专利名称：一株用于防治柑桔溃疡病的枯草芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病害生物控制技术领域，特别是涉及一株用于防治柑桔溃疡病的枯草芽孢杆菌CCCQ080菌株。
背景技术：
柑桔是世界第一大水果，在巴西、中国、美国等138个国家(地区)都有种植，总面积约800万hm2，总产量1.2亿余吨。中国是柑桔最重要的原产中心，目前柑桔栽培面积约190万hm2,年产量约2千万吨,分别居世界第一位和第二位。柑桔溃瘍病(citrus canker)是由地毪草黄单胞杆菌柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cirri)引起的柑桔毁灭性病害，为国内外重大检疫对象，主要侵染芸香科柑桔属、枳属及金柑属植物。该病害主要分布在亚洲、非洲及美洲的30多个国家，约占生产柑桔国家和地区的三分之一，其中以亚洲发生最为普遍。柑桔溃疡病对我国柑桔产业也产生了重大影响，该病害在广东、广西、福建、浙江、海南等沿海地区一直普遍发生。江西省种植面积约15万hm2，柑桔溃疡病发生面积约2.5万hm2 ;湖南省柑桔种植面积28万余hm2，柑桔溃疡病发生面积I万余hm2 ;贵州省柑桔溃疡病发生面积超过3千hm2。目前对柑桔溃疡病的控制仍然以化学药剂为主，从而导致病原菌抗药性增强、环境污染等严重后果，最终出现防治效果不好、危害生态安全和人类健康等问题。随着科学研究的进一步深入开展，发现在克服植物病害的抗药性、减少化学杀菌剂对环境的污染、生态的破坏及农副产品中化学农药的残留方面，生防微生物具有独特的优势，利用生防菌的次生代谢产物制备的生物农药，具有无污染、无残留、不易使有害生物产生抗药性、与环境相容性高、对人畜安全等特点，已成为无公害绿色农药的主体和未来农药的发展方向。因此，大力开展生物防治研究是农业可持续发展的重要途径，具有重要的生产实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于防治柑桔溃疡病的枯草芽孢杆菌，该菌株对柑桔溃疡病有较强的控制效果。根据菌株菌落培养性状、形态特征和生理生化性状及16S rDNA序列比对分析，初步确定菌株CCCQ080为枯草芽孢杆菌，并对它进行了抑菌谱测定，表明其对多种病原菌有很好的抑菌作用，抗菌谱广。CCCQ080菌株的筛选:从重庆市土壤和健康植株叶片，分离获得多个菌株，经初筛和复筛，最后经过温室控病防效测试，确定对柑桔溃疡病有较好防治作用的为CCCQ080菌株。CCCQ 080菌株的形态鉴定:革兰氏阳性菌(图2)，周生鞭毛(图1)，产生芽孢(图3)。CCCQ080菌株的生理生化反应:在7%的NaCl中生长，pH= 10生长，L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖均产酸，V.P阳性，酪朊水解，吲哚反应为阳性，还原硝酸盐成亚硝酸盐，好氧，产生硫化氢等。根据分类资料将该病原菌初步鉴定为枯草芽孢杆菌。分子生物学鉴定:通过提取CCCQ080基因组DNA和16S rDNA PCR扩增，CCCQ080扩增出的16S rDNA片段长度为1470bp (图4)，CCCQ080与芽孢杆菌属(feci77心sp.)在遗传上接近，结合培养特性、形态特征、革兰氏染色及生理生化试验结果，将菌株CCCQ080确定为枯草芽孢杆菌iBacillus subtilis、。该菌种的活体纯培养已于2012年06月15日保藏于‘中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心’(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码 100101，电话:010-64807355)，保藏号=CGMCC N0.6224。CCCQ080菌株代谢产物分析:CCCQ080不能分解含几丁质成分培养基，表明产物中无几丁质酶(图5) ;CCCQ080在纤维素平板上产生了黄色透明圈，说明其代谢产物中均含有纤维素酶，能分解纤维素(图6);CCCQ080在牛乳蛋白培养基上产生明显的透明圈，表明产物中含蛋白酶(图7);嗜铁素的检测结果显示，在平板上产生了黄色透明圈，表明CCCQ080有螯合Fe3+离子的能力(图8)。CCCQ080 菌株抑菌谱测定:CCCQ080菌株对病原细菌柑桔溃疡病菌(图9)、烟草青枯病菌和烟草角斑病菌表现出较强的抑菌作用，抑菌圈在5.6^15.6mm之间。