专利名称：一种水稻根毛伸长控制基因ksrh1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种图位克隆技术克隆的水稻KSRHl (.Kasalath Short Root Hair 2 )基因的 cDNA 序列，该 cDNA 编码的蛋白属于 NADPH氧化酶，以及转基因互补功能试验鉴定该基因。
背景技术：
根毛作为植物根系的重要组成部分，是根系特化的表皮细胞外伸形成的管状突出物，它可有效扩大表皮细胞与根际土壤的接触面积，有利于提高根系吸收土壤中水分和矿质营养的效率以及与土壤微生物的互作(Gilroy and Jones, 2000)。根毛中含有參与营养吸收的酶类和养分转运体，它对养分的吸收功能一直是植物营养、生理和农学专家的研究重点。土壤干旱所引起的根的形态和生理反应，首先就是根毛萎蔫、枯死，吸收活性降低，这是干 旱造成作物减产的主要原因之一。同吋，由于根毛细小，其周围更易产生较大的浓度梯度，对那些在土壤中浓度低、移动性小、靠扩散作用向根表供应的营养元素(如磷、钾、微量元素等)的吸收尤为重要(Vance et al. , 2003; Hill et al. , 2010)。活性氧(ROS)參与植物根毛细胞的生长发育调节。ROS的主要来源是NADPH氧化酶，植物NADPH 氧化酶被称为Rboh (respiratory burst oxidase homologue),缺乏NADPH氧化酶的拟南芥突变体rAぬ的根系和根毛都非常短小，而且钙离子摄入缺陷，Foreman等在研究该突变体时发现，在野生型植株的根系中抑制NAPDH氧化酶的活性可抑制ROS的积 累及根毛的伸长，这与rAぬ突变体的表型是一致的。反过来将ROS加入到rAぬ突变植株中促进了根毛的生长，并且在这些植株的根系中同时发生了钙离子的摄入增加。胞外ATP调节质膜NADPH氧化酶AtrbohC产生ROS，导致质膜Ca2+离子通道激活，从而使胞液自由Ca2+离子浓度上升，进而调节根毛的生(Demidchik et al.，2009)。关于水稻NAPDH氧化酶对根毛发育的调控机制目前还未见相关报道。Plant extracellular ATP signalling by plasma membrane NADPH oxidaseand Ca2+ channels. Plant J. 2009, 158(6): 963-13
Foreman J, Demidchik V, Bothwe丄I J, et al. Reactive oxygen species producedby NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature 2003, 422(6930): 442-6Gilroy, S. and Jones, D.L. Through form to function: root hair developmentand nutrient uptake. Trends Plant Sci, 2000, 5: 56-60.
Hill J 0, Simpson R J, Ryan M H, et al. Root hair morphology and mycorrhizacolonisation of pasture species in response to phosphorus and nitrogennutrition[J], Crop & Pasture Sci, 2010，61(2):122 - 131. doi:10. 1071/CP09217Vance, C. P. , Uhde-Stone, C. , and Allan, D. L. Phosphorus acquisition and use critical adaptations by plants for securing a nonrenewable resource.New Phytol,2003， 157: 423-447.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻根毛伸长控制基因^STtH/及其编码的蛋白质，该蛋白属NADPH氧化酶，在氨基酸取代或缺失等情况下，能抑制水稻根毛的伸长，使水稻出现短根毛现象，可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻根毛伸长控制基因^STtH/编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列。本发明还同时提供了一种改进了的蛋白质，为氨基酸序列还包括在SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失ー个或多个氨基酸生成的衍生物。本发明还同时提供了一种编码上述蛋白的基因，其具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本发明还同时提供了一种改进了的基因，为核苷酸序列还包括在SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失ー个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。 