专利名称：蓖麻雌性株的繁殖保持方法
技术领域：
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及蓖麻雌性株的繁殖和保持方法。
背景技术：
蓖麻(TPicizw1S communist L.)属重要工业油源作物,是世界十大油料作物之一，广泛用于高级润滑油、刹车油和防护油、涂料、增塑剂、尼龙系列、聚氨酯、香料、化妆品等化工生产以及医学抗癌药物的研制、生物农药的开发、生物柴油的炼制和优质饲料生产等领域。利用蓖麻油生成化学衍生物已达175种，系列产品达2000多项。目前国内外对蓖麻原料的需求呈上升趋势，原料供需缺口明显，世界年需蓖麻油约70万t，但可供能力只有40万t,国内年需籽量约40万t,而产籽量却不足20万t,缺口将近一半。中国是蓖麻主产国之 一，但农民因品种混杂，单产产量低而种植积极性不高，蓖麻种植面积不稳。在蓖麻原料供不应求、种植面积不稳的情况下，选育高产杂交种，努力提高蓖麻产量或单产，是调动农民积极性、促进蓖麻产业健康发展的有效途径之一。单雌蓖麻因花序上全着生雌花，属不育型材料，作为育种的重要资源，对提高蓖麻产量具有重要作用，其杂种优势利用前景也十分广阔。但由于蓖麻繁殖的常异交性和性别表现的复杂多变，单雌性状(不育性状)较难保持，种子繁殖系数较低，研究人员难以找到一种很好的方法使之保持不育特征。在其保持方法上，存在系统内姊妹交、利用环境高温诱导雄花、利用植物生长调节剂诱导雄花、利用机械损伤等农艺措施诱导雄花、高空压接等方法。目前生产上多数利用姊妹交繁殖雌性(不育)系，但该方法容易导致后代雌性率(不育株率)降低，甚至丧失。邓崇辉等采用单雌(不育株)率较高的系统内单雌(不育)株与两性(可育)株姊妹交，后代雌株率降低3. 09Γ61. 6% ;张维锋等采用姊妹交，雌株率保持50%左右；李文昌等采用姊妹交保持雌性系，所得后代雌性率为0% 50%，有些品种后代雌性率完全散失。利用环境高温诱导雄花保持雌性系，虽然比较成熟，如Zimmerman、Ankineedu等育成了 ‘240’、‘SKP’系列、‘VP-Γ温敏型雌性系，但高温诱导雄花法受到材料及环境条件的限制，只适合于温敏型材料，且对日均温有要求。机械损伤法费工费时、成功率低，且具体方法未见报道。高空压接法虽然繁殖系数较高，雌性系雌性率可提高到98%以上，但费工费时，成本高，且只适合于多年生雌性蓖麻。利用植物生长调节剂或化学药剂诱导雄花的方法已有报道，但研究所用材料是否为100%雌株(不育性株)率的雌性系，并不详细确凿，且喷施时期一般是在开花前的苗期，出现的雄花或两性株，是原有的还是诱导的难以判断，其实际效果如何难以验证。综上所述，如何有效地繁殖保持(发现的或优良的)蓖麻单雌株，是蓖麻杂交育种的关键问题。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种蓖麻雌性株的繁殖保持方法。该方法通过蓖麻雌性株腋芽离体培养的方式，实现了蓖麻单雌株的繁殖保持。
本发明的目的是这样实现的
一种蓖麻雌性株的繁殖保持方法，通过对蓖麻雌性株进行组织培养实现蓖麻雌性株的繁殖保持，所述组织培养包括以下步骤
(1)从蓖麻雌性株中选取健康、壮实的腋芽作为材料，流水冲洗备用；
(2)在超净工作台上，将腋芽依次用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒并冲洗；
(3)剥掉消毒腋芽外面一层苞叶，接入诱导分化培养基中，放入培养室中培养；
(4)培养一段时间后，当腋芽生长分化形成少量不定芽，将腋芽转接入增殖培养基中培
养;
