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片每条探针横向重复2点，每点的探针的量为0.002-0.02pmol，点直径约180μm，点间距300μm。
4.根据权利要求1或2所述的一种检测豆科植物病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片每张具有4个相同矩阵，探针排布方式为每个矩阵17行10列。
5.一组人工合成检测豆科植物病毒的引物序列，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.178所示的序列中的一种或多种序列的组合。
6.一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，由下述组分组成其中基因芯片、芯片盖片和芯片杂交盒室温贮存，其它试剂需-20℃贮存；(1)基因芯片、芯片盖片和芯片杂交盒其中基因芯片的固相载体表面固定有若干探针和质控对照，探针选自具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列中的任意组合；质控对照由表面化学对照、荧光标记对照、阳性对照、阴性对照、杂交对照和空白对照组成；(2)DEPC水；(3)反转录试剂；(4)反转录酶；(5)RNA酶抑制剂；(6)PCR酶；(7)40种病毒PCR引物及试剂每种423ul-846ul，包括苹果褪绿叶斑病毒PCR试剂、苜蓿花叶病毒PCR试剂、南芥菜花叶病毒PCR试剂、菜豆普通花叶病毒PCR试剂、黑眼豇豆花叶病毒PCR试剂、菜豆荚斑驳病毒PCR试剂、黄瓜花叶病毒PCR试剂、豇豆花叶病毒PCR试剂、豇豆重花叶病毒PCR试剂、香石竹环斑病毒PCR试剂、茄子花叶病毒PCR试剂、蚕豆坏死黄花病毒PCR试剂、葡萄卷叶病毒-2PCR试剂、木槿褪绿环斑病毒PCR试剂、莴苣花叶病毒PCR试剂、百合无症病毒PCR试剂、李矮缩病毒PCR试剂、豌豆早枯病毒PCR试剂、花生斑驳病毒PCR试剂、白草花叶病毒PCR试剂、李属坏死环斑病毒PCR试剂、李痘病毒PCR试剂、豌豆种传花叶病毒PCR试剂、花生矮化病毒PCR试剂、悬钩子环斑病毒PCR试剂、大豆矮缩病毒PCR试剂、南方菜豆花叶病毒PCR试剂、甘蔗花叶病毒PCR试剂、草莓潜环斑病毒PCR试剂、南瓜花叶病毒PCR试剂、番茄不孕病毒PCR试剂、番茄黑环病毒PCR试剂、番茄丛矮病毒PCR试剂、烟草花叶病毒PCR试剂、番茄环斑病毒PCR试剂、烟草环斑病毒PCR试剂、烟草脆裂病毒PCR试剂、番茄斑萎病毒PCR试剂、白三叶草花叶病毒PCR试剂、小西葫芦花叶病毒PCR试剂；(8)阳性对照PCR引物及试剂；(9)标记对照；(10)标记PCR引物及试剂；(11)杂交对照；(12)2x杂交缓冲液。
7.根据权利要求6所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(1)基因芯片的规格为25mm×75mm，每盒10-20片。
8.根据权利要求6所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(1)基因芯片的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片。
9.根据权利要求6所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(1)基因芯片的表面化学对照，优选具有序列表SEQ ID No.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修饰，3’端Cy3或Cy5修饰；荧光标记对照，优选具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；阳性对照优选具有序列表SEQ IDNo.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；阴性对照优选具有序列表SEQ ID No.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修饰；杂交对照优选具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，5’端氨基修饰；空白对照为点样缓冲液。
10.根据权利要求6所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(1)基因芯片的每条探针横向重复2点，每点的探针的量为0.002-0.02pmol，点直径约180μm，点间距300μm。
11.根据权利要求6所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(1)基因芯片每张具有4个相同矩阵，探针排布方式为每个矩阵17行10列。
12.根据权利要求6-11中任何一项所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(7)40种病毒PCR试剂中的豆科植物病毒检测引物序列具有序列表SEQ ID No91至SEQ ID No178所示的核苷酸序列。
13.根据权利要求6至11中任何一项所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(8)阳性对照PCR试剂的引物序列具有序列表SEQ IDNo87和SEQ ID No88所示的核苷酸序列。
14.根据权利要求6至11中任何一项所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(9)标记对照模板序列具有序列表SEQ ID No89所示的核苷酸序列。
15.根据权利要求6至11中任何一项所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(10)标记PCR试剂的标记引物序列具有序列表SEQID No90所示的序列。
16.根据权利要求6至11中任何一项所述的一种可直接应用于检疫工作的豆科植物病毒的试剂盒，其特征在于所述(11)杂交对照的序列具有序列表SEQ ID No86所示的序列。
全文摘要
一种检测豆科植物病毒的基因芯片，在固相载体表面固定有若干探针和质控对照，其中探针具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列；质控对照由表面化学对照、荧光标记对照、阳性对照、阴性对照、杂交对照和空白对照组成。本发明的优点和创新之处在于实用性强、快速、特异、灵敏、反应成本低、重复性好，结果稳定可靠。经过重复性和稳定性实验证明该检测系统可以保证检测结果的重现性和精确性，可广泛应用于出入境检验检疫系统的植物检疫、植物源性食品安全监察、植保站植物病毒病的诊断以及植物病毒分类学研究中病原体鉴定等领域。豆科植物病毒基因芯片检测试剂盒可以用于600多种豆科植物源性食品的日常检疫工作中。
文档编号C12Q1/68GK1952648SQ200610081219
公开日2007年4月25日 申请日期2006年5月25日 优先权日2005年10月19日
发明者汪琳, 吴小兵, 相宁, 周雪平, 周琦, 任鲁风, 马新颖, 高文娜, 李明福, 邓丛良, 王欣月, 张永江, 汪万春, 种焱, 王甲正, 何新舟, 于翠, 吴建祥 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局, 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所, 浙江大学生物技术研究所, 本元正阳基因技术股份有限公司