一种深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法
【专利摘要】本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法。具体的说是一种工业化规模的桦褐孔菌胞外多糖的生产方法，该方法是将活化好的桦褐孔菌菌种通过接入到种子罐进行扩配，再将扩配好的液体种子接入到特制的产多糖的液态培养基中进行发酵，然后将发酵液进行分离，提取胞外多糖。本发明针对上述现有技术的不足进行研究，在小试和中试继续优化发酵培养基(尤其是碳源)、提升生物量和胞外多糖的基础上，解决了由小试放大到工业化生产中遇到的发酵过程参数控制、提取设备选型、优化等难题，最终成功嫁接到10‐20t发酵罐进行产业化生产，并顺利生产出高品质的桦褐孔菌多糖，真正实现了连续、自动化、产业化的生产。
【专利说明】一种深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖 的方法。
【背景技术】
[0002] 桦褐孔菌又名白桦茸，属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属， 是一种生于桦树上的寄生性大型药用真菌。其子实体呈现类似于碳的黑色块状形态，主要 分布于北美北部、俄罗斯、芬兰、中国黑龙江、日本北海道等地区的珍稀药用菌类
[0003] 桦褐孔菌主要寄生于白桦、榆树、银桦等其他桦木类的树皮下，子实体即菌核表面 黑色深裂，菌管前段开裂，菌肉木栓质且具有环纹，孢子椭圆状或卵状，是一种生在在寒带 的木腐菌。桦褐孔菌在俄罗斯等地被广泛应用，是一种俄罗斯民间常用药物，已有至少数 百年的应用历史，因其在治疗肠胃疾病、缓解癌症症状、预防疾病等方面效果显著，在俄罗 斯、中欧、我国东北等地区应用广泛，广受认可，被当地人称为"万能药"。
[0004] 随着现代生物技术的发展，研究者发现桦褐孔菌的多糖可能是其主要药效成分， 目前已经报道的桦褐孔菌多糖药理作用主要包括抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、清除自 由基、抑制过氧化脂质生成、抗炎、增强免疫力、抗凝血、抗衰老、止痛等。据报道，桦褐孔菌 的抗肿瘤作用主要通过葡聚糖等多糖类物质来激活机体的免疫系统，起到增强机体的抗肿 瘤免疫的作用。在治疗肿瘤方面，血清中较高浓度的一氧化氮含量能够影响肿瘤细胞信号 的传导和肿瘤内血管的形成，促进肿瘤生长。桦褐孔菌多糖对小鼠肉瘤的生长具有明显的 抑制作用。桦褐孔菌多糖降血糖、降血脂作用的研究表明，桦褐孔菌多糖能够促进胆固醇逆 向代谢转换为胆固醇酯，抑制肠道内胆固醇吸收，同时能够改善血管内皮功能，降低血脂。 桦褐孔菌中多糖类物质具有免疫增强功能，对免疫相关淋巴细胞的活性和功能有促进作 用，能够清除体内自由基，延长细胞分裂，延长细胞寿命。
[0005] 近十余年来越来越多的学者开始研究桦褐孔菌的药效成分和药理作用，桦褐孔 菌已成为药用真菌中最有开发前景的菌种之一。但是目前国内野生的桦褐孔菌资源稀少， 子实体的人工栽培成功率低且重复性差，固体栽培周期长、污染率高，易受周围环境限制， 无法满足日益增长的市场需求。而深层液态发酵技术具有发酵周期短、高产量、污染率低 等优点、不受周围环境限制，资源设备利用率高等优点，因而受到越来越多的研究者们的青 睐。国内外也有少量大专院校的研究者对桦褐孔菌的深层发酵进行过研究，但往往其主要 侧重点是如何获取更高的生物量，只有少部分研究者关注桦褐孔菌的功效成分多糖的研 究，但主要是通过菌丝体提取获取多糖，并且仅有浙江理工大学和天津科技大学的部分研 究生开展了液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的研究，但其不足主要有：①都仅局限于小试 的摇瓶试验，属于基础研究阶段；②从他们的数据中可以看出：培养周期大约9天，生物量 为1. 0-1. lg/100ml，胞外多糖产量为0. 11-0. 14g/100ml，生物量和活性产物胞外糖得率太 低，生产成本过于昂贵，其工艺需进一步提升，若要达到规模化和产业化的生产桦褐孔菌多 糖还需要进行大量的研究和实验工作。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决工业化规模生产桦褐孔菌多糖的技术瓶颈，采用液态发 酵生产桦褐孔菌多糖克服了固态发酵周期长、投资大、受季节限制、难以产业化等弊端，采 用此发明能够连续、自动化、产业化的生产出高品质的桦褐孔菌多糖。
