桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种桦褐孔菌多糖作为凡纳滨对虾饲料添加剂的应用，桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加量为l-20g/kg鱼类基础饲料。本发明采用桦褐孔菌多糖加入鱼类饲料中，以代替抗生素药物和疫苗的使用，不会产生抗药性且使用成本低，能有效提高养殖鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力，拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为鱼类饲料的开发提供了新途径，促进了鱼类养殖业的可持续发展。
【专利说明】桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产养殖领域，特别涉及一种桦褐孔菌多糖作为海水和淡水养殖鱼类 饲料添加剂的应用。
【背景技术】
[0002] 海洋鱼类如石斑鱼、大黄鱼、大菱鲆(商品名多宝鱼)为具有高经济价值的鱼类。它 们的肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，售价较高，在国内外市场上久负盛名，供不应求。近年 来，随着鱼类的规模化和集约化养殖的迅速发展，细菌和病毒感染导致的养殖病害爆发越 来越频繁，病害一直是海洋鱼类养殖业发展的制约因素，为控制疾病的发生，化学药物和抗 生素等被大量使用，由此产生药物残留、水体正常微生物种群失调、耐药性微生物增加、养 殖动物内脏机能损伤等一系列不良后果，而且有时抗生素处理失败，其原因可能是每条鱼 的口服抗生素剂量不同以及耐药性导致的。疫苗虽然是有效的疾病预防替代物，但是疫苗 价格昂贵，而且是病原生物特异性的。因此，寻求抗生素药物和疫苗的替代品就显得尤为重 要。草鱼是我国著名的"四大家鱼"之一，是中国重要的养 殖经济鱼类。但是在养殖过程中容易感染疾病，而且病害日益严重，而目前还没有一个针对 草鱼疾病的疫苗被批准使用，为了预防疾病发生，研发有助草鱼抗病的天然免疫增强剂迫 在眉睫。
[0003] 样褐孔菌，又名白样鸾，学名 欧洲人称 之为"chaga"，是一种多孔菌科褐卧孔菌属食药用真菌。桦褐孔菌主要生长于白桦、银桦、榆 树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐 后的枯干上生存达6年之久。它主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、吉林长白山、日 本北海道等北纬45-50°极寒地区。桦褐孔菌子实体一般呈瘤状，直径约25-40 cm，外表坚 硬，有深的裂痕，较硬，干时脆，颜色呈黄褐色或更深。
[0004] 从16世纪以来，桦褐孔菌在俄罗斯、北欧一些国家被广泛用于恶性肿瘤、糖尿病、 心血管疾病、肝病和艾滋病等疾病的治疗。在俄罗斯，桦褐孔菌被广泛用作日常保健品。日 本的研究人员则称桦褐孔菌为一种"万能药"。在日本，桦褐孔菌的粉末状冲剂经常作为保 健茶来饮用。1955年莫斯科医科院（The Medical Academy of Science in Moscow)宣布 将桦褐孔菌列为抗癌物质，政府批准桦褐孔菌可用于医药品开发。美国把桦褐孔菌列入"特 殊的天然物质"。
[0005] 桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌的重要药理活性成分之一，桦褐孔菌多糖是一种新型的 真菌多糖，具有免疫调节、抗氧化作用、抗炎症及抗病毒等优点，成为当前免疫增强剂的研 究热点。目前，桦褐孔菌多糖多应用于体外及小鼠的抗氧化、免疫功能的研究中，作用效果 显著。但桦褐孔菌多糖对于鱼类是否合适，是否可以成为抗生素药物和疫苗的替代品是个 未知数。如果桦褐孔菌多糖能够提高鱼类的免疫力和抗氧化能力，那么它在水产饲料添加 剂研究中具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用，采用桦褐 孔菌多糖加入鱼类饲料中，以代替抗生素药物和疫苗的使用，使用成本低，能有效提高养殖 鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力，拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为鱼类饲料的开 发提供了新途径。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用，桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添 加量为l-20g/kg鱼类基础饲料。
[0008] 本发明首次将桦褐孔菌多糖作为添加剂应用到鱼类饲料中，以代替抗生素药物和 疫苗的使用，不会产生抗药性且使用成本低，发现能显著提高鱼类的增重率、特定生长率和 成活率，显著降低饲料系数，并且显著提高鱼类血清溶菌酶、碱性磷酸酶和总抗氧化能力， 降低血清丙二醛含量。拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为鱼类饲料的开发提供了新途径。 本发明中，桦褐孔菌多糖的添加量低于lg/kg则无法明显起到提高鱼类的生长性能、免疫 力和抗氧化能力的效果；桦褐孔菌多糖的添加量高于20g/kg，则成本过高，且更进一步提 高鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力的效果微弱，不利于应用。
[0009] 本发明中的桦褐孔菌多糖可以是市售产品，优选本发明自己制备的桦褐孔菌多 糖。