对烟草灰霉病菌、苹果腐烂病菌和烟草根黑腐病菌等21种植物病原真菌均有一定的抑菌效果，抑菌带宽度在5 22mm之间。CCCQ080菌株控病效果:CCCQ080对柑桔溃疡病有很好的控病作用，温室离体叶片控病表明，菌株发酵液预防喷施24h后再喷雾接种溃疡病菌，可完全抑制病害发生(图10)。温室植株控病表明，菌株发酵液预防喷施24h后再针刺接种溃疡病菌，预防效果可达43.26-61.24%，表现出较好的控制效果。CCCQ080菌株对柑桔溃疡病菌生物膜损伤效果:CCCQ080菌株发酵液上清液处理病菌，可以使其菌液电导率和还原糖含量增加，即表明其发酵液处理可以使溃疡病菌细胞破损，原生质渗漏。本发明的优点
从植株叶片表面分离获得的枯草芽孢杆菌CCCQ080菌株，是首次发现并鉴定的一个新菌株，其本身在平板上对柑桔溃疡病等多种植物病原菌有很强的抑制作用，其发酵液对柑桔溃疡病有很好的防控效果。因为该菌株是从植株表面分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留，因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
图1为菌株CCCQ080周生鞭毛 图2为菌株CCCQ080革兰氏染色 图3为菌株CCCQ080芽孢染色
图4为CCCQ080菌株的16S rDNA碱基片段序列 图5为菌株CCCQ080几丁质酶活性检测 图6为菌株CCCQ080纤维素酶活性检测 图7为菌株CCCQ080蛋白质酶活性检测图8为菌株CCCQ080嗜铁素活性检测
图9为菌株CCCQ080对柑桔溃疡病菌的抑制作用
图10为菌株CCCQ080对柑桔溃疡病的离体叶片控制作用
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述 实施例1.枯草芽孢杆菌CCCQ080菌株的鉴定
(1)形态学观察与鉴定:将菌株CCCQ080在NA培养平板上于28°C下培养l_3d，观察其菌落形态(形状、颜色光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘形状等);
(2)生理生化反应观察:将菌株CCCQ080接种于温度、酸碱度、耐盐性、糖醇发酵、柠檬酸盐利用、氮素化合物利用、淀粉等大分子化合物分解和产酶等测试培养基中，观察反应情况；
(3)分子生物学鉴定:提取菌株的基因组DNA，以细菌通用引物fDl:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’，rPl:5’ -ACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3’，以菌株 CCCQ080的基因组DNA为模板，PCR扩增后经电泳检测，测序；利用NCBI网站上的Blast软件和BioEdit软件进行序列同源性分析,采用Mega 4.0软件的邻近法(Neighbor -Joining)构建系统发育进化树，由此确证CCCQ080的种级分类阶元名称。确定该菌的分类地位。实施例2.枯草芽孢杆菌CCCQ080菌株控病效果
2.1 CCCQ080菌株抑菌效果:将菌株点接种在NA平板中，28°C恒温培养2天后，再用猴头喷雾器将3乂108(^11/1^的柑桔溃疡病菌悬液喷于平板上(约100 μ L/皿)，重复3次。28°C恒温条件下培养3天后，测量抑菌圈的直径。确定CCCQ080菌株对柑桔溃疡病的抑制效果。2.2 CCCQ080菌株控病效果
离体叶片法:取健康的甜橙类柑橘叶片若干，用蒸馏水将其表面洗净，晾干。75%乙醇溶液浸泡30 s,然后用无菌水洗净,晾干。将叶片随机均匀分成A、B、C和D 4个处理。A处理叶面只喷洒灭菌水，B只喷洒拮抗菌的发酵液，C处理叶面先喷洒拮抗菌的发酵液后喷洒柑橘溃疡病菌菌悬液，D处理叶面只喷洒溃疡病菌的菌悬液。喷雾处理后装入灭菌的密封的托盘内，26°C保湿培养。每处理3次重复。7天后观察。确定CCCQ080菌株对柑桔溃疡病的离体叶片上控制效果。活体植株法:选取合适的甜橙植株，喷施拮抗菌I天后针刺接种柑橘溃疡病菌，以无菌水代替拮抗菌处理和只接种溃疡病菌为对照。每处理5片叶，3次重复，每片叶片在主脉的两侧对称针刺接种6个点。再将样品置于26°C 28°C，相对湿度80%的智能人工气候箱中培养25天后观察。确定CCCQ080菌株对柑桔溃疡病的温室植株上控制效果。实施例3.CCCQ080菌株代谢产物分析