[0007] 为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行：
[0008] 本发明的产业化深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法包括下述步骤：
[0009] -种制备桦褐孔菌发酵液的方法，将桦褐孔菌种子培养液接入灭菌后的发酵培养 基，接种量为10?20%，通风比为1 :0· 3 - 1. Ovvm，罐压0· 02?0· 05Mpa，在22?30°C下 发酵培养3?4天，得到桦褐孔菌发酵液；其中所述的发酵培养基配方为：葡萄糖1-3%、 淀粉1-3 %、蚕蛹粉0. 1-0. 5 %、蛋白胨0. 1-0. 5 %、磷酸二氢钾0. 1-0. 5 %、七水硫酸镁 0. 1-0.5%、消泡剂0.01-0.05%、2000011/1111 的耐高温〇-淀粉酶0.001-0.007%卜八），调 节pH值6. 5-7. 5。上述培养基组成中除淀粉酶以外的"％"，均表示g/100ml。
[0010] 所述的消泡剂可以为植物油（豆油、菜籽油）类、有机醚类等物质。
[0011] 其中，所述的桦褐孔菌种子培养液优选通过以下方法制备得到：
[0012] 1) 一级种子培养：将经活化摇瓶菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为 0· 1?2%，通风比为1 :0.3-L0vvm，罐压0.02?0.05Mpa，在22?30°C下培养5?6天， 得到桦褐孔菌一级种子培养液；
[0013] 2)二级种子培养：将步骤1)所得的一级种子培养液接入灭菌后的液体种子培养 基，接种量为10?20%，通风比为1 :0· 3 - 1. Ovvm，罐压0· 02?0· 05Mpa，在22?30°C下 培养3?4天，得到所述的桦褐孔菌种子培养液。
[0014] 所述的液体种子培养基配方优选为：葡萄糖2-4%、蚕蛹粉0. 1-0. 5%、黄豆饼粉 1-3 %、磷酸二氢钾0. 1-0. 5 %、七水硫酸镁0. 1-0. 5 %、消泡剂0.01-0. 05%，调节pH值 6. 5-7. 5。上述培养基组成中的"％"均表示g/100ml。
[0015] 所述的发酵培养终点为：菌球变碎、滤液浑浊；还原糖降至最低并略有波动，还原 糖控制0.3% (g/100g)以下；镜检菌丝细碎，无杂菌污染。
[0016] 一种桦褐孔菌胞外多糖提取的方法，该方法包括下述步骤：
[0017] 1)分离：将权利要求1所得的桦褐孔菌发酵培养液经分离，得到桦褐孔菌上清 液；
[0018] 2)浓缩：将步骤1)所得的滤液进行采用二级低温浓缩，得到浓缩比重为1. 25? 1. 40的浓缩浆；
[0019] 3)醇沉、烘干：加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒 精度约65-80 % (v/v)，静置8-16h，将沉淀物进行真空烘干，温度50-75°C，真空度不低于 0· 085MPa ;烘干至干燥物水分含量为3?8% (g/100g)，即得胞外糖。
[0020] 其中，所述步骤1)中所述的分离采用卧螺离心机进行，转速控制在2500 - 3500r/ min〇
[0021] 所述步骤2)中所采用的二级浓缩为：一级采用1 - 3t双效蒸发器浓缩，将发酵 液浓缩到比重为1. 15 - 1. 20 (50°C热测），二级采用1 - 3t单效浓缩器浓缩，即将比重为 1. 1 - 1. 20 (50°C热测）的浓缩液继续浓缩到比重为1. 25?1. 40 (50°C热测）的浓缩浆；浓 缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0. 085MPa。
