一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其制备方法的具体步骤：将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌、醋酸杆菌、沼泽红假单胞菌、酿酒酵母分别在斜面中活化，之后纯化得各斜面菌种，备用；利用各斜面菌种制备相应的原菌液；将各原菌液按1：1：1：1的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基Ⅰ中进行培养，得复合微生态制剂的一级种子；将一级种子按5%的接种量接种于已灭菌的发酵培养基Ⅱ中培养得复合微生态制剂的二级种子；最后将二级种子按5%的接种量接种至已灭菌的发酵培养基Ⅲ培养以获得复合微生态制剂的成品。利用本发明复合微生态制剂能够在生猪养殖场起到阻隔病菌传播的作用，从而提高了生猪养殖抗病能力。
【专利说明】—种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及一种养殖领域用的复合微生态制剂，尤其涉及一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂。
【【背景技术】】
[0002]随着生猪养殖的日益集中化、规模化发展，对生猪的疫病防治控制的要求日益提高。目前，养猪场的疫病防治主要还是使用疫苗和抗生素等传统手段，而长期的抗生素使用也带来明显的弊端，不仅养殖成本提高，而且带来生猪耐药性问题、以及因猪肉抗生素残留带来的对人们健康威胁问题。因此，研究无抗生素型的生猪防疫技术成为当前养殖行业最热点的话题之一。
【
【发明内容】
】
[0003]本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，利用其能够在生猪养殖场起到阻隔病菌传的作用，从而提高了生猪养殖的抗病能力。
[0004]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其制备方法的具体步骤如下:
[0005](I)原菌种斜面培养:将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌、醋酸杆菌、沼泽红假单胞菌、酿酒酵母分别在斜面中活化，之后分别置于90_培养皿中进行纯化，得嗜酸乳杆菌斜面菌种、醋酸杆菌斜面菌种、沼泽红假单胞菌斜面菌种、及酿酒酵母斜面菌种，备用；
[0006](2)原菌种液体培养:将嗜`酸乳杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基I中，之后置于37°C下厌氧培养1-2天得嗜酸乳杆菌原菌液；将醋酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基II中，接着于30°C下好氧培养1-2天得醋酸杆菌原菌液；将沼泽红假单胞菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基III中，接着于28°C -30°C厌氧钨丝灯光照培养5-7天得沼泽红假单胞菌原菌液；将酿酒酵母斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基IV中，之后于280C -30°C下好氧培养3天得酿酒酵母原菌液；
[0007](3) 一级种子培养:将嗜酸乳杆菌原菌液、醋酸杆菌原菌液、沼泽红假单胞菌原菌液、及酿酒酵母原菌液按1:1:1:1的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基I中进行培养，具体地:先接种醋酸杆菌原菌液与酿酒酵母原菌液，并于30°C下好氧培养3天，再接种嗜酸乳杆菌原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液，于30°C下厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子；
[0008](4)二级种子培养:将所得的一级种子按5%的接种量接种于已灭菌的发酵培养基II中，并于30°C下先好氧培养3-5天再厌氧培养3-5天，得复合微生态制剂的二级种子；
[0009](5)成品培养:将所得的二级种子按5%的接种量接种至已灭菌的发酵培养基III中，并于30°C下先好氧3-5天再厌氧培养3-5天，获得复合微生态制剂的成品。
[0010]进一步地，所述步骤(I)中嗜酸乳杆菌在斜面中活化的具体操作为:用接种环将嗜酸乳杆菌接种于已灭菌的斜面培养基I上，之后于37°c下厌氧培养1-2天；所述斜面培养基I的灭菌温度为121°c、灭菌时间为20min ;且该斜面培养基I的组分:蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05、碳酸钙20克、琼脂15克、水1000ml、PH6.8。
[0011]进一步地，所述步骤(I)中醋酸杆菌在斜面中活化的具体操作为:制备斜面培养基II，并将斜面培养基II置于121°C下灭菌20min，接着冷却至60°C以下加入无水乙醇，且每IOOOml斜面培养基II需加入IOOml无水乙醇，之后用接种环将醋酸杆菌接种于斜面培养基II上，然后于30°C下好氧培养1-2天；所述斜面培养基II的组分:酵母粉10克、葡萄糖
10、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH5.5。
[0012]进一步地，所述步骤(I)中沼泽红假单胞菌在斜面中活化的具体操作为:用接种环将沼泽红假单胞菌接种于已灭菌的斜面培养基III上，之后于28°C -30°c厌氧钨丝灯光照培养5-7天；所述斜面培养基III的灭菌温度为121°C、灭菌时间为15min ;且该斜面培养基III的组分:酵母粉10克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH7.0-7.2。
[0013]进一步地，所述步骤(I)中酿酒酵母在斜面中活化的具体操作为:用接种环将酿酒酵母接种于已灭菌的斜面培养基IV上，之后于28-30°C下好氧培养3天；所述斜面培养基IV的灭菌温度为121°C、灭菌时间为30min ;且该斜面培养基IV的组分:马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂15-20克、水1000ml、PH自然。