[0010] 作为优选，桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加量为5-15g/kg鱼类基础饲料。 控制桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加量为5-15g/kg鱼类基础饲料，这样应用的效 果最佳。
[0011] 作为优选，所述桦褐孔菌多糖由以下工艺制备获得： (1)菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种。
[0012] (2)液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体 菌种。
[0013] (3)液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种 与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10,所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖 30-32g/L，木质纤维素 32-38g/L，蛋白胨 2-5g/L，KH2P04 l-2g/L，ZnS04.2H20 0.01-0. 02g/ L, K2HP04 0. 3-0. 5g/L, FeS04 · 7H20 0. 03-0. 07g/L, MgS04 · 7H20 0. 3-0. 6 g/L, CuS04 · 5H20 0· 01-0. 03 g/L，CoC12 0· 01 -0· 02g/L，MnS04 · H20 0· 06-0. 09 g/L，pH 值 6· 0-6· 5〇
[0014] 液体深层发酵培养基优化的配方为：葡萄糖30-32g/L，木质纤维素32-38g/L，蛋 白胨 3g/L，KH2P04 lg/L，ZnS04 · 2H20 0· 01g/L，Κ2ΗΡ04 0· 4g/L，FeS04 · 7H20 0.05 g/L, MgS04 · 7H20 0· 5 g/L，CuS04 · 5H20 0· 02 g/L，CoCl2 0· 01 g/L，MnS04 · H20 0· 08 g/L，pH 值 6.0。
[0015] 液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28°C，发酵罐空气流量0. 5-1. Ovvm，发 酵罐内部压力〇· 1-0.25 kg/cm3,搅拌转速70-150转/分钟，发酵周期12-14天。
[0016] (4)桦褐孔菌多糖提取：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖。
[0017] 作为优选，从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为：发酵产物过滤，得发酵 液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4°C下静 置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌多糖。
[0018] 作为优选，从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为： a、 发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体 积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4°C下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后得桦 褐孔菌胞外多糖； b、 将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馈水（lg菌丝体20-30ml蒸馈水）中，超声破壁， 121 土 1°C加热1. 5-2h，冷却后离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水（lg残渣20-30ml蒸馏 水)中，121 ± 1°C加热3-4h，冷却后离心收集上清液，合并上清液，浓缩至原体积的20%-30%， 加入4-6倍体积的95%-98%的乙醇，搅拌均匀后在0-4°C下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用 95%-98%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞内多糖； c、 将a步的桦褐孔菌胞外多糖和b步的桦褐孔菌胞内多糖混合均匀后即为桦褐孔菌多 糖。
[0019] 本发明自己制备的桦褐孔菌多糖，可以是从发酵液中提取的桦褐孔菌胞外多糖作 为桦褐孔菌多糖使用，更为优选是从发酵液中提取的桦褐孔菌胞外多糖和从菌丝体中提取 的桦褐孔菌胞内多糖的混合物作为桦褐孔菌多糖使用。桦褐孔菌胞外多糖和桦褐孔菌胞内 多糖的混合物组成的桦褐孔菌多糖，其中的杂多糖含量更丰富，活性物质更全面均衡，提高 鱼类的生长性能、免疫力和抗氧化能力的效果更显著。
[0020] 作为优选，所述木质纤维素选自农作物秸杆、木屑、花生壳、甘蔗渣中的一种。
[0021] 作为优选，所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6 ;斜面菌种培养基上培养的参数为：温度 27-28°C，培养 200-250 小时。