[0022] 本发明中醇沉是采用1 _3t醇沉罐，醇沉次数越多，胞外糖的含量越高。真空烘干 采用的真空干燥箱，本发明提取的胞外糖含量在20 - 50%。
[0023] 本发明具有以下几个突出的优点：
[0024] 本发明针对上述现有技术的不足进行研究，在小试和中试继续优化发酵培养基 (尤其是碳源）、提升生物量和胞外多糖的基础上，解决了由小试放大到工业化生产中遇到 的发酵过程参数控制、提取设备选型、优化等难题，最终成功嫁接到10 - 20t发酵罐进行产 业化生产，并顺利生产出高品质的桦褐孔菌多糖，真正实现了连续、自动化、产业化的生产。
[0025] 为了提高目的产物胞外多糖的产量，本发明在发酵培养基的碳源进行了优化和组 合：采用短效葡萄糖和长效淀粉的复合组方。发酵前期以生长菌丝体，提高生物含量为主， 因此培养基中添加了菌体优先选用的葡萄糖碳源，迅速增殖；发酵后期要提高目的产物的 含量，因此碳源提供菌体相对利用较慢的淀粉，并在培养基中添加适量淀粉酶，控制菌体数 量在合适规模，并不断产生代谢物胞外糖。
[0026] 为了提供胞外糖的产量，本发明优化发酵培养基的配方，针对碳源部分采用了复 合组方，既保证了前期菌体的生物量，又保证后期代谢产物的产量。
[0027] 采用本发明可根据市场需求和产品标准，制得不同含量的高品质的多糖，多糖含 量可在20 - 50%。
【具体实施方式】
[0028] 以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发 明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
[0029] 以下实施例使用的桦褐孔菌购买于中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌种编码 CfCC60260,以此株菌为例，详细说明本发明的具体方案。但是本发明方法通用于所有的桦 褐孔菌，并不仅限于该菌株。
[0030] 实施例1
[0031] 本发明产业化深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法按下述步骤进行：
[0032] 1、桦褐孔菌发酵液的制备：将活化好的桦褐孔菌摇瓶菌株按接种量1%接种于种 子培养基（300L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3%、蚕蛹粉0.3%、黄豆饼粉1.8%、磷酸 二氢钾0. 3%、七水硫酸镁0. 15%、消泡剂0. 02%，调节pH值7. 0,通风比为1 :0. 3vvm，罐压 0. 03Mpa，26?28°C振荡培养5天即得桦褐孔菌一级种子液；将一级种子液按接种量15% 接入二级种子培养基（3000L)，其中二级种子培养基组成为葡萄糖3%、蚕蛹粉0. 3%、黄豆 饼粉1. 8%、磷酸二氢钾0. 3%、七水硫酸镁0. 15%、消泡剂0. 02%，调节pH值7. 0,通风比 为1 :0. 3vvm，罐压0. 03Mpa，26?28°C培养3天即得桦褐孔菌二级种子液；将二级种子液 按接种量18 %接入发酵培养基（7500L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2 %、淀粉2 %、蚕蛹 粉0. 5%、蛋白胨0. 3%、磷酸二氢钾0. 2%、七水硫酸镁0. 2%、消泡剂豆油0.03%、耐高温 α -淀粉酶（枣庄杰诺酶生物有限公司，20000u/ml)0.002% (v/v)，调节pH值7.0;通风比 为1 :0. 5vvm，罐压0. 03Mpa，26?28°C培养3天，发酵至菌球变碎、滤液浑池；还原糖降至最 低0. 2%并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染。即得桦褐孔菌发酵液8850Kg。