(5)培养一段时间后，当腋芽增殖形成丛生芽，并生长出植株，将丛生芽生长形成的嫩茎切下，在生根培养基中培养，形成健壮的组培生根苗。优选地，本发明所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，还包括组培生根苗的炼苗和移栽。优选地，本发明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步骤(I)中于蓖麻现蕾开花期，可区别雌性株时，在晴天或阴天上午采集雌性株上健康、壮实的腋芽，自来水冲洗干净备用。优选地，本发明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步骤(2)中酒精浓度为75%，浸泡时间为30s，倒掉酒精后无菌水冲洗1-2次，然后加入O. 1%升汞溶液，浸泡时间lOmin，其间不断摇动，倒掉升汞后用无菌水冲冼3次。优选地，本发明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步骤(3)中腋芽清毒后，放在干净滤纸上吸干水分，用镊子和无菌刀剥掉外面一层苞叶，接入诱导分化培养基中；所述诱导分化培养基的配方为MS培养基中添加O. 6mg. Γ1 6-苄氨基嘌呤、O. 5mg. Γ1吲哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%琼脂制成，pH为5. 8±O. I。优选地，本发明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步骤(4)中培养室中培养温度为26±2°C，光照时间12-14h/d，光强1500Lx ;腋芽接入诱导分化培养基15_20d，腋芽膨大长出新叶，并在基部周边分化形成新芽，将新芽或外植体转接入增殖培养基，所述增殖培养基配方为MS培养基中添加O. 3mg. Γ1 6-苄氨基嘌呤、O. 2mg. Γ1吲哚乙酸、3%蔗糖和
O.8%琼脂制成，pH为5. 8±O. I。优选地，本发明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步骤(5)中腋芽在增殖培养基培养15-25d，增殖形成丛生芽，并生长出植株，将生长长度超过2-3cm的嫩茎切下，接入生根培养基；生根培养基的配方为1/2MS培养基中添加O. 5 mg. L—1萘乙酸、O. I mg. L—1吲哚丁酸、3%蔗糖、O. 8%的琼脂和O. 5 g. L-1活性炭制成，pH为5. 8±0. I ;培养20_30d后，形成健壮的组培生根苗。进一步优选地，本发明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其中组培生根苗的炼苗和移栽按如下步骤操作将装有再生苗的培养瓶在室温放置2d，打开封口膜后再放置2-3d，然后小心取出再生苗，将根上的培养基用自来水清洗干净，移栽到装有灭菌培养土的塑料杯或营养钵中，并浇透水，放入生长室培养；所述灭菌培养土由泥炭蛭石营养土=3:3:1的成分组成；生长室温度为26±2°C，光照时间12h/d，光强1500Lx ;将生长室中成活、生长健壮并长出新根的幼苗，于生长季节选择阴天的早晨或傍晚，带土移栽入大田，按IOOcmX IOOcm株行距进行栽种，移栽初期用遮阳网遮阳。
本发明所述的MS培养基和生化药品可由市场上直接购得。所述的6-苄氨基嘌呤为BA，吲哚丁酸为IBA，吲哚乙酸为IAA，萘乙酸为NAA。采用本发明的方法，雌性株腋芽离体培养成活率高，繁殖速度快，增殖系数达
5.88。所得生根苗栽入大田后生长，进入现蕾开花期观察植株性状和性别表现，结果是有的雌性株再生苗全部表现为雌性株，保持了单雌性状，但部分雌性株的再生苗，有的保持单雌性状，有的产生了雄花变成两性株。对部分再生苗雌性株进行同品系隔离开放授粉，成熟时，将所有雌性株分别单株收获。将收获的种子按IOOcmX IOOcm株行距分别播种,现蕾开花期观察统计植株性别表现，结果是雌性再生苗F1代的雌性株率为30-100%，其中2株雌性再生苗的F1代雌株率分别高达90%和100%。由此可见，通过对蓖麻雌性株进行离体培养得到生根苗，并进行常规杂交可以实现蓖麻雌性株的繁殖保持，具有非常显著的社会意义和经济意义。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。本发明实施例的繁殖保持方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，均指重量百分含量。本实施例的实验材料为田间生长的11个蓖麻品系的雌性植株。实验步骤如下