[0014]进一步地，所述步骤(2)中液体培养基I的组分:蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05、碳酸钙20克、琼脂15克、水1000ml、PH6.8 ;液体培养基II的组分:酵母粉10克、葡萄糖10、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH5.5 ;液体培养基III的组分:酵母粉10克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH7.0-7.2 ;液体培养基IV的组分:马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然。
[0015]进一步地，所述步骤(3)中发酵培养基I的组分:桔水5%、酵母粉0.5%、蛋白胨1%、氯化铵0.1%、氯化钠0.1%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.05%、硫酸锌0.025%、硫酸亚铁0.025%，余量水。
[0016]进一步地，所述步骤(4)中发酵培养基II的组分:桔水5%、酵母粉0.1%、蛋白胨0.1%、氯化铵0.1%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、硫酸锌0.025%、硫酸亚铁0.025%，余量为水。
[0017]进一步地，所述步骤(5)中发酵培养基III的组分:桔水5%、氯化铵0.2%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、硫酸锌0.025%、硫酸亚铁0.025%，余量为水。
[0018]本发明一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂的有益效果在于:采用本发明复合微生态制剂能够在养殖场周边形成一个以良性微生物为主的微环境，可起到阻隔病菌传播，从而提高生猪抗病能力的效果，还具有使用方便，作用明显的特点；而且该复合微生态制剂还具有工艺较为简单、成本低的优点，从而使得本发明复合微生态制剂能够较为广泛地应用。
【【具体实施方式】】
[0019]本发明一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其制备方法的具体步骤如下:
[0020](I)原菌种斜面培养:将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌、醋酸杆菌、沼泽红假单胞菌、酿酒酵母分别在斜面中活化，之后分别置于90mm培养皿中进行纯化，得嗜酸乳杆菌斜面菌种、醋酸杆菌斜面菌种、沼泽红假单胞菌斜面菌种、及酿酒酵母斜面菌种，备用；
[0021](2)原菌种液体培养:将嗜酸乳杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基I中，之后置于37°C下厌氧培养1-2天得嗜酸乳杆菌原菌液；将醋酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基II中，接着于30°C下好氧培养1-2天得醋酸杆菌原菌液；将沼泽红假单胞菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基III中，接着于28°C -30°C厌氧钨丝灯光照培养5-7天得沼泽红假单胞菌原菌液；将酿酒酵母斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基IV中，之后于280C -30°C下好氧培养3天得酿酒酵母原菌液；
[0022](3) 一级种子培养:将嗜酸乳杆菌原菌液、醋酸杆菌原菌液、沼泽红假单胞菌原菌液、及酿酒酵母原菌液按1:1:1:1的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基I中进行培养，具体地:先接种醋酸杆菌原菌液与酿酒酵母原菌液，并于30°c下好氧培养3天，再接种嗜酸乳杆菌原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液，于30°C下厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子；
[0023](4)二级种子培养:将所得的一级种子按5%的接种量接种于已灭菌的发酵培养基II中，并于30°C下先好氧培养3-5天再厌氧培养3-5天，得复合微生态制剂的二级种子；
[0024](5)成品培养: 将所得的二级种子按5%的接种量接种至已灭菌的发酵培养基III中，并于30°C下先好氧3-5天再厌氧培养3-5天，获得复合微生态制剂的成品。
[0025]其中:步骤(I)中嗜酸乳杆菌在斜面中活化的具体操作为:用接种环将嗜酸乳杆菌接种于已灭菌的斜面培养基I上，之后于37°c下厌氧培养1-2天；所述斜面培养基I的灭菌温度为121°C、灭菌时间为20min ;且该斜面培养基I的组分:蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05、碳酸钙20克、琼脂15克、水1000ml、PH6.8。步骤(I)中醋酸杆菌在斜面中活化的具体操作为:制备斜面培养基II，并将斜面培养基II置于121°C下灭菌20min,接着冷却至60°C以下加入无水乙醇，且每IOOOml斜面培养基II需加入IOOml无水乙醇，之后用接种环将醋酸杆菌接种于斜面培养基II上，然后于30°C下好氧培养1-2天；所述斜面培养基II的组分:酵母粉10克、葡萄糖10、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH5.5。步骤(I)中沼泽红假单胞菌在斜面中活化的具体操作为:用接种环将沼泽红假单胞菌接种于已灭菌的斜面培养基III上，之后于28°C -30°C厌氧钨丝灯光照培养5-7天；所述斜面培养基III的灭菌温度为121°C、灭菌时间为15min ;且该斜面培养基III的组分:酵母粉10克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH7.0-7.2。步骤(I)中酿酒酵母在斜面中活化的具体操作为:用接种环将酿酒酵母接种于已灭菌的斜面培养基IV上，之后于28-30°C下好氧培养3天；所述斜面培养基IV的灭菌温度为121°C、灭菌时间为30min ;且该斜面培养基IV的组分:马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂15-20克、水1000ml、PH 自然。
