专利名称：一株微嗜酸寡养单胞菌及其在防治苹果树腐烂病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于苹果树腐烂病菌生物防治的细菌的分类鉴定、发酵液的制备方法及对苹果树腐烂病的防治。
背景技术：
苹果是我国的重要经济作物和出口水果，栽培面积和产量均居世界首位。然而，病害却严重制约着我国苹果产业的发展,特别是苹果树腐烂病(Valsa ceratosperma)在我国分布广、危害重、防治难，果农称之为苹果树“癌症”。腐烂病菌具有潜伏侵染特性，一旦条件适宜染病部位树皮迅速腐烂坏死、树势衰退、降低苹果产量和品质，严重时可引起主干及整树死亡，甚至造成毁园(陈策，2009 ;陈策等，1987)。自1916年苹果树腐烂病在辽宁省南部地区发现以来，该病已在我国有过几次大流行，造成大面积果树死亡。随着我国苹果产业种植结构的调整，现在主栽的苹果品种几乎均对腐烂病菌敏感。2008年，国家苹果产业技术体 系调查显示，全国范围内苹果腐烂病的总体发生率高达52. 7% ;2011年，对栖霞等地腐烂病的发生严重程度进行了调查，结果表明，所调查果园具有新病疤的病株率为68. 20%，死株率为2. 76%，总体发病情况比一般年份严重(曹克强等，2009 ;王彩霞等，2012)。苹果是多年生木本植物，难以通过栽培坑病品种解决病害问题，且苹果树腐烂病具有逐年累积，连续危害的特点。目前，对于苹果树腐烂病等病害的防控主要依靠化学药齐U，因此，苹果果园用药量比大田作物要高出几倍到十几倍。长期大量使用化学农药不仅会严重污染环境，造成对非靶标生物的有害影响，使果园生态环境恶化，同时也会增加腐烂病菌的突变几率，导致抗、耐药性菌株的大量增加。因此，寻找新的、安全有效的措施来防治苹果树腐烂病显得尤为迫切和重要。利用生防菌防治植物病害在国内外均有相关报道，经检索，申请者在现有的专利和非专利文献中没有检索到微嗜酸寡养单胞菌用于苹果树腐烂病生物防治的相关文献报道和专利。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种针对由黑腐皮壳菌(Valsa ceratosperma)引起的苹果树腐烂病具有显著生物防治效果的微嗜酸寡养单胞菌菌株；将其制备为生防菌齐U，用来防治苹果树腐烂病。以此减少化学药剂的使用次数和使用量，消弱其对环境的破坏以及对人类身体健康的影响，并可延迟苹果树腐烂病菌抗、耐药菌株的出现，以实现苹果产业向着安全、高效、可持续的方向发展。本发明通过以下技术方案实现本发明从山东省苹果主产区栖霞市商品苹果园的根际土壤中分离筛选获得一株用于苹果树腐烂病生物防治的细菌菌株BJl，经形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析鉴定为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila),该菌株已于2011年12月23日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO M2011475o申请人:利用液体发酵的方法制备了一种对苹果树腐烂病具有防治作用的微生物菌剂，其步骤如下I)培养基的制备NA培养基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g，NaCl 5. 0g，琼脂粉15. 0g，加水定容至IOOOmL, pH 值 7. 0,121°C高压蒸汽灭菌 20min ；NB培养基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g，NaCl 5. 0g，加水定容至lOOOmL，pH值7. 0，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；
2) BJl菌株的活化先将保存的生防菌微嗜酸寡养单胞菌BJl接种在上述NA培养 基中，于30°C恒温培养箱中活化24h ；3) BJl菌株的液体培养挑取步骤2)中活化的微嗜酸寡养单胞菌BJl菌株的单菌落，接种于装瓶量为80mL/250mL的NB培养基中，180r. min—1，30°C恒温振荡培养48h，得到浓度为IO7Cfu. ml/1的BJl菌株的细胞培养液；4)BJ1生防制剂的制备将步骤3)中制备的细胞培养液，在4°C条件下，12000r.rniiT1离心20min，收集上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，上清液即为无菌发酵滤液；5)稀释将步骤4)中制备的无菌发酵滤液稀释0-100倍。