[0022] 作为优选，所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH2P04 0.1 g/100mL，MgS04 0.15 g/100mL，CaCl2 0.01 g/100mL ;液体菌种培养的参数为：温度27-28°C，培养3. 5-4. 5d，摇床转速80-140转/分 钟。
[0023] 作为优选，所述鱼类具体为大黄鱼、石斑鱼、大菱鲆或草鱼。
[0024] 作为优选，包括桦褐孔菌多糖和鱼类饲料基础饲料，桦褐孔菌多糖用量为每千克 鱼类饲料基础饲料中添加5_15g。
[0025] 本发明的有益效果是：采用桦褐孔菌多糖加入鱼类饲料中，以代替抗生素药物和 疫苗的使用，不会产生抗药性且使用成本低，能有效提高养殖鱼类的生长性能、免疫力和抗 氧化能力，拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为鱼类饲料的开发提供了新途径，促进了鱼类 养殖业的可持续发展。
[0026]
【具体实施方式】
[0027] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0028] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0029] 鱼类基础饲料为现有技术，可以是市售，也可以是现有文献中公开的配方。
[0030] 实施例1 : 称取大黄鱼crocea)基础饲料(配方见张春晓等，饲料中添加肽聚糖 对大黄鱼生长和非特异性免疫力的影响，水产学报，2008,32 (3)) 100kg，加入100g桦褐孔 菌多糖(市售，浙江方格药业有限公司）或本发明自己制备的桦褐孔菌多糖，混合均匀后，然 后加水揉匀，用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2. 5mmX 8. 0mm的颗粒状饲料，并在40°C 烘干至饲料水分含量为10 %左右。
[0031] 本发明自己制备的桦褐孔菌多糖的制备方法如下： (1)菌种活化：以桦褐孔菌(市售，购自徐州师范大学）为菌种，划线接种至斜面菌种 培养基上27°C，培养250小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 8/1001^，蛋白胨4 8/1001^，琼脂10 8/1001^，？!1值为5.4-5.6。
[0032] (2)液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基27°C，摇床上培养4. 5d至对 数期得液体菌种，摇床转速80转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖5g/100mL，蛋 白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH2P04 0.1 g/100mL，MgS04 0.15 g/100mL，CaCl2 0.01 g/100mL。
[0033] (3)液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培 养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8,液体深层发酵的工艺参数为：发酵 温度27°C，发酵罐空气流量0. 5vvm，发酵罐内部压力0. 1 kg/cm3,搅拌转速70转/分钟， 发酵周期14天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30g/L，玉米秸杆32g/L，蛋白 胨 2g/L，KH2P04 lg/L，ZnS04 · 2H20 0· 01g/L，Κ2ΗΡ04 0· 3g/L，FeS04 · 7H20 0.03 g/L, MgS04 · 7H20 0· 3 g/L，CuS04 · 5H20 0· 01 g/L，CoCl2 0· 01 g/L，MnS04 · H20 0· 06 g/L，pH 值6. 0 ;发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。
[0034] (4)桦褐孔菌多糖提取：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%，加 入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0°C下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥 后即得桦褐孔菌多糖。
[0035] 实验数据 以大黄鱼基础饲料为空白对照饲料，在每千克大黄鱼基础饲料中添加 lg桦褐孔菌多 糖作为试验组的饲料。
[0036] 大黄鱼放于海水网箱中暂养，并以基础饲料饱食投喂，使之逐渐适应实验饲料。暂 养2周后，选出体格健壮、规格一致（平均体质量150g的大黄鱼）进行分组实验，每组3个 重复，每个重复25尾，每天投喂2次（05 :00和17 :30)，达饱足。实验期间海水水温为23? 27°C，盐度为29?33,溶解氧含量在7 mg/1以上。养殖周期为8周。
[0037] 饲养试验结束时，分别从每网箱随机抽取6尾试验鱼，以丁香酚麻醉，用无菌注射 器从尾静脉取血，将其血液混合，置于灭菌的EP管中作为1个样品组。一部分抗凝全血处 理后用于大黄鱼白细胞吞噬活力的分析；另一部分不加抗凝剂的全血置于4°C冰箱中静置 4 h，待其凝血后于4°C离心，分离血清和血细胞，备用于后续免疫指标分析。结果见表1。
[0038] 表1桦褐孔菌多糖对大黄鱼血清抗菌活力和非特异性免疫活性的影响
