专利名称：防治辣椒疫病的生防菌株g1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种防治辣椒疫病的生防菌株Gl及其应用。
背景技术：
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的一种卵菌病害。疫霉菌隶属卵菌门、霜霉目、腐霉科、疫霉属。疫霉菌在土壤中存活不是以一种形态，而是以不同形态即菌丝体、孢子囊、厚垣孢子和卵孢子等多种互变方式存活。该病可以通过雨水与灌溉水，农用器具进行传播，是一种危害性很强的土传病害。随着我国辣椒大量种植，辣椒疫病在露地、保护地与大棚也大面积发生，因为该病害发病周期短，流行速度快，常导致辣椒植株成片死亡，给辣椒产业带来严重的经济损失。一般病株率为20 - 30%，严重时达80%以上，此病害是影响我国辣椒产业经济发展的主要因素之一。辣椒疫霉是一种异宗配合的微生物，它有2种主要的交配型:A1型和A2型。Groves等认为，由于近年来杀菌剂的广泛使用，使辣椒疫霉菌产生了抗药性，从而诱导其交配型的变化，给该病害的防治带来很多困难。苯基酰胺类杀菌剂甲霜灵(metalaxyl)和精甲霜灵(mefenoxam)等专用杀菌剂被广泛用于防治该病害，是目前国内外广泛使用的卵菌病害防治药剂中活性高、使用量大的一类杀菌剂，并取得了良好的防治效果。但由于该类药剂属于特异性位点抑制剂，对病原菌作用位点单一，长期使用极易产生抗药性，导致防治效果下降。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是防治辣椒疫病的又一重要的内吸性杀菌剂，由于其作用机制新颖，与苯基酰胺类杀菌剂无交互抗性，目前被广泛使用。但已有研究表明，某些病原菌靶标对该类药剂产生抗药性自发突变频率较高，在药剂的高选择压力下病原菌易形成抗药性群体。 综上所述，开发新的、有效和安全的微生物杀菌剂控制辣椒疫病的发生是提高辣椒生产总量的需求，同时更是辣椒产业经济、辣椒食用安全及农业可持续发展的需要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株Gl0本发明提供的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株Gl,其保藏号为CGMCC N0.6762。本发明的另一个目的是提供一种制备防治辣椒疫病菌剂的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤:发酵上述的多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa菌株G1，得到发酵产物，即得到菌剂。上述方法中，在所述得到发酵产物后，还包括如下步骤:收集所述发酵产物中的菌体沉淀，再悬浮所述菌体沉淀，得到菌剂。上述悬浮所用的悬浮液为水。上述方法中，所述收集发酵产物中的菌体沉淀采用离心的方式。具体离心为IllOOXg 离心 IOrnin0上述方法中，所述发酵的条件如下:26-28°C、180-200rpm振荡培养24_36h ;所述发酵的条件具体如下:26°C、ISOrpm振荡培养24h。由上述方法制备的菌剂；所述菌剂中的活菌总浓度具体为IXlO7 — IxiO10Cfu/mL，在本发明的实施例中菌剂中的活菌总浓度为IX 107cfu/mL。本发明的第三个目的是提供一种防治辣椒疫病或抗菌产品。本发明提供的产品，其活性成分为上述的多粘类芽孢杆菌PaenibacilluspoIymyxa菌株Gl或上述菌剂。上述产品中，所述辣椒疫病为由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起；上述辣椒疫霉 Phytophthora capsici 具体为辣椒疫霉 Phytophthora capsici 菌株 SD-33 ；所述抗菌为抗 如下6种病原菌中的至少一种:杨树腐烂病菌Valsa sordida、灰霉病菌 Botrytis cinerea、板栗疫病菌 Cryphonectria parasitica、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani Kiihn 和辣椒疫霉 Phytophthoracapsici ο上述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株Gl或上述的菌剂在防治辣椒疫病或抗菌中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述辣椒疫病为由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起；上述辣椒疫霉 