[0033] 2、桦褐孔菌发酵液分离：将上述桦褐孔菌发酵液8850Kg通过卧螺离心机进行分 离，转速控制在3000r/min，分离时间在2h，得到桦褐孔菌滤液8150Kg和575Kg的湿菌丝体 (含水量为80% )，湿菌丝体可直接低温干燥粉碎制得发酵桦褐孔菌菌粉。
[0034] 4、低温浓缩：将步骤2所得的桦褐孔菌滤液8150Kg真空转移至3t双效蒸发器，在 真空度为〇. 〇85MPa，浓缩温度为65°C条件下浓缩至比重为1. 20 (50°C热测）浓缩液，再将浓 缩液真空转移至1. 5t单效球型浓缩器，在真空度为0. 09MPa，浓缩温度为60°C条件下继续 浓缩至比重为1. 30 (50°C热测）的浓缩浆310kg。
[0035] 5、醇沉、烘干：向盛有310kg浓缩浆的醇沉罐中加入重量1200kg的95%酒精，用 酒精计检测混合液酒精度73 % (v/v)，静置12h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘 干，温度60°C，真空度0.09MPa ;烘干12h得胞外糖85kg。检测水分含量为4%，多糖含量为 30%。
[0036] 实施例2
[0037] 1、桦褐孔菌发酵液的制备：将活化好的桦褐孔菌摇瓶菌株按接种量1. 5%接种于 种子培养基（300L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3%、蚕蛹粉0. 3%、黄豆饼粉1. 8%、磷 酸二氢钾0.3%、七水硫酸镁0. 15%、消泡剂0.02%，调节pH值7.0,通风比为1 :0.3vvm， 罐压0. 03Mpa，25?27°C振荡培养6天即得桦褐孔菌一级种子液；将一级种子液按接种量 15%接入二级种子培养基（3000L)，其中二级种子培养基组成为葡萄糖3%、蚕蛹粉0. 3%、 黄豆饼粉1. 8%、磷酸二氢钾0. 3%、七水硫酸镁0. 15%、消泡剂0. 02%，调节pH值7. 0,通 风比为1 :0. 3vvm，罐压0. 03Mpa，25?27°C培养3天即得桦褐孔菌二级种子液；将二级种子 液按接种量18%接入发酵培养基（15000L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2%、淀粉2%、 蚕蛹粉0. 5 %、蛋白胨0. 3 %、磷酸二氢钾0. 2 %、七水硫酸镁0. 2 %、消泡剂菜籽油0. 03 %、 耐高温α -淀粉酶（枣庄杰诺酶生物有限公司，20000u/ml)0. 002% (v/v)，调节pH值7. 0 ; 通风比为1 :〇. 5vvm，罐压0. 04Mpa，25?27°C培养7天，发酵至菌球变碎、滤液浑浊；还原糖 降至最低0. 2 %并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染，既得桦褐孔菌发酵液17700Kg。
[0038] 2、桦褐孔菌发酵液的分离：将上述桦褐孔菌发酵液17700Kg通过卧螺离心机进行 分离，得到桦褐孔菌滤液16550Kg和950Kg的湿菌丝体（含水量为75% )，湿菌丝体可直接 低温干燥粉碎制得发酵桦褐孔菌菌粉。具体工艺条件是：转速控制在3200r/min，分离时间 在 4. 5h。
[0039] 4、低温浓缩：将步骤2所得的桦褐孔菌滤液16750Kg真空转移至3t双效蒸发器， 在真空度为-〇. 〇9MPa，浓缩温度为63°C条件下浓缩至比重为1. 18(50°C热测）浓缩液，再 将浓缩液真空转移至1. 5t单效球型浓缩器，在真空度为0. 09MPa，浓缩温度为65°C条件下 浓缩至比重为1.35 (50°C热测）的浓缩浆580kg。
[0040] 5、醇沉、烘干：向盛有580kg浓缩浆的醇沉罐中加入重量2200kg的95%酒精，用 酒精计检测混合液酒精度70 % (v/v)，静置10h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘 干，温度65°C，真空度0. 09MPa ;烘干18h得胞外糖175kg。检测水分含量为4. 5%，多糖含 量为32%。