本发明的有益效果是I.本发明微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)BJl菌株对苹果树腐烂病有显著的防治效果，实施例的研究表明，本发明的生防菌株在苹果离体枝条防效试验中，发酵滤液对苹果树腐烂病的防效可达到94. 97%，在2 3年生苹果幼树防效试验中，发酵滤液的防效也达70%以上,与化学药剂10%苯醚甲环唑Difenoconazole (世高)可湿性粉剂防效相当；2.本发明所提供的微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)BJl菌剂防治效果稳定，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
图I :微嗜酸寡养单胞菌BJl菌株16S rDNA基因PCR扩增示意中M为核酸Marker，1-3分别为BJl菌株基因组DNA稀释10、50和100倍的扩
增结果图2 :微嗜酸寡养单胞菌BJl菌株发酵滤液对苹果树腐烂病菌分生孢子萌发的影响；图中A为25°C保湿36h腐烂病菌分生孢子对照萌发情况；B_E为菌株BJl发酵滤液处理后保湿36h腐烂病菌分生孢子萌发受抑制情况图3 :微嗜酸寡养单胞菌BJl菌株发酵滤液对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响图中A为苹果树腐烂病菌的正常菌丝；B_C为腐烂病菌与BJl菌株对峙培养5d后的畸形菌丝本发明菌体的保藏信息如下保藏单位中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)地址中国·武汉·武汉大学
保藏日期2011年12月23日保藏编号CCTCCNO M2011475具体实施技术以下实施例仅用于对本发明做进一步的描述，并不是用来限制本发明的范围。实施例I生防菌BJl菌株的筛选从山东省苹果主产区栖霞市商品苹果果园园的根际土壤中分离到63株细菌，利用传统的平板对峙培养法进行初筛，后将得到的初筛菌株在NB培养基中进行液体发酵，利用发酵滤液进行复筛，最后得到对苹果树腐烂病菌具有显著拮抗作用的菌株BJl (结果见表I)。 所用固体平板为PDA培养基，其组分及配方如下马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15 20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至lOOOmL，pH值天然，在121°C高压蒸汽灭菌20min。生防菌BJl菌株的鉴定(I)形态特征BJ1菌株在NA培养基(配方蛋白胨lO.Og，牛肉膏3. 0g，NaCl5.0g，琼脂粉15. 0g，加水定容至IOOOmL,天然pH值，121°C高压蒸汽灭菌20min)上菌落不规则、黄色、中央略突起、不透明、镜检为杆状(0. 4μ -0. 5μπ Χ0. 2μ -0. 3μ )、不产芽孢、革兰氏染色阴性。BJl菌株的保存方法按周德庆主编，《微生物学实验技术手册》，上海科学技术出版社，1986版介绍的方案进行操作。(2)生理生化特性测定方法参阅东秀珠和蔡妙英的《常见细菌系统鉴定手册》进行，BJl菌株不形成H2S和吲哚，接触酶阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原阴性，明胶水解阳性，淀粉水解阴性，柠檬酸盐利用阴性；可利用葡萄糖，不利用果糖、半乳糖、乳糖、木糖、甘露糖、蔗糖和麦芽糖；可利用丙酸盐、丙酮酸、苹果酸和酸性氨基酸为唯一碳源生长；NaCl浓度超过7%时生长缓慢。(3) 16S rDNA序列分析采用CTAB法提取细菌基因组DNA，以细菌16S rDNA通用引物 27F(5' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3')(Chen et al.，2009)对DNA模板进行PCR扩增。PCR扩增反应体系(50 μ L)为PCR MasterMix 25 μ L、引物各 2 μ L、模板 DNA IyUddH2O 20 μ L0 PCR 反应条件95°C预变性 3min ;94°C变性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 I. 5min,30 个循环；最后 72°C延伸 5min。PCR 扩增结果见图I。