Phytophthora capsici 具体为辣椒疫霉 Phytophthora capsici 菌株 SD-33 ；所述抗菌为抗如下6种病原菌中的至少一种:杨树腐烂病菌Valsa sordida、灰霉病菌 Botrytis cinerea、板栗疫病菌 Cryphonectria parasitica、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani Kiihn 和辣椒疫霉 Phytophthoracapsici ο上述生防菌剂防治辣椒疫病的应用方法为:在温室辣椒育苗时用活菌总浓度为I X 107Cfu/mL菌剂浸种I小时，播种时，再浇灌活菌总浓度为IX IO7的菌剂；待辣椒幼苗长至7-8叶期时，先将20mLGl菌剂(活菌总浓度为I X 107cfu/mL)均匀喷洒在整盆辣椒苗上，IOmin后再将每盆用30mLGl菌剂(活菌总浓度为I X 107cfu/mL)灌根处理。细菌Gl,为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa,于2012年11月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为=CGMCC N0.6762。本发明的实验证明，本发明针对目前辣椒疫病没有较高防效的生防制剂现状，提供开发一种防治辣椒疫病的单一细菌多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa Gl及其菌齐U，专用于辣椒疫病的防治，该细菌或其菌剂对这种重要的土传病害有较高的防治效果，温室辣椒疫病的防治效果达71.18%。由于本发明的菌株Gl是专门针对辣椒疫病筛选开发的生防菌株，因而在防治辣椒疫病方面与目前其它广谱生物杀菌剂相比，防治效果显著。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于作物的无公害生产，农民可以不用或减少其它防治辣椒疫病化学农药的用量，这不仅可以为农民节省开支，也有利于辣椒产品的出口。同时该生防制剂还有增产功能，可为农民增加经济收入。
图1为生防细菌对辣椒疫病的防治效果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、生防细菌Gl的分离与鉴定1、菌种分离与鉴定(I)菌株的分离将从山东农业大学科技创新园区采集的辣椒植物用自来水冲洗干净，分为根、茎、叶三部分，再用无菌水冲洗2次，无菌滤纸吸干表面水分。无菌条件下，75%乙醇浸泡lmin，无菌水冲洗3次，转入3%次氯酸钠消毒液浸泡5min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分。将已表面消毒的根、茎、叶分别置于灭菌研钵中剪碎后，加适量无菌水后研磨，再稀释成10'10_2、10_3三个梯度，分别取10_2、10_3稀释梯度的研磨液和最后一次冲洗液各200 μ L移入LA培养基平板内，涂布均匀，最后一次冲洗液做对照CK，每处理重复3次，置28°C培养，逐日观察。选择CK中无菌落，而研磨液中有菌落长出的菌株，根据菌落形态、颜色等特征挑取单菌落，多次平板划线纯化后，将纯化好的菌株进行编号，斜面保存备用。1^培养基:蛋白胨1(^，酵母粉58，似(:158，琼脂粉178，蒸馏水10001111^!1值7.0。(2)拮抗菌的筛选采用平板对峙法进行拮抗细菌的筛选，将供试植物病原真菌杨树腐烂病菌(Valsasordida)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)和辣椒疫霉(Phytophthora capsici)菌株SD-33 (辣椒疫霉菌拮抗细菌的筛选，山东农业科学，2012，44(9):90 - 92 ;公众可从山东农业大学获得)分别接种于PDA平板中央，待测细菌点接于距病原菌左右2cm处，每处理三皿，28°C恒温倒置培养4天后，测定其抑菌率(结果见表I)。抑菌率=(对照平板菌落直径一对峙平板菌落直径)/对照平板菌落直径X 100%。选择对辣椒疫霉具有较强拮抗活性的内生细菌菌株，编号为GI，于5 O %甘油中-80°C下保存。表I为菌株Gl对不同病原菌的抑菌率
病原菌抑菌率(％)
辣椒疫霉 P.capsici78.15±0.71a
杨树腐烂病菌 K sordida68.22±0.73c
灰霉病菌 B.cinerea71.0l士0.45c
板栗疫病菌 C.parasitica64.52±1.89d
瓜果腐霉 P.aphanidermatum59.35±1.89e