本发明还同时提供了包含上述核酸的转基因植物细胞。本发明还同时提供了ー种对水稻根毛进行改造的方法，包括用上述基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。本发明的蛋白是ー个NADPH氧化酶。本发明的目的是提供ー种从水稻根毛突变体中克隆的新基因心TtH/，如SEQID NO 1所示的ORF序列，也包括与SEQ ID NO 1所示的ORF序列至少有80%同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID NO :2所示的蛋白质属于NADPH氧化酶，其中进行ー个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID NO :1中添加、取代、插入或缺失ー个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。本发明的另ー个目的是提供ー种用KSRHl基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO :1所示的序列的基因片段的载体。本发明还提供ー种利用植物表达载体转化植物细胞提高水稻根毛发生能力的方法。
图I是7天苗龄的水稻短根毛突变体^与野生型Kasalath表型。图I中A为全株表型；B为主根在体视镜下的观察结果；C为根毛在显微镜下的观
察結果。图2良KSRHl基因在水稻第I条染色体上的定位图。图3是功能互补实验T1代转基因水稻根毛的表型和RT-PCR、Southern杂交检测图。图3中A为野生型和突变体转35STf57tH/载体的两个转基因回复株系(0V1和0V2)的主根在体视镜下的观察结果；B为野生型和突变体转HKSRHl载体的两个转基因回复株系(0V1和0V2)的叶片cDNA的RT-PCR分析；C为为野生型和突变体
转HKSRHl载体的两个转基因回复株系(0V1和0V2)用历idIII酶切后的Southern杂交图。图4是KSRHl基因功能互补验证用遗传转化载体pCAMBIA1300改的结构示意图。
具体实施例方式 以下结合附图、实施例对本发明作进ー步详细描述。实施例I 突变体的表型及遗传分析
从 EMS (ethyl methylsulfonate)诱变的籼稻(处ァ幼 Sativa L. ssp iflt/ica)品种Kasalath突变体库中筛选到一个水稻短根突变体。观察7天苗龄的突变体和野生型的地上部、根部(包括主根、不定根及侧根)表型，在体视镜下观察发现左的根毛能正常发生，但是不能伸长，除了根毛缺陷，其他性状与野生型相比没有显著性的差异(图I)。以突变体突变体为父本，与野生型Kasalath杂交，获得子一代F1植株与野生型Kasalath完全一致，说明ksrhl为隐性突变。F1代自花授粉所得的F2中，正常植株与短根植株的分离比为147/53=2. 77，卡方检测结果为0. 24 < X 20 05, 1=3. 84，正常植株与短根植株的比例符合ー对基因控制的3 1分离比，表明该突变体是隐性单基因突变体，命名该基因为心7( /。 实施例2んSTtH/基因的获得
遗传分析证明该左突变是单基因隐性突变。利用图位克隆技术，通过配置的籼粳交F2群体，HKSRHl基因。图位克隆(map-basedcloning),又称定位克隆(positional cloning), 1986年首先由剑桥大学的Coulson提出。该方法可以在基因产物未知的情况下，根据功能基因在基因组中的位置进行的，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因定位到染色体的I个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断縮小候选区域进而克隆该基因。DKSRHl的初步定位
将突变体^和粳稻Nipponbare进行杂交并获得了 F2群体,利用混合分离分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA)进行^STtH/基因的初步定位。从F2分离群体中随机选择30株具有典型突变性状的植株提取DNA，然后取等量DNA混合构建ー个突变池。以突变池为模板，两亲本和F1 DNA为对照，用12条染色体上均匀分布的116对有多态的SSR标记进行PCR扩增。发现I号染色体上的分子标记RM5389与突变位点在位置上具有明显的连锁性。根据Nipponbare和9311的基因组序列差异，在RM5389附近发展了新的STS标记，其中，S3616在两亲本基因组DNA间检测到多态性，且其交换单株与RM5389的不同。因此，推断突变基因可能位于标记RM5389和S3616之间的区域，物理距离约为435kb。
表I用于定位的分子标记序列
标记引物序列(5’-3’)产物大小
Marker_Primer sequence (5 ~3 )_Product size in
Nipponpare/bp
RM5389 F TCTTGCATGAGAGCCAACAC132R