PCR扩增产物经切胶回收后，直接送交上海生物工程有限公司进行序列测定。测定序列的分析结果表明16S rDNA扩增片段长度为1464bp，其序列如序列表SEQID N0:1所示。将所得序列采用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLAST软件与GenBank中的核酸序列进行比对，与微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila) ISA5 菌株(Accession No HQ189750)的相应序列同源性为 99%。结合以上3点，形态学特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，将菌株BJl鉴定为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)。实施例2
微嗜酸寡养单胞菌BJl菌株对多种果树病原真菌的抑制作用生防菌BJl对苹果树腐烂病(V. ceratosperma)、桃褐腐病菌(SclerotiniaIaxa)、楼桃干腐病菌(Phomopsis perniciosa)、桃树腐烂病菌(V. Ieucostoma)和苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana)等多种果树主要病原真菌具有显著的抑制作用，表现出良好的广谱抗菌特性，结果见表I。表I生防菌BJl菌株对果树主要病原真菌的抑制效果
病原菌抑菌率(％)病原菌抑菌率(％)~ 桃褐腐病菌油63.73±5.45aBotryosphaeria 49.86±2.35 be
berengeriana
樱桃干腐病菌 Phomopsis62 42±4 32 a 苹果炭疽病菌 Glomerella45 92±l Q2。
perniciosa' . cingulata. _
桃树腐烂病菌 Vaka Ieucostoma 61.78士2.73 a 苹果霉心病菌 Trichothecium45.67±4.57 c
rose um
梨树腐烂病菌 Fa/sa a/wWrns 52·09±4·63 b 梨揭腐病菌 Moni/iniafriictigena 33.97±1.39 d实施例3微嗜酸寡养单胞菌BJl对苹果树腐烂病菌的抑制作用(I)菌株BJl发酵滤液对腐烂病菌分生孢子萌发的影响菌株BJl发酵滤液对腐烂病菌分生孢子的萌发有显著的抑制作用，对照腐烂病菌分生孢子萌发后芽管粗壮，粗细均匀且生长迅速(见图2，A) ；BJ1菌株发酵滤液处理后，腐烂病菌分生孢子及芽管明显畸形，表现为分生孢子萌发的芽管很短(见图2，B-C)，或分生孢子显著膨大，萌发的芽管不能继续伸长(见图2，D)，有些萌发的芽管伸长后顶端膨大(图2，E)。(2)菌株BJl对腐烂病菌菌丝形态的影响对照腐烂病菌菌丝粗细均匀、分枝较少，顶端菌丝生长笔直且略细；与生防菌BJl对峙培养3-5d后，病原菌菌丝颜色明显加深，菌丝顶端显著膨大、有的菌丝分支增多，部分菌丝细胞质外渗。实施例4一种对苹果树腐烂病具有防治作用的微生物菌剂，其步骤如下I)培养基的制备NA培养基蛋白胨10. Og，牛肉膏3. Og，NaCl 5. Og，琼脂粉15. Og，加水定容至lOOOmL, pH 值 7. 0,121°C高压蒸汽灭菌 20min ；NB培养基蛋白胨10. Og，牛肉膏3. Og，NaCl 5. Og，加水定容至lOOOmL，pH值7. 0，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；2) BJl菌株的活化先将保存的生防菌微嗜酸寡养单胞菌BJl接种在上述NA培养基中，于30°C恒温培养箱中活化24h ；3) BJl菌株的液体培养挑取步骤2)中活化的微嗜酸寡养单胞菌BJl菌株的单菌落，接种于装瓶量为80mL/250mL的NB培养基中，180r. min—1，30°C恒温振荡培养48h，得到浓度为IO7Cfu. ml/1的BJl菌株的细胞培养液；4)BJ1生防制剂的制备将步骤3)中制备的细胞培养液，在4°C条件下，12000r.miiT1离心20min，收集上清液经O. 22 μ m微孔滤膜过滤，上清液即为无菌发酵滤液；5)稀释将步骤4)中制备的无菌发酵滤液稀释0-100倍。实施例5微嗜酸寡养单胞菌BJl对苹果离体枝条腐烂病的防治效果切取带有成熟腐烂病菌分生孢子器的苹果树皮组织保湿，待分生孢子角溢出后，用5%富士苹果汁制备成浓度为IO6个/mL的孢子悬浮液。采集I 2年生富士苹果枝条，剪取30cm长、粗细一致的枝段，75%乙醇溶液消毒后用无菌水反复冲洗。