立枯丝核菌 i .so/aw/Ktihn73.67±1.43b注:同列数据后的不同字母表示0.05水平上差异显著。2、Gl的形态及生理生化特征检测
(I)菌落和菌株形态特征菌株Gl在LA培养基上呈淡黄色不透明菌落，表面粘稠，菌落边缘不规则。菌体杆状，革兰氏染色反应为阳性，周生鞭毛，芽孢端生，卵圆形。(2)生理生化特征检测可以利用碳源:糊精、糖原、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖、a -D-匍萄糖、a -D-乳糖、麦芽糖、D-甘露醇、D-多汁乳燕糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-匍萄糖苷、D_阿洛酮糖、D-棉子糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、丙三醇、a -D-丙三醇磷酸钠。
不可以利用碳源:a -环糊精、吐温40、吐温80、N-乙酰葡糖胺、D-阿拉伯糖醇、L-岩藻糖、龙胆二糖、m-纤维糖、L-鼠李糖、D-山梨糖醇、木糖醇、丙酮酸甲基酯、琥珀酸单甲酯、醋酸、D-半乳糖酸内酯、D —半乳糖醛酸、肌苷、尿核甙、腐胺、a -羟基丁酸、β -羟基丁酸、羟基丁酸、P-羟苯基乙酸、a -酮戊二酸、D，L-乳酸、丙酸、琥珀酸、琥珀酸酰胺、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰-甘氨酸、L-天门冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-吡咯型谷氨酸、L-丝氨酸、丁二醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐。3、Gl的Biolog微生物自动鉴定系统分析将细菌菌株Gl划线接种到LA平板培养基上，28°C下培养48h，长出单菌落后，送到山东大学微生物技术国家重点实验室进行Biolog系统鉴定。鉴定步骤如下:用Biolog专用培养基将纯种扩大培养。按要求配制一定浊度(细胞浓度)的菌悬液。将菌悬液接种至微孔鉴定板(MiCToplate)。培养一定时间，将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，软件自动给出鉴定结果。启动 Biolog Microstation 工作站 MicroLog ,进入 MicroLog 3.4.20系统。点击SET UP，初始化设置。输入样品编号(Sample Number)，选择鉴定板类型(PlateType):GP2,选择菌株类型(Strain type):GP_Rod SB,选择培养时间(Incubation Time):16_24h。将培养后的鉴定板放入读数仪的托架上，取下盖子。按“Read Next”键开始读数，读数仪扫描鉴定板后，自动弹出，结果显示在电脑屏幕上。启动Biolog Microstation 工作站MicroLog ,进入MicroLog 3.4.20 系统。Biolog Microbial Identification System鉴定结果显示菌株Gl的Species ID是:Paenibacillus polymyxa,即多粘类芽孢杆菌。经B10L0G鉴定，菌株Gl为革兰氏阳性好氧菌，基于完全的底物利用图谱(substrate utilizationprof iles)的检测结果，菌株Gl 为多粘类芽抱杆菌Paenibacilluspolymyxa (species ID)。其中与标准菌株匹配程度SIM>0.5 ;可以与其它鉴定系统比较的参数 PR0B%=100%。系统给出鉴定结果，每个结果用三个指标反映:即可能性Probability (PR0B)，相似性 Similarity (SM)和位距 Distance (DIS)0 PROB 接近 100%，SM 彡 0.5，即可确定一个菌种，而Gl这两者的值分别为100%和0.765，说明鉴定结果是可靠的。至此，暂定菌株Gl属于多粘类芽抱杆菌Paenibacillus polymyxa。4、菌株Gl的分子生物学鉴定使用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNAKit Ver.2.0 试剂盒提取菌株Gl的基因组DNA。采用细菌的通用引物27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ )和1492R(5’ -TACGGTTAC CTTGTTACGATT-3’)，以菌株 Gl 的基因组 DNA 为模板扩增 16SrDNA。