专利名称：一种抑制木质素合成的植物rna干扰载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制木质素合成的植物干扰载体的构建及其在培育低木质素含量植物中的应用。
背景技术：
木质素是植物体内一类重要的大分子酚类聚合物，其数量巨大，在自然界中的含量仅次于纤维素，居有机多聚物的第二位，通常占植物体干重的10%左右，在树木甚至可以达到30%。木质素在陆生植物的生长发育中起着及其重要的作用。然而，牧草中木质素过量的沉积却影响牲畜对牧草 中营养成分的吸收；工业用植物中的木质素也加大了利用植物纤维的成本。因此，在畜牧生产和植物纤维利用工业中一直希望获得木质素含量低的新植物品系，从而改善牧草的营养特性或是降低工业生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，该干扰载体含有部分紫花苜蓿(咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶)基因序列。CCoAOMT是木质素合成关键酶之一，编码CCoAOMT的基因为CCoAOMT基因。本发明的另一个目的是提供一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体的制备方法。本发明的另一个目的是提供一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体在培育低木质素含量植物中应用，为培育低木质素含量牧草等提供良好素材。本发明的另一个目的是提供一种将构建的干扰载体转入植物细胞的方法，利用该方法，将该干扰载体转入植物细胞，经培养获得生长正常的低木质素含量植株。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施:一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，所述的植物RNA干扰载体是:将序列表SEQ ID N0.1所示的核酸序列作为正向核酸片段和序列表SEQ ID N0.2所示的核酸序列作为反向核酸片段插入植物表达载体PFGC5941中。序列表所示的核酸序列为插入了酶切位点的紫花苜蓿片段。上述的抑制木质素合成的植物RNA干扰载体的构建方法，包括以下步骤:
1)紫花苜蓿总RNA的提取
2)反转录获得紫花苜蓿cDNA；
3)带有相应酶切位点的，分别作为正向核酸片段和反向核酸片段的紫花苜蓿CCoAOMT核酸序列的PCR扩增；
4)PCR扩增的正向核酸片段和反向核酸片段经过切胶回收，分别连接到T载体上；
5)双酶切连接到T载体上的正向核酸片段和植物表达载体pFGC5941，电泳回收目的片段，T4连接酶连接，获得中间载体pFGC5941-CCoAOMT I ；
6)双酶切连接到T载体上的反向核酸片段和pFGC5941-CCoA0MTl，电泳回收目的片段，T4连接酶连接，获得植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi。将植物RNA干扰载体——pFGC5941-CCoAOMTi质粒转入根癌农杆菌中，获得重组根癌农杆菌。上述的植物RNA干扰载体在培育低木质素含量植物中的应用，其方法如下:
I)转导过程采用叶盘法
取植物(如烟草或其它植物)健壮叶片，剪成0.5 cm 2左右的叶盘，在分化培养基中预培养2d后，放入上述的含有植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi的重组根癌农杆菌中浸泡lOmin，取出后接种到分化培养基中，暗培养2d。转入筛选分化培养基，进行卡那霉素抗性筛选及不定芽的诱导。将诱导的不定芽从基部切下，转至生根培养基中生根。当根系发育完全，根长1.5 2.0cm时，移栽再生苗，获得转基因植株。2)转基因植株的PCR检测
提取转基因材料基因组DNA，以基因组DNA为模板，35S启动子加序列表SEQ ID N0.1所示的正向基因片段为检测目标，进行PCR反应；PCR产物测序、比对。通过该方法筛选阳性转基因植株。上游引物:5’一 GCACGACACTCTGGTCTACTC—3，
下游引物:5’ — TTAITTAATGGGCTAAAAATGGTT— 3’。3)生长正常的低木质素含量植株的获得
转基因植株木质素含量的测定:通过经典的Klason法测定样本木质素的含量。筛选木质素含量较野生型降低10%以上的材料继续培养。转基因植株生理生化指标的测定:筛选木质素含量较野生型降低10%以上的转基因植株继续培养，以外观、株高、单株重为指标，比较转基因与野生型材料在生长势方面的差异，以生长势与野生型无显著差异的转基因植株为最终获得的生长正常的低木质素含量植株。本发明的有益效果是:本发明采用来源于紫花苜蓿(咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶)的部分基因序列，构建了一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，采用农杆菌介导法将该干扰载体转入植物细胞，经培养获得生长正常的低木质素含量植物，为培育低木质素含量的牧草、造纸材料等提供种质资源。
