专利名称：相思树花粉离体培养活力检测技术的制作方法
技术领域：
本发明属于植物杂交育种技术领域，涉及一种相思树花粉离体培养活力检测的技术。
背景技术：
相思树dacia cofl/iAsa)属含羞草科(Mimosacoeie)金合欢属(Acacia)植物，自然分布于澳大利亚昆士兰、巴布亚新几内亚及印度尼西亚等湿润热带地区。相思树具有生长迅速、树冠浓密、落叶量多、根瘤固氮及耐干燥瘠薄的特性，材质优良，可用作纸浆材、建筑材、家具用材等。我国自上世纪60、70年代引种相思树以来，相思树树种的良种选育与栽培研 究一直受到重视，不仅成功筛选出各地适生种源，选育出一批优良家系和无性系，也系统掌握了采种、育苗、造林、抚育管理等一套成熟的栽培技术，取得了丰硕成果。并在海南、广东、广西等地营建了多个相思树种子园，旨在为相思树推广提供高质量的种子。然而，现存的一些问题制约了种子园的产量和质量。例如极端气候异常导致的寒害、人工授粉很难开展、结荚率低下等原因，使种子园不能够有效地发挥其应有的功能，极大地限制了相思树长期可持续发展及研究利用。因此，开展相思树植物的生殖生物学领域的研究显得尤为紧迫。花粉生活力是花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力。在农业和林业的常规育种中，为了进行人工辅助授粉或杂交授粉，需要早期采集和贮存花粉。在使用采集和贮存花粉之前，通常要做花粉生活力的鉴定。因此，掌握花粉生活力检测的方法对于提高植物育种效率具有较高的实际应用价值。花粉萌发率是鉴定花粉生活力的一项重要指标。提取花粉在培养基上萌发，在光学显微镜下用常规方法观察花粉的萌发率，以此作为花粉生活力的标准。不同植物花粉萌发所需要的培养基成分、浓度和培养的环境条件不同。离体萌发测定法可以直观区分死亡或缺乏活力的花粉，数据科学可靠，并可完全定量，对于许多植物都与结实和种子形成有相关性，故仍为目前杂交育种中花粉生活力测定的首选方法。
发明内容
本发明的目的是针对相思树杂交育种花粉活力检测的需要，提供一种相思树花粉离体培养活力检测的方法。本发明的技术方案是
本发明是利用植物花粉在适宜的培养基中，活力强的花粉可发芽，活力小的花粉不发芽或发芽率低这一原理，通过采集发育良好的相思树花序，将花粉播于配制好的液体培养基中，在一定的条件下让其发芽，一定时间后在光学显微镜下用常规方法观察花粉的发芽率，从而检测出相思树花粉的活力。本发明是这样实现的
一种相思树花粉离体培养活力检测方法，包括液体培养基的配制、花枝米摘、花粉播种、培养、光学显微镜观察计数发芽花粉等工序；在相思树花开时节，采集含有多穗新鲜花序的花枝，从花枝上摘取当日开放的新鲜花序分切成多段，以水沉法播种，在一定的温度、湿度、富氧环境条件下培养使其发芽，具体操作步骤如下
(I)液体培养基的配制用蔗糖、硼酸、硝酸钙、去离子水按一定的浓度混合均匀；(2)花枝采摘剪取有多穗已全面开放花序的新鲜花枝，下端插入装有清水的小桶，拿回试验室备用；
(3)花粉播种取凹玻片平放于桌面，用滴管取配制好的培养基2 3滴滴于凹玻片的凹槽内，用镊子摘取花序以水沉法播种，播种后不盖盖玻片；
(4)花粉培养取干净大号培养皿，底部垫上滤纸，滴入去离子水将滤纸浸湿，将凹玻片平放入培养皿中，置于一定环境条件下培养；
