专利名称：奶山羊泌乳量相关microRNA-431基因单核苷酸多态性及其检测和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于奶山羊选育技术领域，涉及奶山羊泌乳量相关microRNA-431基因单核苷酸多态性及其检测和其作为辅助选择标记在奶山羊育种中的应用。
背景技术：
羊奶是保健营养品，作为人类的三大乳源之一，营养价值高，具有润心肺、利大肠、补肾益精、滋阴养胃、治消渴、食疗的功能，在西方国家被作为疗效食品。羊奶在国际营养界被誉为“奶中之王”。适用于婴儿、青少年、孕妇、成年人和老人(陈炜，2009)。近年来，随着我国人民生活水平的提高，人们对奶制品的需求也越来越多，在对牛奶需求量逐渐增加的 同时，人们也了解到了山羊奶的营养价值，对山羊奶的需求也在渐渐的增加，但是由于山羊奶有膻味和奶山羊的产奶量较低；在我国优秀奶山羊品种种源不足和种群遗传品质较差也是制约我国奶山羊业发展的重要因素。应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加奶山羊的产奶量和改善乳品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记；其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；直接测序技术成本较高。MicroRNA是一种21_25个核苷酸(nt)的单链小分子RNA，是一类转录后水平的调控因子，并不直接作用于目的基因而是作用于目的基因转录出来的mRNA从而调节目的基因的表达。其参与了细胞的分裂增殖、分化、生物发育及代谢等许多生物学过程，并在疾病发生发展过程中发挥了巨大作用，己有实验证据表明一些miciORNAs在乳腺上皮细胞的分化增殖过程中发挥重要的调控作用。Wang等(Wang and Li. , 2007)应用microRNA芯片已分析出在小鼠的怀孕和哺乳期microRNA-431具有下调作用，但microRNA-431在奶山羊上的研究目前还未见报道。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种奶山羊泌乳量相关microRNA-431基因的单核苷酸多态性及其检测和应用，该基因的单核苷酸多态性其检测方便，可以作为辅助选择标记在奶山羊育种中应用，加快良种选育速度和提高种群品质。本发明是通过以下技术方案来实现一种奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括在如SEQ ID No. I所示的奶山羊microRNA-431基因序列中，其第217位为T或C的单核苷酸多态性。一种奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤I)以包含microRNA-431基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以弓丨物对P为引物，PCR扩增奶山羊microRNA-431基因；所述的引物对P为正向引物 cccttctcaggtggttccc ；反向引物 gcagatgacgcccaggtt ；2)用限制性内切酶MluI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊microRNA-431基因序列中第217位的单核苷酸多态性 TT基因型表现为355bp条带；TC基因型表现为355，334和21bp条带；CC基因型表现为334和2 Ibp条带。所述的PCR扩增的反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s, 35个循环；72°C延伸IOmin0所述琼脂糖凝胶电泳为3. 0%的琼脂糖凝胶电泳。所述将奶山羊microRNA-431基因第217位SNP位点的TT基因型作为有效DNA标记。所述的有效DNA标记为TT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第三胎泌乳量的分子遗传标记。所述的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性在奶山羊标记辅助选择中的应用。所述奶山羊microRNA-431基因第217位的单核苷酸多态性中的TT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第三胎泌乳量的分子遗传标记。所述的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性在区分绒山羊与奶山羊的分子遗传标记中的应用。所述的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性在区分绒山羊与奶山羊的分子遗传标记中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性，利用DNA池测序的方法筛查奶山羊microRNA-431基因的多态性位点，结果表明该基因第217位为T或C的碱基多态性，而且进一步表明该基因与奶山羊的泌乳量相关，多态性可作为辅助选择标记在奶山羊育种中应用，从而加快良种选育速度和提高种群品质。本发明提供的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性的检测方法，针对其多态性的特性，设计了特定的PCR弓I物扩增，用限制性内切酶MluI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定SNP多态性，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。本发明提供的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性，对2个奶山羊品种和2个绒山羊样品的上述SNP进行了基因分型和基因频率分析，结果表明这个位点检测能够成为绒山羊与奶山羊的区分特征；同时也对MluI多态位点与莎能奶山羊各胎年泌乳量之间进行了关联分析。方差分析结果表明，MluI多态位点能够成为提高奶山羊第二胎和第三胎泌乳量的分子标记。本发明提供的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记，可用于奶山羊的辅助选择和分子育种。
图I是本发明的技术流程示意图；图2是本发明中PCR克隆筛查到的奶山羊microRNA-431基因序列表SEQ ID No. I上游第217位T-C突变的SNP多态性测序结果图；
图3是本发明用来检测SNP多态性的PCR引物设计和扩增产物中SNP位点突变的示意图，其中方框中表示突变位点、带下划线为内切酶识别序列，小写“ac”是引入的错配碱基;图4是本发明多态性检测的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中琼脂糖凝胶浓度为 I. 0% ；图5是本发明中奶山羊microRNA-431基因序列表SEQ ID No. I上游第217位的MIuI-RFLP的三种基因型电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为3. 0% ;其中，TT基因型表现为355bp条带，TC基因型表现为355，334和21bp条带，CC基因型表现为334和21bp条带；由于21bp较小，故在琼脂糖电泳中看不到，但不影响判别基因型。
具体实施例方式本发明首先根据microRNA-431基因的保守序列设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序。然后，进行测序图的分析和序列的比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的MIuI-RFLP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和泌乳量的关联分析，筛选出与奶山羊泌乳性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。a、山羊microRNA-431基因DNA序列的克隆及其多态性的检测I、山羊血样的采集及处理取山羊血样10mL，加入O. 5mol/L的EDTA500 μ L抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80°C保存备用。本发明采用了 4种山羊品种，包括2中奶山羊和绒山羊，具体为I)关中奶山羊血样440份采自陕西省西安市三原塔南保种场；2)萨能奶山羊血样268份采自陕西省宝鸡市千阳县萨能奶山羊繁育中心(201份)和西北农林科技大学奶山羊场(67份)；3)南疆白绒山羊血样230份采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐地区；4)新疆白绒山羊血样119份采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐地区；2、血样基因组DNA的提取