图1是双酶切验证干扰载体正向核酸片段；
Ml =Marker (2000bp) ；M2 =Marker (15000bp) ;1 6 ;重组载体酶切产物。图2是双酶切验证干扰载体反向核酸片段；
Ml =Marker (15000bp) ；M2 =Marker (2000bp) ;1 3 ;重组载体酶切产物。图3是转化植株(烟草)的PCR检测(2000bp Marker)；
M =Marker (2000bp) ;1 5 ;有目标片段，为阳性植株；6:无目标片段，为野生型植株；7:重组质粒:8:水。
具体实施方式
实施例1:紫花苜蓿CTo撕基因片段的克隆1.紫花苜蓿总RNA的提取
(1)取幼嫩的紫花苜猜组织IOOmg,加入液氮研磨；向研钵中加入ImLRNAiso Plus,室温静置至样品完全融化，继续研磨至裂解液呈透明状；
(2)将匀浆转移至离心管中；12000r/min，4°C，离心5min;取上清移入新的离心管中；
(3)向上清液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5体积量)，震荡15s，待溶液充分乳化后，再室温静置5min ；
(4)12000 r/min，4°C，离心15min ;吸取上清液转移至另一新的离心管中；
(5)向上清中加入等体积的异丙醇，充分混匀后，室温静置IOmin；
(6)12000 r/min,4°C,离心 IOmin ;弃上清，缓慢加入 75% 的乙醇 ImL ； 12000 r/min,4°C，离心5min后弃乙醇；
(7)室温干燥沉淀2 5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于_80°C保存，得RNA模板。2.经过反转录获得紫花苜蓿cDNA
(I)紫花苜蓿cDNA第一链的合成。将获得的RNA模板(3 μ I)、Primer Mix (2 μ I)、dNTP Mix (4 μ I)和 RNase-Free Water (4 μ I)配置反应体系，70°C孵育 lOmin，迅速冰浴2min。短暂离心。继续向以上反应液中加入5XRT Buff (4μ 1),0.1M DTT (2μ I), 42°C孵育 2min;加入 Ιμ HiF1-MMLV (200U/μ I )，42°C孵育 50min。70°C 孵育 15min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。(2)紫花苜蓿cDNA合成。上述反应产物作为模板，进行PCR反应，获得紫花苜蓿cDNA序列。3.带有相应酶切位点的紫花苜蓿基因部分片段的扩增 以紫花苜蓿cDNA为模板，扩增CCoAOMT基因片段。扩增正向核酸片段，上游引物5’ -GGCGCGCCACGGAGAAGGAAAGCAAA-3,
下游引物 5’ -AITTAAATGCGGAGGGGCGCGTCGGG-3’。扩增反向核酸片段，上游引物5’ -TCCCCCGGGACGGAGAAGGAAAGCAAA-3’，
下游引物 5’ -GCTCTAGAGCGGAGGGGCGCGTCGGG-3’。PCR扩增，经测序得到如序列表SEQ ID N0.1所示的正向核酸片段和如序列表SEQID N0.2所示的反向核酸片段。实施例2:抑制木质素合成的植物RNA干扰载体的制备
将实施例1获得的带有相应酶切位点的正向核酸片段和反向核酸片段分别连接到PMD19-T载体上；用Asc I和Swa I双酶切连接到pMD19_T载体上的正向核酸片段和植物表达载体PFGC5941，回收目的片段，T4连接酶连接，获得中间载体pFGC5941-CCoA0MTl ;用Xba I和5)胳I双酶切含有反向核酸片段的pMD19-T载体和中间载体pFGC5941_CCoA0MTl，回收目的片段，T4连接酶连接，构建成抑制木质素合成的植物RNA干扰载体PFGC5941-CCoAOMTi ο双酶切载体pFGC5941_CCoA0MTi进行鉴定，结果如图1和图2所示，获得2个片段，大小与设计一致。以干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi为模板，35S启动子加正向基因片段为检测目标，进行PCR反应；PCR产物送上海生工测序，测序正确。
实施例3:植物RNA干扰载体转化根癌农杆菌。1.农杆菌感受态细胞的制备
挑取根癌农杆菌单菌落接种于3ml LB液体培养基中；220 r/min，28°C，振荡培养至OD600 =0.5 ;吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴IOmin ；5000 r/min,离心30s,弃去上清液,沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮，冰浴20min ；5000 r/min,离心30s,弃去上清液；每管用100 μ I 20mM CaCl2悬浮，用于转化。2.质粒直接转化农杆菌