GCTATTGCGCGAGATTATCC
S3616 F CCATTTGCACCTGCATGC84 R
GCAAAGTGATCTCGCCTTG
S3576 F AACGTATGCAGTCTGCAT99 R GTTTGGTGTCAGTATGTAG
S3578 F AGTGGAGTGTGAATGAAT93 R
CGGATCGAATCGAATCAT
S3585 F TCCTCCCTTCTCGTTGAC103 R
GTGAACGAGAACGACGAG
2)KSRHl精细定位
进ー步扩大突变体和粳稻Nipponbare的杂交组合,获得了包含1335株突变单株的F2分离群体，在RM5389和S3616之间又发展3个有多态性的分子标记对该基因进行了精细定位。结果S3576和S3578检测到I个交换单株，S3585检测到5个交换单株，通 过比较交换单株发现，S3576和S3578的I个交换单株相同，与S3585都不相同。综上结果表明KSRHl基因最终被限定在水稻I号染色体P0506B12 BAC的STS标记S3578和S3585之间，这两个标记之间的物理距离约67kb(图2)。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS(http://ricegaas. dna. affrc. go. jp/rgadb/)分析表明，67kb 区域内共有 11 个基因，分别为预测蛋白3个，未知蛋白3个，NADPH氧化酶基因I个，AT-hook家族基因I个，C0NSTANS(CO)-Iike锌指蛋白基因I个，激酶互作蛋白家族基因I个，SAC3/GANP家族基因I个。3)KSRHl基因的确定
通过上述的基因精细定位及生物信息学方面的分析，目的基因锁定为NADPH氧化酶基因。利用DNA序列测定的方法，分别将突变体基因组DNA和野生型基因组DNA中的NADPH氧化酶基因进行了序列分析，结果表明在该基因的第9个外显子上有一个碱基发生了由G变成A的替换，从而导致该蛋白的第676个氨基酸发生了变化，由丝氨酸(Ser )变成了天冬氨酸(Asp)。因此，将NADPH氧化酶基因确定为目标基因，命名为必TtH/。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS信息表明，该基因从起始密码子到終止密码子的基因组全长为4169bp，共有13个外显子，12个内含子，mRNA全长为2532bp，共编码843个氨基酸。A)KSRHl基因全长ORF的获得
水稻kasalash叶片总RNA的提取采用上海生エRNA提取试剂盒(SK1321 )，以Oligo (dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA 为模板，用引物 primer I (5，- TCTCCCTCTCCCCTTCTCATC -3，)和 primer 2 (5，-CCCAATGCTATCGTATTTCTT -3’ )进行PCR扩增反应，反应条件如下
反应体积20ul，其中含有
模板(cDNA)Iul (2ng)
primer I 和 primer 2终浓度各 0. 2 u M
dNTP终浓度各200 u M
LA Taq DNA 聚合酶IU
10*Taq DNA聚合酶缓冲液 2 U I 用双蒸水补足至20 ill体积。反应程序如下
940C，变性5分钟；然后94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸2. 5分钟，扩增30个循环；最后在72°C下延伸10分钟。扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒(BBI，BS354)按产品说明书进行纯化，然后与口]\ 19-1'载体(131^1^，010认)在16°C下连接8小时，构建重组载体pMDlOT-^STffi/。42°C热激90秒将重组载体pMD19TTf57tH/转化大肠杆菌DH5 a，转化物在含有氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑取克隆，提取质粒，送交上海生エ测序。测序结果表明，扩增到的片段的核苷酸序列如序列表I所示，将该片段命名为^STffi/，全长2532bp，其编码的氨基酸序列见序列表中序列2。实施例3 KSRHl功能互补实验 互补表达载体HKSRHl的构建
用Trizol法提取水稻kasalash叶片总RNA,以Oligo (dt)_18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，用引物primer 3 (5’- AAAGAGCTCGGCATTGCGTGTTCCGGGATG-3’,下划线为 Sac I 识别位点)，primer 4 (5，- AAAGTCGACTTTAGACGTCCTTTGGTACGG-3 ’，下划线为Sal I识别位点)进行PCR扩增反应，反应条件和反应程序如实施例2。扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化后与pMD19-T Simple载体在16°C下连接8 小时，构建重组载体pMD19TSTf57tH/。42°C热激90秒将重组载体pMDIOTS-ISTtH/转化大肠杆菌DH5 a，转化物在含有氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑取克隆，提取质粒，对质粒进行测序。将测序正确的pMD19TSTf57tH/质粒用Sac I/Sal I双酶切，回收2574bp片段，将该片段连接到用Sacl/Sall双酶切的pCAMBIA1300改(以pCAMBIA1300为出发载体，在多克隆位点插入35S启动子和Nos終止子而得到的增强表达载体，图4)载体上，即构建成了互补表达载体，命名为HKSRHしI)功能互补