(5)光学显微镜观察培养一定时间后将凹玻片置于光学显微镜下用常规方法观察花粉发芽状况。以上所述的液体培养基的组分和体积质量浓度是鹿糖15% 20%，硼酸IOOmg/L 150 mg/L，硝酸隹丐 O. 25 mmol /I, O. 5mmoI / L，其余为水。 以上所述花序是指长在花枝上的一穗花，一个花序通常含有近百朵小花。以上所述新鲜花枝是于早上7点钟前采集，花枝上有多穗花序于当日凌晨全面开放且未被访花昆虫采访的花枝。以上所述的水沉法播种是指从花枝上摘下当日开放的新鲜花序，分切成多段，用镊子断取约有6 9朵小花的花序段，在液体培养基中涮I圈，花粉粒自然沉入液体培养基中。以上所述的环境条件是让培养基中的花粉与空气直接接触而富氧，并控制温度26°C 30°C，湿度 85% 90%。以上所述光学显微镜下用常规方法观察是在花粉培养8小时后进行检测。本发明相对于现有的技术具有以下优点
I、本发明相思树花粉离休培养活力检测方法，播种时用镊子取花序的一段或多段在液体培养基上涮一圈，花粉粒直接沉落于液体培养基中，解决了相思树花粉离体培养时花粉细小、不易收集、播种不均匀这一难题。2、本方法采用的液体培养基中含有15% 20%蔗糖、100mg/L 150mg/L的硼酸和O. 25 mmol/L O. 5mmol/L硝酸钙配制而成，液体稳定可靠，特别适合相思树花粉离休培养。3、花粉播种后，不盖盖玻片，保证微环境内有充足的氧气供应，相思树花粉能够正常发芽，而常规操作播种后盖上盖玻片对于相思树花粉而言不能发芽。这一操作要点解决了相思树花粉离体培养发芽关键技术。4、本方法对相思树花粉离休培养和活力检测，具有播种花粉多而且均匀、检测结果、方法简单、可操作性强特特点，数据科学可靠，并可完全定量，对于提高相思树育种效率具有较高的实际应用价值，可有效解决现有相思树种子园自然结荚率低的问题，提高种子园的产量和质量，使种子园能够有效地发挥其应有的功能，极大地发挥相思树树种的经济效益、社会效益和生态效益。
图I :马占相思花粉培养I. 5小时图片；
图2 :马占相思花粉培养4小时图片；
图3 :马占相思花粉培养6小时图片；
图4 :马占相思花粉培养8小时图片。
具体实施例方式 下面结合实施例，对本发明的相思树花粉离体培养活力检测的方法进一步描述。实施例I
在9月下旬马占相思树花开时节，于7点前采集含有多穗当日开放花序的未被昆虫采访的新鲜花枝，置于放有清水的小桶，带回试验室备用；以20%蔗糖+150mg/L硼酸+0. 25mmol/L硝酸钙浓度配成液体培养基，滴3滴于凹玻片凹槽，取采集好分切成多段的2段花序，用镊子夹好在培养基中涮I圈，不用盖上盖玻片，然后将凹玻片平放入垫有湿润滤纸的培养皿内，保持培养湿度为26°C，湿度为85%。培养I. 5,4. 0,6. 0、8小时后，置于光学显微镜下用常规方法观察花粉的发芽数量，光学显微镜图片依次分别是图I、图2、图3、图4。实施例2
在5月中旬红豆相思树花开时节，于7点前采集含有多穗当日开放花序的未被昆虫采访的新鲜花枝，置于放有清水的小桶，带回试验室备用；采用15%蔗糖+100mg/L硼酸+0. 5mmol/L硝酸钙配成液体培养基，滴2滴于凹玻片凹槽，摘取新鲜花序分切成多段，用镊子夹取3段在培养基中涮I圈，不用盖上盖玻片，然后将凹玻片平放入垫有湿润滤纸的培养皿内，保持培养湿度为28°C，湿度为88%，培养8小时后，置于光学显微镜下用常规方法观察花粉的发芽数量。实施例3
在10月上旬大叶直杆相思树花开时节，于7点前采集含有多穗当日开放花序的未被昆虫采访的新鲜花枝，置于放有清水的小桶，带回试验室备用；取18%蔗糖+130mg/L硼酸+0. 35mmol/L硝酸钙浓度配成液体培养基，滴2滴于凹玻片凹槽，取采集好分切成多段的3段花序，用镊子夹好在培养基中涮I圈，不用盖上盖玻片，然后将凹玻片平放入垫有湿润滤纸的培养皿内，保持培养湿度为27°C，湿度为90%，培养8小时后，置于光学显微镜下用常规方法观察花粉的发芽数量。实施例4