I)将冷冻血样室温解冻，转移500 μ L至I. 5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混勻，12000r/min离心IOmin (4°C ),弃去上清液,重复上述步骤至上清液透明、
沉淀呈淡黄色。2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500 μ L，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提缓冲液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8. 0，4°C保存备用。3)加蛋白酶K3yL(20mg/mL)并混匀，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加I μ L蛋白酶K混匀继续消化至澄清。4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500 μ L，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 I. 5mL离心管中，重复一次。5)加氯仿500 μ L,充分混勻20min,4°C, 12000r/min离心IOmin,将上清液转入另 一 I. 5mL离心管中。6)加O. I倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，_20°C保存30 60min。7) 4°C,12000r/min离心lOmin，弃去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。8) 4°C, 12000r/min离心IOmin,弃上清液,室温下使乙醇挥发干净。9)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE-缓冲液或超纯水，4°C保存直至DNA完全溶解，O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80°C保存。3、DNA池的构建用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD26tl/OD280的比值。如0D26(i/0D28(i比值小于I. 6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于I. 8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA 浓度(ng ) =50 X OD260 值 X 稀释倍数DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/y L，然后从关中奶山羊品种30个浓度为50ng/ μ L DNA样品中取10 μ L混合构建成品种DNA池；按照同样的方法也构建萨能奶山羊、南疆绒山羊、新疆绒山羊品种DNA池。4、扩增引物设计由于山羊pri-mi croRNA-431序列至今未知，故从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得同源动物牛的GenBank登录号为NR031063的pri-microRNA-431DNA序列，以该基因序列同源保守区序列为参考用Primer5. O设计山羊pri-miRNA-431的测序PCR引物对，扩增片段总长度为619bp。其测序引物对序列如下正向引物cccttctcaggtggttccc 19 ；反向引物gcagatgacgcccaggtt18 ；5、PCR 克隆山羊的 pri-miRNA-431 DNA 序列分别以4个山羊品种的DNA池为模版，用相应的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μ L，见表I ;PCR反应程序，见表2。表IPCR反应体系
权利要求
1.一种奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性，其特征在于，其基因单核苷酸多态性包括 在如SEQ ID No. I所示的奶山羊microRNA-431基因序列中，其第217位为T或C的单核苷酸多态性。
2.一种奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 O以包含microRNA-431基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊microRNA-431基因； 所述的引物对P为 正向引物cccttctcaggtggttccc ； 反向引物gcagatgacgcccaggtt ； 2)用限制性内切酶MluI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊microRNA-431基因序列中第217位的单核苷酸多态性 TT基因型表现为355bp条带；TC基因型表现为355，334和21bp条带；CC基因型表现为334和21bp条带。
3.如权利要求2所述的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s, 35个循环；72°C延伸IOmin0
4.如权利要求2所述的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳为3. 0%的琼脂糖凝胶电泳。
5.如权利要求2所述的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，将奶山羊microRNA-431基因第217位SNP位点的TT基因型作为有效DNA标记。
6.如权利要求5所述的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的有效DNA标记为 TT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第三胎泌乳量的分子遗传标记。
7.权利要求I所述的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性在奶山羊标记辅助选择中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，奶山羊microRNA-431基因第217位的单核苷酸多态性中的TT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第三胎泌乳量的分子遗传标记。
9.权利要求I所述的奶山羊microRNA-431基因的单核苷酸多态性在区分绒山羊与奶山羊的分子遗传标记中的应用。
全文摘要
本发明公开了奶山羊泌乳量相关microRNA-431基因的单核苷酸多态性及其检测和应用，其基因单核苷酸多态性包括在如SEQ ID No.1所示的奶山羊microRNA-431基因序列中，其第217位为T或C的单核苷酸多态性。RFLP多态性与泌乳量关联分析证实MluI多态位点与产奶量之间有显著相关，基因型为TT的第三胎产奶量和体长显著高于基因型为TC和CC个体的。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的分子遗传标记，以用于奶山羊的辅助选择和分子育种，对提高奶山羊的产奶量具有重要的作用。
文档编号A01K67/027GK102839170SQ20121037181
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者陈宏 , 郭文娇, 李转见, 蓝贤勇, 孙雨佳, 薛璟, 潘虹 申请人:西北农林科技大学