I、蓖麻雌性株腋芽的选择
于蓖麻现蕾开花后，可区别雌性株时，在晴天或阴天上午采集雌性株上健康、壮实的腋芽作为外植体。2、外植体的消毒
将采集的腋芽先用自来水冲洗，再用75%酒精浸泡30s，倒掉酒精后无菌水冲洗1-2次，然后加入O. 1%升汞溶液,浸泡lOmin，其间不断摇动，倒掉升汞后用无菌水冲冼3次。3、腋芽的分化诱导培养
腋芽清毒后，放在干净滤纸上吸干水分，用镊子和无菌刀剥掉外面一层苞叶，接入配制好的诱导分化培养基中进行培养，诱导分化培养基的配方为MS培养基中添加O. 6mg.L、-苄氨基嘌呤、O. 5mg. L—1吲哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%琼脂，培养基PH为5. 8±0. 1，灭菌条件是121°C下20min。培养室中培养温度为26±2°C，光照时间12_14h/d，光强1500Lx。成活率(％)=分化再生的腋芽数/接种的腋芽总数X 100%。结果腋芽接入培养基15-20d，腋芽膨大长出新叶，并在基部周边分化形成新芽，腋芽成活率为70. 75%。4、腋芽的增殖培养
将腋芽和新芽转接入增殖培养基中培养，增殖培养基配方为MS培养基添加O. 3mg.L^6-苄氨基嘌呤、O. 2mg. L—1吲哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%琼脂制成，培养基PH为5. 8±0. I。培养条件和步聚3相同。结果腋芽或新芽在增殖培养基培养15-25d，增殖形成不定芽，有的不定芽生长形成植株，平均增殖倍数为5. 88。5、再生芽的生根
将分化生长出的长度超过2-3cm的嫩茎切下，接入生根培养基；生根培养基的配方为1/2MS培养基中添加O. 5 mg. L-1萘乙酸、O. I mg. L-1卩引哚丁酸、3%蔗糖、O. 8%的琼脂和O. 5
g.L—1活性炭制成，培养基PH为5. 8±0. I ;培养条件和步聚3相同。结果生根培养20-30d后，长出长的主根和许多侧根，植株长大形成健壮的生根苗。6、生根苗的炼苗和移栽
将装有再生苗的培养瓶在室温放置2d，打开封口膜后再放置2-3d，然后小心取出生根苗，将根上的培养基用自来水清洗干净，移栽到装有灭菌培养土(泥炭蛭石营养土=3:3:1)的营养钵中，并浇透水，放入生长室培养；生长室温度为26±2°C，光照时间12h/d，光强1500LX，根据情况适时浇水。待生长室营养钵中的再生苗成活，并长出新根后，于生长季节选择阴天的早晨或傍晚，带土移栽入大田，按IOOcmX IOOcm株行距进行栽种，移栽初期注意用遮阳网遮阳，并适时浇水。7、再生苗及F1代性别表现观察
栽入大田的植株进入现蕾开花期，观察植株性状和性别表现；对部分再生苗雌性株进行同品系隔离开放授粉，成熟时，将所有雌性株分别单株收获；将收获的种子按IOOcmX IOOcm株行距分别播种，现蕾开花期观察统计植株性别表现。结果有些雌性株的再生苗保持了单雌性状，全部表现为雌性株，但部分雌性株的再生苗，有的保持单雌性状，有的产生了雄花变成两性株；表现为雌性的再生苗的F1R的雌性株率为30-100%，其中2株雌性再生苗的F1代雌株率分别高达90%和100% (表I)。表I蓖麻雌性株再生苗性别表现及雌性再生苗F1代雌株率
权利要求
1.一种蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于通过对蓖麻雌性株进行组织培养实现蓖麻雌性株的繁殖保持，所述组织培养包括以下步骤 (1)从蓖麻雌性株中选取健康、壮实的腋芽作为材料，流水冲洗备用； (2)在超净工作台上，将腋芽依次用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒并冲洗； (3)剥掉消毒腋芽外面一层苞叶，接入诱导分化培养基中，放入培养室中培养； (4)培养一段时间后，当腋芽生长分化形成少量不定芽，将腋芽转接入增殖培养基中培养; (5)培养一段时间后，当腋芽增殖形成丛生芽，并生长出植株，将丛生芽生长形成的嫩茎切下，在生根培养基中培养，形成健壮的组培生根苗。