在10月上旬厚荚相思树花开时节，于7点前采集含有多穗当日开放花序的未被昆虫采访的新鲜花枝，置于放有清水的小桶，带回试验室备用；取20%蔗糖+150mg/L硼酸+0.5mmol/L硝酸钙浓度配成液体培养基，滴2滴于凹玻片凹槽，取采集好分切成多段的3段花序，用镊子夹好在培养基中涮I圈，不用盖上盖玻片，然后将凹玻片平放入垫有湿润滤纸的培养皿内，保持培养湿度为30°C,湿度为90%,培养8小时后,置于光学显微镜下用常规方法观察花粉的发芽数量。
权利要求
1.ー种相思树花粉离体培养活力检测方法，包括液体培养基的配制、花枝米摘、花粉播种、培养、光学显微镜观察计数发芽花粉等エ序；其特征在于在相思树花开时节，采集含有多穗新鲜花序的花枝，从花枝上摘取当日开放的新鮮花序分切成多段，以水沉法播种，在一定的温度、湿度、富氧环境条件下培养使其发芽，具体操作步骤如下 (1)液体培养基的配制用蔗糖、硼酸、硝酸钙、去离子水按一定的浓度混合均匀； (2)花枝采摘剪取有多穗已全面开放花序的新鮮花枝，下端插入装有清水的小桶，拿回试验室备用； (3)花粉播种取凹玻片平放于桌面，用滴管取配制好的培养基2 3滴滴于凹玻片的凹槽内，用镊子摘取花序以水沉法播种，播种后不盖盖玻片； (4)花粉培养取干净大号培养皿，底部垫上滤纸，滴入去离子水将滤纸浸湿，将凹玻片平放入培养皿中，置于一定环境条件下培养； (5)光学显微镜观察培养一定时间后将凹玻片置于光学显微镜下观察花粉发芽状况。
2.根据权利要求I所述的ー种相思树花粉离体培养活力检测方法，其特征在于所述的液体培养基的组分和体积质量浓度是蔗糖15% 20%，硼酸100mg/L 150 mg/L，硝酸 丐 O. 25 mmol/L O. 5mmol/ L,其余为水。
3.根据权利要求I所述的ー种相思树花粉离体培养活力检测方法，其特征在于所述的花序是指长在花枝上的一穂花，ー个花序通常含有近百朵小花。
4.根据权利要求I所述的ー种相思树花粉离体培养活力检测方法，其特征在于所述的新鮮花枝是于早上7点钟前采集，花枝上有多穗花序于当日凌晨全面开放且未被访花昆虫采访的花枝。
5.根据权利要求I所述的ー种相思树花粉离体培养活力检测方法，其特征在于所述的水沉法播种是指从花枝上摘下当日开放的新鮮花序，分切成多段，用镊子断取约有6 9朵小花的花序段，在液体培养基中涮I圈，花粉粒自然沉入液体培养基中。
6.根据权利要求I所述的ー种相思树花粉离体培养活力检测方法，其特征在于所述的环境条件是让培养基中的花粉与空气直接接触而富氧，并控制温度26°C 30°C，湿度85% 90% ο
7.根据权利要求I所述的ー种相思树花粉离体培养活力检测方法，其特征在于所述的光学显微镜观察是在花粉培养8小时后进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种相思树树花粉离体培养活力检测的方法，是于早上7点钟前采集含有多穗当日开放花序的未被昆虫采访的新鲜花枝，花序切成多段，将含有15～20%蔗糖、100～150mg/L的硼酸和0.25/L～0.5mmol/L硝酸钙的培养液滴于凹玻片凹槽内，用镊子夹取2～3段花序在液体培养基中涮1圈至花粉直接沉落培养基中，不盖玻片，播种后将凹玻片置于垫有湿润滤纸的培养皿内培养，8小时后用光学显微镜常规方法观察花粉发芽数量。本方法简单，完全定量，数据可靠，可操作性强，具有较高的实际应用价值，提高相思树育种效率，有效解决现有种子园的产量和质量问题，极大地发挥相思树树种的经济效益、社会效益和生态效益。
文档编号A01H4/00GK102972296SQ20121051432
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者曹艳云, 彭玉华, 何琴飞, 郝海坤, 黄志玲, 申文辉, 欧芷阳, 陈琴 申请人:广西壮族自治区林业科学研究院