互补表达载体HKSRHl和pCAMBIA1300改载体(空载体)通过电击的方法分别转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中，利用农杆菌的介导法分别将35STf57tH/和空载体转入短根毛突变体中。转化的具体方法如下将突变体成熟胚种子脱壳灭菌，接种到诱导愈伤组织的培养基中，培养10天后，挑选生长旺盛，顔色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织用作转化的受体，用含有HKSRHl和空载体质粒的EHA105菌株分别水稻愈伤组织；在黑暗处25°C培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织，将潮霉素抗性愈伤组织在分化培养基中成苗后做生根培养，观察根毛的恢复情況。KSRHl功能互补实验结果表明，转HKSRHl载体的水稻65株中有42株恢复短根毛表型为野生型表型，而转空载体的水稻53株中没有一株恢复短根毛表型为野生型表型，为了检测根毛得到回复的转基因阳性植株是否超表达了^基因，采用Trizol法分别提取Kasalath和2个转基因回复株系叶片的总RNA，逆转录成cDNA。半定量反应时，各样品的cDNA模板量先通过OsActin基因的表达量调成一致(扩增条件58°C，26个循环)，再扩增目的基因。目的基因的上游引物序列(5’ -3’ )为CTCGCCTACGTCCTCCT ;下游引物序列(5，-3’)为CGCCACAACTGTAGITTCAAG。目的基因长度为450bp，扩增条件为55°C，28个循环。半定量RT-PCR结果如图3B。为了检测这两个回复的转基因株系是不是独立株系，进行了 Southern杂交检測，剪取叶片按CTAB法提取总DNA，分别用Hindlll酶切后，进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳，转移到尼龙膜上，用600bp潮霉素基因片段作为探针，使用Roche公司的DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit II试剂盒进行探针的标记和杂交检测。结果如图3C。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发
明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容
直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种水稻根毛伸长控制基因^STffi/编码的蛋白质，其特征在于，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的蛋白质，其特征在于，所述氨基酸序列还包括在SEQID NO2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失ー个或多个氨基酸生成的衍生物。
3.ー种编码权利要求I所述的蛋白质的基因，其特征在于，其具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述核苷酸序列还包·括在SEQID N0:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失ー个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
5.ー种包含权利要求3或4所述核酸的转基因植物细胞。
6.ー种对水稻根毛进行改造的方法，其特征在于包含权利要求3或4所述的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
全文摘要
本发明公开了一种水稻根毛伸长控制基因KSRH1编码的蛋白质，其具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了一种对水稻根毛进行改造的方法，包括用上述基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
文档编号A01H5/06GK102796711SQ20121030227
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者丁沃娜, 朱世华, 史俊颖 申请人:宁波大学