【权利要求】
1. 一种桦褐孔菌多糖作为鱼类饲料添加剂的应用，其特征在于：桦褐孔菌多糖在鱼类 基础饲料中的添加量为l-20g/kg鱼类基础饲料。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：桦褐孔菌多糖在鱼类基础饲料中的添加 量为5-15g/kg鱼类基础饲料。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述桦褐孔菌多糖由以下工艺制备 获得： (1) 菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种； (2) 液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌 种； (3) 液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体 深层发酵培养基的体积比为1:8-10,所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30-32g/ L，木质纤维素 32-38g/L，蛋白胨 2-5g/L，KH2P04 l-2g/L，ZnS04 · 2H20 0· 01-0. 02g/L， K2HP04 0· 3-0. 5g/L，FeS04 · 7H20 0· 03-0. 07g/L，MgS04 · 7H20 0· 3-0. 6 g/L，CuS04 · 5H20 0· 01-0. 03 g/L，CoC12 0· 01 -0· 02g/L，MnS04 · H20 0· 06-0. 09 g/L，pH 值 6. 0-6. 5 ; 液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28°C，发酵罐空气流量0. 5-1. Ovvm，发酵罐 内部压力〇· 1-0. 25 kg/cm3,搅拌转速70-150转/分钟，发酵周期12-14天； (4) 桦褐孔菌多糖提取：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体 步骤为：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的无水 乙醇，搅拌均匀后在0-4°C下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌 多糖。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体 步骤为： a、 发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体 积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4°C下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后得桦 褐孔菌胞外多糖； b、 将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馏水中，超声破壁，121 ± 1 °C加热1. 5-2h，冷却后 离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水中，121 ± 1°C加热3-4h，冷却后离心收集上清液，合并 上清液，浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的95%-98%的乙醇，搅拌均匀后在0-4°C 下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用95%-98%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞 内多糖； c、 将a步的桦褐孔菌胞外多糖和b步的桦褐孔菌胞内多糖混合均匀后即为桦褐孔菌多 糖。
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述木质纤维素选自农作物秸杆、木屑、 花生壳、甘蔗渣中的一种。
7. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏 40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5. 4-5. 6;斜面菌种培养基上培养 的参数为：温度27-28°C，培养200-250小时。
8. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH2P04 0.1 g/100mL，MgS04 0.15 g/100mL，CaCl2 0. 01 g/100mL;液体菌种培养的参数为：温度27-28°C，培养3. 5-4. 5d，摇床 转速80-140转/分钟。
9. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述鱼类具体为大黄鱼、石斑鱼、大 菱鲆或草鱼。
10. -种添加有桦褐孔菌多糖的鱼类饲料，其特征在于：包括桦褐孔菌多糖和鱼类饲 料基础饲料，桦褐孔菌多糖用量为每千克鱼类饲料基础饲料中添加5-15g。
【文档编号】A23K1/16GK104206776SQ201310206283
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月29日 优先权日:2013年5月29日
【发明者】徐向群 申请人:徐向群