50 μ I农杆菌感受态细胞中加入质粒pFGC5941-CCoAOMTi IOul，冰浴30 min ;放入液氮中lmin，然后立即放入37°C水浴锅中水浴5min ;取出离心管，加入0.5mlLB，28°C、220 r/min振荡培养4h ;取出菌液于含卡那霉素的LB平板上涂板，在培养箱中28°C条件下倒置培养。2天左右菌落可见，得到重组根癌农杆菌。3.重组根癌农杆菌鉴定
小量提取质粒DNA，PCR鉴定，重组根癌农杆菌中含有质粒pFGC5941-CCoAOMT i。实施例4:植物RNA干 扰载体转化烟草植物
1.转导(采用叶盘法)
取烟草健壮叶片，剪成0.5 cm 2左右的叶盘，叶腹面向下置于分化培养基上，温度260C 土 1°C，光照16h/d，培养2d。将叶片放入已经培养至OD6tltl (0.5-0.6)的重组根癌农杆菌菌液中浸泡lOmin，用无菌滤纸吸去多余菌液，叶腹面向下接种到分化培养基中，温度260C 土1°C，暗培养2d。转入含卡那霉素的筛选分化培养基，进行抗性筛选及不定芽的诱导，培养温度26°C ±1°C，光照16h/d。培养7d左右，叶片上发生愈伤组织；继续培养IOd左右，愈伤组织上分化出不定芽。当不定芽长至1.5cm高时，将其从基部切下，与叶盘分开，转至生根培养基，培养温度26°C ±1°C，光照16h/d。培养IOd左右，不定根发生，当根系发育完全，根长1.5 2.0cm时，将再生植株移栽至装有营养土的盆中培养，常规管理。经上述操作获得转基因烟草植株。2.转基因烟草植株的PCR检测
按植物基因组DNA提取试剂盒操作，提取转基因烟草基因组DNA，以基因组DNA为模板，35S启动子加正向基因片段为克隆目标，进行PCR反应；PCR产物测序、比对。通过该方法筛选阳性转基因植株。上游引物:5’一 GCACGACACTCTGGTCTACTC— 3，
下游引物:5’ — TTAITTAATGGGCTAAAAATGGTT— 3’
通过PCR筛选阳性转基因植株。如图3所示，经检测，再生植株中含有目标片段。收集目标片段，送交上海生工测序，测序结果与原设计相符，判断为阳性植株。实施例5:生长正常的低木质素含量植株的获得。1.转基因烟草植株木质素含量的测定
取在营养土中培养的转基因和野生型烟草叶片烘干至恒重，取IOOmg作为样本，通过经典的Klason法测定样本木质素的含量。经检测，转基因烟草植株中木质素含量较野生型平均降低10%以上。Klason法:样品液氮研磨后,精确称取烘至恒重后的样品100 mg,加入12.5ml 72% H2SO4, 30°C消化lh，将消化后的混合液用无菌水稀释到4 %，120°C第2次消化lh，将热溶液通过烘干至恒重的砂心漏斗(W1)过滤，并用热水冲洗3次，残渣和漏斗一起放入烘箱中，60°C烘至恒重(W2),并按下式计算木质素含量值。每个样品木质素含量重复测定3次，取平均值。木质素含量(mg/IOOmg)=W2 - W1。2.转基因植株生理生化指标的测定
以外观、株高、单株重为指标，比较转基因与野生型材料在生长势方面的差异，以生长势与野生型无显著差异 的转基因材料为最终获得的生长正常的低木质素含量植株。<110>辽宁大学
〈120〉一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体及其构建方法和应用 〈160〉 2
〈210〉 I〈211〉 684〈212〉 DNA
〈213〉紫花苜蓿CCoAOMT核酸片段(作为正向核酸片段)
〈400〉 I
GCTATTAGTAGGGCATTCGCGCATCCTGCGAAGAATCTTGGGTATACTTCTCCATATTATTTCTTTATAAAC
AATGATTCCCCCCGGACTCTCTTTCTGTCCGGAGTCTTAAAGAATGAATTCTATTGAGTTGTGGTTGTTGACCAACA
AATTATGCATGGGAGAAAGATTCACAAAGGAAAACTAACCTTGATCCAGAAAGAAAGGGGCCCCTTCATCGCATCGG
GTTGGGTTGGCCCATCAGAATTTGTGCATTGCATCCTACCTAATTCGTTAGCGCTTTTTCTTTTAAGAATGCATCTG
GTTCTATCTTTCTTTCGCCAGTTAGTCCACCTTTTAGTGATTCTAGTAATTCTGGTTTGATAGTGCTTAGAATGTCT
CTTTCATATTGAGCAATTTTGTCTAATGGCATTCGATCACAGAATCCATTGACAGCTGCATAAATTACTAGAATTTG
TTTTTCAATTGGAAGTGGTGCATATTGTGGTTGTTTTAGTACTTCTGTAAGCCTTGCACCTCTATTGAGTAATGCCT
GAGTCGCAGCATCAAG GTCTGAGCCAAATTGAGCAAAGGCGGCCACTTCGCGATATTGTGCCAATTCAAGTTTTAAA