3.1几丁质酶活性检测
唯一碳源培养基(Ch1-Ayers):磷酸二氢铵1.0g、硫酸镁0.2g、氯化钾0.2g、琼脂20g、l%胶体状几丁质定容至lOOOmL，pH -J.0。胶体状几丁质的制备:20g甲壳素溶于350mL浓盐酸，在4°C放置24h，经玻璃棉过滤，滤液加入_20°C过夜的冰无水 乙醇2L，10000 r/min离心20min，自来水冲洗沉淀至中性pH，冷冻干燥，_20°C密封保存。使用胶体状几丁质时，用手动匀浆器研磨5次以上。将拮抗菌接在上述培养基制成的平板上，28°C培养7-10天，观察透明圈有无及测量透明圈的大小，如有透明圈则表明菌株产生了几丁质酶。以此确定CCCQ080产几丁质酶情况。3.2纤维素酶检测
纤维素刚果红培养基:磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、羧甲基纤维素钠1.88 g/L、明胶 2.0g/L、刚果红 0.2g/L、琼脂 20g/L, pH:7.0
把待测菌接到上述培养基上，28°C培养7-10天后，用刚果红(lg/mL)染色lh，倒掉刚果红染液后，再用氯化钠(IM)浸泡lh，观察透明圈的有无，如有透明圈则表明菌株产生了纤维素酶。以此确定CCCQ080产纤维素酶情况。3.3蛋白酶的检测
蛋白培养基:脱脂奶粉40g，琼脂16g，定容至400mL。将待测菌接种于上述蛋白培养基上，25°C培养:T5天，观察菌落周围有无透明圈。如有透明圈则表明菌株产生了蛋白酶。以此确定CCCQ080产几丁质酶情况。3.4嗜铁素的检测
嗜铁素培养基:A:a.60.5mg铬天青S溶于50mL去离子水；b.1OmL三价铁溶液(ImM六水三氯化铁、IOmM盐酸为溶剂)；c.72.9mg溴化十六碳烧基三甲铵溶于40mL去离子水。上述a、b、c三种溶液混合后定容至IOOmL,调pH至中性，121°C灭菌20min。B =IOOOmL NA培养液，用NaOH溶液将培养液pH调至6.8，121 °C灭菌20min。灭菌结束后混合A，B液后制成平板，接种待测菌，28°C培养7-10天观察颜色变化，如有晕圈则表明菌株产生了嗜铁素。以此确定CCCQ080产嗜铁素情况。实施例4.CCCQ080菌株对柑桔溃疡病菌生物膜损伤效果
4.1将菌株CCCQ080进行发酵培养，然后离心并过滤，取上清液稀释0倍(原液)、2倍、5倍、10倍和20倍，取各处理ImL分别加入到20mL NB培养液中，再加入浓度为3 X IO8Cfu/mL柑橘溃疡病菌菌悬液400uL。另设置一组未加柑桔溃疡病菌处理作为平行对照，以NB液加ImL无菌去离子水作为空白对照。每处理3次重复。然后分别在0h、12h、24h和36h测定溶液电导率。4.2将菌株CCCQ080分别进行发酵培养48h，然后离心并过滤，取上清液稀释0倍(原液)、2倍、5倍、10倍和20倍，取各处理ImL分别加入到20mL NB培养液中，以加ImL无菌水作为空白对照，再加入浓度为3 X 108Cfu/mL柑橘溃疡病菌菌悬液400uL。发酵培养48h后离心并过滤,取上清液测定还原糖含量。每处理3次重复。以此测定CCCQ080 菌株对柑桔溃疡病菌生物膜损伤作用。
权利要求
1.一株用于防治柑桔溃瘍病的枯草芽孢杆菌)CCCQ080,其保藏号为 CGMCC N0.6224。`
全文摘要
一株对柑桔溃疡病具有较强生防活性的枯草芽孢杆菌株CCCQ080，属农业病害生物防治领域。此菌从自然环境寄主叶片上分离获得，根据形态特征和分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。该菌对柑桔溃疡病菌有很强的抑制作用，对柑桔溃疡病有很好的控制效果。同时，该菌株还具有广谱拮抗活性，对柑桔溃疡病菌和烟草角斑病菌等病原细菌表现出较强的抑菌作用，也对烟草灰霉病菌、苹果腐烂病菌和烟草根黑腐病菌等病原真菌有很好的抑菌效果。该菌株次生代谢产物中有纤维素酶，蛋白酶和嗜铁素等。其发酵滤液可破坏溃疡病菌的生物膜，经发酵菌体或次生代谢产物提取技术可生产环境友好型生物农药，具有重要的商业开发应用价值。
文档编号A01P1/00GK103173394SQ201310091068
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者马冠华, 肖崇刚, 董国菊, 陈国康 申请人:西南大学