采用 25μ I 反应体系:10XPCR Buffer2.5μ L ；25mM Mg2+L 5μ L ；2.5mM dNTP2 μ L ;引物27F1 μ L ;引物 1492R1 μ L ；5U/y L Taq 酶 0.2μ L ;基因组模板 DNAl μ L ；jjp dd H2O 至Ij 25 μ L。PCR 反应程序为 94°C 5min,94°C 30s, 50°C lmin,72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 反应结束后，扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。找到16S rDNA目的条带1500bp，切胶回收。将目的片段连接至载体Peasy-T3，送华大基因测序。测序结果为Gl的16S rDNA的核苷酸序列为序列表中的序列I。同Genbank数据库中已知的16S rDNA序列进行BLAST同源性序列比对分析，结果用MEG4.0软件进行分析。最终鉴定结果菌株Gl为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa。Gl菌株,分类命名为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa,于2012年11月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为=CGMCC N0.6762。
实施例2、细菌Gl在防治辣椒疫病中的应用1、Gl菌剂的制备(I)种子液的制备:将实施例1分离保藏的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa GICGMCCN0.6762接种在含浓度为500 μ g/mL硫酸链霉素(Ster)抗药性标记的LA培养基上28°C培养活化后，移入装有IOOmL LB培养液的250mL的三角瓶中，28°C，180rpm振荡培养24h，得到Gl种子液。LA培养基:蛋白胨1(^，酵母粉58，似(:158，琼脂粉178，蒸馏水10001111^!1值7.0;LB培养基:不加琼脂粉，其它成分与LA培养基相同。(2)菌剂的制备:当Gl种子液培养至OD值在0.5时，将Gl种子液以1:100体积比加入LB培养液中，26°C，180rpm振荡培养24h ;然后以11100 Xg离心IOmin去除上清液收集菌体沉淀。将菌体沉淀用无菌水悬浮稀释得到Gl菌剂，菌剂浓度为I X IO7 — IX 101(lCfu/mL。2、细菌Gl在防治辣椒疫病中的应用( I)盆栽土壤的准备采用基质与大田土 2:1的比例搅拌均匀，高压蒸汽灭菌后待用。( 2 )辣椒盆栽种植
辣椒(品种为特大茄门甜椒，由内蒙古赤峰市展欣种业公司生产销售)种子28°C保湿催芽3天，萌发后用Gl菌剂(Gl菌剂中的活菌总浓度为I X 107cfu/mL)浸种Ih后播种到营养钵中。每钵浇灌Gl菌剂(Gl菌剂中的活菌总浓度为IXlO7) 50mL，以自来水处理为对照。每处理3个重复，每重复5盆，每盆6粒种子。当辣椒幼苗长至7-8叶期时，进行Gl菌剂强化接种处理，具体如下:先将20mLGl菌剂(活菌总浓度为I X 107cfu/mL)均匀喷洒在整盆辣椒苗上，IOmin后再将每盆用30mLGl菌剂(活菌总浓度为lX107cfu/mL)灌根处理。阴性对照组用自来水处理；阳性对照组采用相同方法制备的相同浓度和相同量的多粘类芽孢杆菌菌株XM (辣椒疫霉菌拮抗细菌的筛选，山东农业科学，2012,44(9):90 - 92 ;公众可从山东农业大学获得)的菌悬液处理。(3)辣椒疫霉接种Gl菌剂强化接种后第二天，用浓度为IX 105cfu/mL的辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株SD-33 (记载在辣椒疫霉(Phytophthora capsici)果胶甲基酯酶Pcpme3基因真核表达及功能研究，中国农业科学2009，42(6): 1988-1993 ;公众可从山东农业大学获得)游动孢子悬浮液灌根法接种，每株浇灌游动孢子悬浮液5mL。接种前提前将苗钵灌透水，接种后保湿24h，置于室内，适时浇水保持湿润。接种后第7d调查发病(辣椒疫病)情况并计算防治效果，根据病害发生程度分为6级(林柏青等，辣椒品种抗疫病鉴定方法的初步研究[J].中国蔬菜，1994，(4):21-25):O级:无病；I级:幼苗茎基部稍有变黑，但植株健康不萎焉；2级:幼苗茎基部变黑达l-2cm，叶片不可恢复性萎焉，下部叶片偶有脱落；3级:幼苗茎基部变黑达2cm以上，叶片明显萎焉或明显脱落；