[0041] 实施例3
[0042] 为更好验证本发明中短效葡萄糖和长效淀粉的复合组方在产业化生产桦褐孔菌 多糖的优越性，又做了几个对比试验。试验中只调整了液体发酵培养基中碳源葡萄糖或 (和）淀粉的用量，对比例1中不含有淀粉，葡萄糖浓度为1. 5% ;对比例2中不含有葡萄
【权利要求】
1. 一种制备桦褐孔菌发酵液的方法，其特征在于将桦褐孔菌种子培养液接入灭菌后的 发酵培养基，接种量为10?20 % (v/v)，通风比为1 :0. 3 - 1. Ovvm，罐压0. 02?0. 05Mpa， 在22?30°C下发酵培养3?4天，得到桦褐孔菌发酵液；其中所述的发酵培养基配方为：葡 萄糖1-3%、淀粉1-3%、蚕蛹粉0. 1-0. 5%、蛋白胨0. 1-0. 5%、磷酸二氢钾0. 1-0. 5%、七水 硫酸镁 〇· 1-0. 5%、消泡剂 0· 01-0. 05%、20000 μ /ml 的耐高温 α -淀粉酶 〇· 001-0. 007% (ν/ν)，调节 pH 值 6. 5-7. 5。
2. 根据权利要求1所述的制备桦褐孔菌发酵液的方法，其特征在于所述的桦褐孔菌种 子培养液通过以下方法制备得到： 1) 一级种子培养：将经活化摇瓶菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为〇. 1? 2% (v/v)，通风比为1 :0· 3 -L Ovvm，罐压0· 02?0· 05Mpa，在22?30°C下培养5?6天， 得到桦褐孔菌一级种子培养液； 2) 二级种子培养：将步骤1)所得的一级种子培养液接入灭菌后的液体种子培养基，接 种量为10?20% (v/v)，通风比为1 :0· 3 -1. Ovvm，罐压0· 02?0· 05Mpa，在22?30°C下 培养3?4天，得到所述的桦褐孔菌种子培养液。
3. 根据权利要求2所述的一种制备桦褐孔菌发酵液方法，其特征在于所述的液体种子 培养基配方为：葡萄糖2-4%、蚕蛹粉0. 1-0. 5%、黄豆饼粉1-3%、磷酸二氢钾0. 1-0. 5%、 七水硫酸镁〇· 1-0. 5%、消泡剂0· 01-0. 05%，调节pH值6. 5-7. 5。
4. 根据权利要求1所述的一种制备桦褐孔菌发酵液方法，其特征在于所述的发酵培养 终点为：菌球变碎、滤液浑浊；还原糖降至最低并略有波动，还原糖控制〇. 3%以下；镜检菌 丝细碎，无杂菌污染。
5. -种桦褐孔菌胞外多糖提取的方法，其特征在于该方法包括下述步骤： 1) 分离：将权利要求1所得的桦褐孔菌发酵培养液经分离，得到桦褐孔菌上清液； 2) 浓缩：将步骤1)所得的滤液进行采用二级低温浓缩，得到浓缩比重为1. 25?1. 40 的浓缩浆； 3) 醇沉、烘干：加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度 约65-80 % (v/v)，静置8-16h，将沉淀物进行真空烘干，温度50 - 75 °C，真空度不低于 0· 085MPa ;烘干至干燥物水分含量为3?8% (g/100g)，即得胞外糖。
6. 根据权利要求5所述的桦褐孔菌胞外糖的方法，其特征在于所述步骤1)中所述的分 离米用卧螺离心机进行，转速控制在2500 - 3500r/min。
7. 根据权利要求1所述的桦褐孔菌胞外糖的方法，其特征在于所述步骤2)中所采用 的二级浓缩为：一级采用双效蒸发器浓缩，将发酵液浓缩到比重为1. 15 -1. 20,二级采用单 效浓缩器浓缩，即将比重为1. 1 -1. 20的浓缩液继续浓缩到比重为1. 25?1. 40的浓缩浆； 浓缩过程均要求控制温度不高于75°C，真空度不低于0. 085MPa。
【文档编号】C08B37/00GK104099385SQ201410337923
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】徐玲, 徐国华, 王文风, 王英燕, 张芙蓉, 杨亚威, 高岩 申请人:江苏阜丰生物科技有限公司