先用电烙铁烫伤离体枝条(伤口直径I 2mm)，分别接种50 μ L生防菌BJl的细胞培养液(约107cfu. mL-Ι)和不同稀释倍数的发酵滤液，室温晾干后再接种100 μ L腐烂病菌的孢子悬浮液(IO6个/mL)，用保鲜膜密封保湿48h。以接种无菌水和苯醚甲环唑药剂(厂家推荐剂量)的枝条作为对照，于25°C恒温100%相对湿度下暗培养，14d后测量病斑大小，按照椭圆面积公式计算病斑面积和防治效果(郜佐鹏等，2009)。 防治效果(％ )=(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积X 100实验结果见表2，菌株BJl细胞培养液和不同稀释倍数的发酵滤液均对腐烂病有显著的抑制效果，病斑长度和病斑面积显著低于无菌水对照。细胞培养液和发酵滤液对腐烂病的防治效果相当，且与稀释10倍的发酵滤液和农药对照在防效上没有显著差异(P>O. 05)，当发酵滤液稀释100倍时防治效果仍近60%。各处理组接种14d后的病斑长度和病斑面积相比接种7d时均略有增加，但其防治效果没有降低。表2生防菌BJl对苹果离体枝条腐烂病的防治效果
权利要求
1.一株微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)BJl,于 2011 年 12 月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO :M2011475。
2.根据权利要求I所述的微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)BJl在防治苹果树腐烂病中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述苹果树腐烂病是由黑腐皮壳菌(Valsaceratosperma)弓丨起的。
4.一种制造如权利要求I所述的微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)BJl的生防制剂方法,其特征在于 1)培养基的制备 NA培养基蛋白胨10. Og，牛肉膏3. OgjNaCl 5. Og，琼脂粉15. Og，加水定容至IOOOmL,pH值I. 0,121°C高压蒸汽灭菌20min ；NB培养基蛋白胨10. Og，牛肉膏3. Og，NaCl 5. Og，加水定容至lOOOmL，pH值7.0，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121 °C高压蒸汽灭菌20min ； 2)BJl菌株的活化先将保存的生防菌微嗜酸寡养单胞菌BJl接种在上述NA培养基中，于30°C恒温培养箱中活化24h ； 3)BJl菌株的液体培养挑取步骤2)中活化的微嗜酸寡养单胞菌BJl菌株的单菌落，接种于装瓶量为80mL/250mL的NB培养基中，180r. min—1，30°C恒温振荡培养48h，得到浓度为IO7Cfu. mL—1的BJl菌株的细胞培养液； 4)BJl生防制剂的制备将步骤3)中制备的细胞培养液，在4°C条件下，UOOOr.mirT1离心20min，收集上清液经0. 22 y m微孔滤膜过滤，上清液即为无菌发酵滤液； 5)稀释将步骤4)中制备的无菌发酵滤液稀释0-100倍。
全文摘要
本发明公开了一株微嗜酸寡养单胞菌及其在防治苹果树腐烂病的生防制剂中的应用，属于植物病害生物防治技术领域。从山东栖霞商品苹果园根际土壤中筛选到一株用于苹果真菌病害生物防治的菌株-微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)BJ1菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM 2011475。本发明所述的微生物菌剂，制备方法如下1)培养基的制备，2)BJ1菌株的活化，3)BJ1菌株的液体培养，4)BJ1生防制剂的制备，5)稀释。本发明微嗜酸寡养单胞菌BJ1菌株对苹果树腐烂病有显著的防治效果，防治效果稳定，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
文档编号A01N63/02GK102851225SQ20121006779
公开日2013年1月2日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者王彩霞, 李保华, 李桂舫, 董向丽, 张清明 申请人:王彩霞