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4级:幼苗茎基部变黑缢缩，除生长点外全部落叶或整株萎焉；5级:植株全部枯死。病情指数=[Σ (病级株数X代表级数)/总株数X最高级代表级数]X 100防治效果％=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数X 100苗期盆栽试验结果如表I和图1所示，可以看出，施用Gl菌剂的辣椒表现出较好的防治效果，达71.18%。表2生防细菌对辣椒疫病的温室防治效果
权利要求
1.多粘类芽抱杆菌PaenibacilluspoIymyxa菌株Gl,其保藏号为CGMCC N0.6762。
2.一种制备防治辣椒疫病菌剂的方法，包括如下步骤:发酵权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus poIymyxa菌株Gl,得到发酵产物，即得到菌剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:在所述得到发酵产物后，还包括如下步骤:收集所述发酵产物中的菌体沉淀，再悬浮所述菌体沉淀，得到菌剂。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述收集发酵产物中的菌体沉淀采用离心的方式。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述发酵的条件如下:26-28°C、180-200rpm振荡培养24_36h ;所述发酵的条件具体如下:26°C、180rpm振荡培养24h。
6.由权利要求2-5中任一所述方法制备的菌剂；所述菌剂中的活菌总浓度具体为IXlO7 — lX10lclcfu/mL。
7.一种防治辣椒疫病或抗菌产品，其活性成分为权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus poIymyxa菌株Gl或权利要求6所述的菌剂。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于:所述辣椒疫病为由辣椒疫霉Phytophthora capsici 弓I起； 所述抗菌为抗如下6种病原菌中的至少一种:杨树腐烂病菌Valsa sordida、灰霉病菌 Botrytis cinerea、板栗疫病菌 Cryphonectria parasitica、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani Kiihn 和辣椒疫霉 Phytophthoracapsici ο
9.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌PaenibacilluspoIymyxa菌株Gl或权利要求6所述的菌剂在防治辣椒疫病或抗菌中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述辣椒疫病为由辣椒疫霉Phytophthora capsici 弓I起； 所述抗菌为抗如下6种病原菌中的至少一种:杨树腐烂病菌Valsa sordida、灰霉病菌 Botrytis cinerea、板栗疫病菌 Cryphonectria parasitica、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani Kiihn 和辣椒疫霉 Phytophthoracapsici ο
全文摘要
本发明公开了一种防治辣椒疫病的生防菌株G1及其应用。本发明提供了多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株G1，其保藏号为CGMCC No.6762。本发明还提供了一种制备G1菌剂的方法，包括如下步骤发酵上述的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株G1，收集发酵产物，即得到G1菌剂。本发明的实验证明，本发明针对目前辣椒疫病没有较高防效的生防制剂现状，提供开发一种防治辣椒疫病的单一细菌及其制剂，专用于辣椒疫病的防治，该细菌菌剂对这种重要的土传病害有较高的防治效果，温室辣椒疫病的防治效果达71.18%。
文档编号A01N63/00GK103173386SQ20131007928
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者高克祥, 刘晓光, 赵影, 何邦令, 王庆华, 张修国 申请人:山东农业大学