CTACCGCAGACTTGTTTCATAGCTTTCAACTGAGCGGCAGACCCGACGCGCCTCTCGCATTTTTTATATATAA
〈210〉 2〈211〉 686〈212〉 DNA
〈213〉紫花苜蓿核酸片段(作为反向核酸片段)
〈400〉 2
CCTTGCCGGCTAGCTGAGCTATGAACAGTCTGCGGTAGTTTAAAACTTGAATTGGCACAATATCGCGAAGTGGCCGCCTTTGCTCAATTTGGCTCAGACCTTGATGCTGCGACTCAGGCATTACTCAATAGAGGTGCAAGGCTTACAGAAGTACTAAAACAACCACAATATGCACCACTTCCAATTGAAAAACAAATTCTAGTAATTTATGCAGCTGTCAATGGATTCTGTGATCGAATGCCATTAGACAAAATTGCTCAATATGAAAGAGACATTCTAAGCACTATCAA ACCAGAATTACTAGAATCACTAAAAGGTGGACTAACTGGCGAAAGAAAGATAGAACCAGATGCATTCTTAAAAGAAAAAGCGCTAACGAATTAGGTAGGATGCAATGCACAAATTCTGATGGGCCAACCCAACCCGATGCGATGAAGGGGCCCCTTTCTTTCTGGATCAAGGTTAGTTTTCCTTTGTGAATCTTTCTCCCATGCATAATTTGTTGGTCAACAACCACAACTCAATAGAATTCATTCTTTAAGACTCCGGACAGAAAGAGAGTCCGGGGGGAATCATTGTTTATAAAGAAATAATATGGAGAAGTATACCCAAGATTTTCTTCGCAGGATGCGCGAATTTGCCCTACTAATTATCCTTTGCTTTCCTTCTCCGCCCCGGGGGGAAGG
权利要求
1.一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，其特征在于所述的植物RNA干扰载体是:将序列表SEQ ID N0.1所示的紫花苜蓿部分核酸序列作为正向核酸片段和序列表SEQ ID N0.2所示的紫花苜蓿沈bD#部分核酸序列作为反向核酸片段，插入植物表达载体PFGC5941 中。
2.权利要求1所述的抑制木质素合成的植物RNA干扰载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤: O紫花苜蓿总RNA的提取； 2)反转录获得紫花苜蓿cDNA； 3)带有相应酶切位点的，分别作为正向核酸片段和反向核酸片段的紫花苜蓿CCoAOMT核酸序列的PCR扩增； 4)PCR扩增的正向核酸片段和反向核酸片段经过切胶回收，分别连接到T载体上； 5)双酶切连接到T载体上的正向核酸片段和植物表达载体PFGC5941，电泳回收目的片段，T4连接酶连接，获得中间载体pFGC5941-CCoAOMTI ； 6)双酶切连接到T载体上的反向核酸片段和pFGC5941-CCoAOMTI，电泳回收目的片段，T4连接酶连接，获得植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi。
3.一种重组根癌农杆菌，其特征在于将植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi转化根癌农杆菌，获得重组根癌农杆菌。
4.权利要求1所述的植物RNA干扰载体在培育低木质素含量植物中的应用，其特征在于方法如下: 1)采用叶盘法用含有植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi的重组根癌农杆菌转化植物叶片； 2)叶片经培养获得再生植株； 3)将再生植株移栽至装有营养土的盆中获得转基因植株。
全文摘要
本发明涉及一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体及其构建方法和应用。所述的植物RNA干扰载体是将序列表SEQIDNO.1所示的紫花苜蓿CCoAOMT部分核酸序列(作为正向核酸片段)和序列表SEQIDNO.2所示的紫花苜蓿CCoAOMT部分核酸序列(作为反向核酸片段)插入植物表达载体pFGC5941中，构建成植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi。用获得的干扰载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，获得了含干扰载体的农杆菌工程菌。利用含干扰载体的农杆菌工程菌转化植物，培育低木质素含量植物，利用该方法，获得了生长正常、木质素含量降低的转基因植物，为培育低木质素牧草、造纸植物等提供种质资源。
文档编号A01H4/00GK103146745SQ20131007941
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者韩阳, 王红艳, 段亚楠, 卢福荣, 茹艺, 李曹娜 申请人:辽宁大学