2.根据权利要求I所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于还包括组培生根苗的炼苗和移栽。
3.根据权利要求I所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步骤(I)中于蓖麻现蕾开花期，可区别雌性株时，在晴天或阴天上午采集雌性株上健康、壮实的腋芽，自来水冲洗干净备用。
4.根据权利要求I所述的蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步骤(2)中酒精浓度为75%，浸泡时间为30s，倒掉酒精后无菌水冲洗1-2次，然后加入O. 1%升汞溶液，浸泡时间lOmin，其间不断摇动，倒掉升汞后用无菌水冲冼3次。
5.根据权利要求I所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步骤(3)中腋芽清毒后，放在干净滤纸上吸干水分，用镊子和无菌刀剥掉外面一层苞叶，接入诱导分化培养基中；所述诱导分化培养基的配方为MS培养基中添加O. 6mg. L—1 6-节氨基嘌呤、O. 5mg. L—1叼丨哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%琼脂制成，pH为5. 8 + 0. I。
6.根据权利要求I所述的蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步骤(4)中培养室中培养温度为26 ±2 °C，光照时间12-14h/d，光强1500Lx ;腋芽接入诱导分化培养基15-20d，腋芽膨大长出新叶，并在基部周边分化形成新芽，将新芽或外植体转接入增殖培养基，所述增殖培养基配方为MS培养基中添加O. 3mg. Γ1 6-苄氨基嘌呤、O. 2mg. Γ1吲哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%琼脂制成，pH为5. 8±O. I。
7.根据权利要求I所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步骤(5)中腋芽在增殖培养基培养15-25d，增殖形成丛生芽，并生长出植株，将生长长度超过2-3cm的嫩茎切下，接入生根培养基；生根培养基的配方为1/2MS培养基中添加O. 5 mg. I/1萘乙酸、O. Img. L—1吲哚丁酸、3%蔗糖、O. 8%的琼脂和O. 5 g. L—1活性炭制成，pH为5. 8 + 0. I ;培养20_30d后，形成健壮的组培生根苗。
8.根据权利要求2所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于组培生根苗的炼苗和移栽按如下步骤操作将装有再生苗的培养瓶在室温放置2d，打开封口膜后再放置2-3d，然后小心取出再生苗，将根上的培养基用自来水清洗干净，移栽到装有灭菌培养土的塑料杯或营养钵中，并浇透水，放入生长室培养；所述灭菌培养土由泥炭蛭石营养土=3:3:1的成分组成；生长室温度为26±2°C，光照时间12h/d，光强1500Lx ;将生长室中成活、生长健壮并长出新根的幼苗，于生长季节选择阴天的早晨或傍晚，带土移栽入大田，按IOOcmX IOOcm株行距进行栽种，移栽初期用遮阳网遮阳。
全文摘要
本发明公开了一种蓖麻雌性株的繁殖保持方法，通过对蓖麻雌性株进行组织培养实现蓖麻雌性株的繁殖保持，所述组织培养包括以下步骤(1)以蓖麻雌性株的腋芽为材料，流水冲洗备用；(2)消毒处理；(3)诱导分化培养；(4)增殖培养；(5)生根培养。采用本发明的方法，雌性株腋芽离体培养成活率高，繁殖速度快，增殖系数达5.88。
文档编号A01H4/00GK102934610SQ20121040638
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者谭美莲, 严兴初, 严明芳, 汪磊, 傅春玲, 赵志丹, 王力军 申请人:中国农业科学院油料作物研究所