[0026]步骤(2)中液体培养基I的组分:蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05、碳酸钙20克、水1000ml、PH6.8 ;液体培养基II的组分:酵母粉10克、葡萄糖10、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.5克、琼脂2%、水1000ml、PH5.5 ;液体培养基III的组分:酵母粉10克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH7.0-7.2 ;液体培养基IV的组分:马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然。
[0027]步骤(3)中发酵培养基I的组分:桔水5%、酵母粉0.5%、蛋白胨1%、氯化铵0.1%、氯化钠0.1%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.05%、硫酸锌0.025%、硫酸亚铁0.025%，余量为水。步骤(4)中发酵培养基II的组分:桔水5%、酵母粉0.1%、蛋白胨0.1%、氯化铵0.1%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、硫酸锌0.025%、硫酸亚铁0.025%,余量为水。步骤
(5)中发酵培养基III的组分:桔水5%、氯化铵0.2%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁
0.05%、硫酸锌0.025%、硫酸亚铁0.025%，余量为水。
[0028]需要说明的是，本发明中各培养基的百分比均为质量百分比。
[0029]本发明所述的复合微生态制剂用于对生猪进行防疫， 申请人:以该复合微生态制剂应用于生猪养殖场为例进行阐述说明，具体地:
[0030]同时设置试验组和空白对照组:试验组中，养殖生猪67头，将本发明制备获得的复合微生态制剂与水按照1:100的体积比配制成水稀释液，将该水稀释液均匀地喷洒于养殖场和生猪栏舍的四周，且每平方米每次喷洒水稀释液0.1公斤；开始每周喷洒2-3次，一个月后每周喷洒I次，然后逐步延长到10天一次、每月1-2次。空白对照组未喷洒复合微生态制剂的稀释液。实验结果为:试验组生猪全部正常饲养出栏，即淘汰率为0%;空白对照组中有两头生猪在饲养过程中因病退出实验，淘汰率5.9% ;且试验组生猪全过程治疗36头次，治疗率为56.25% ;空白对照组生猪全过程治疗30头次，治疗率88.24%。因此，从实验结果可知，试验组的防疫效果明显。
[0031]综上，采用本发明复合微生态制剂能够在养殖场周边形成一个以良性微生物为主的微环境，可起到阻隔病菌传播，从而提高生猪养殖抗病能力的效果，还具有使用方便，作用明显的特点；而且该复合微生态制剂还具有工艺较为简单、成本低的优点，从而使得本发明复合微生态制剂能够 较为广泛地应用。
【权利要求】
1.一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其特征在于:其制备方法的具体步骤如下: (1)原菌种斜面培养:将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌、醋酸杆菌、沼泽红假单胞菌、酿酒酵母分别在斜面中活化，之后分别置于90mm培养皿中进行纯化，得嗜酸乳杆菌斜面菌种、醋酸杆菌斜面菌种、沼泽红假单胞菌斜面菌种、及酿酒酵母斜面菌种，备用； (2)原菌种液体培养:将嗜酸乳杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基I中，之后置于37°C下厌氧培养1-2天得嗜酸乳杆菌原菌液；将醋酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基II中，接着于30°C下好氧培养1-2天得醋酸杆菌原菌液；将沼泽红假单胞菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基III中，接着于28°C -30°C厌氧钨丝灯光照培养5-7天得沼泽红假单胞菌原菌液；将酿酒酵母斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基IV中，之后于280C -30°C下好氧培养3天得酿酒酵母原菌液； (3)—级种子培养:将嗜酸乳杆菌原菌液、醋酸杆菌原菌液、沼泽红假单胞菌原菌液、及酿酒酵母原菌液按1:1:1:1的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基I中进行培养，具体地:先接种醋酸杆菌原菌液与酿酒酵母原菌液，并于30°C下好氧培养3天，再接种嗜酸乳杆菌原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液，于30°C下厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子； (4)二级种子培养:将所得的一级种子按5%的接种量接种于已灭菌的发酵培养基II中，并于30°C下先好氧培养 3-5天再厌氧培养3-5天，得复合微生态制剂的二级种子； (5)成品培养:将所得的二级种子按5%的接种量接种至已灭菌的发酵培养基III中，并于30°C下先好氧3-5天再厌氧培养3-5天，获得复合微生态制剂的成品。
2.根据权利要求1所述的一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其特征在于:所述步骤(I)中嗜酸乳杆菌在斜面中活化的具体操作为:用接种环将嗜酸乳杆菌接种于已灭菌的斜面培养基I上，之后于37°C下厌氧培养1-2天；所述斜面培养基I的灭菌温度为121°C、灭菌时间为20min ;且该斜面培养基I的组分:蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05、碳酸钙20克、琼脂15克、水1000ml、PH6.8。
3.根据权利要求1所述的一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其特征在于:所述步骤(I)中醋酸杆菌在斜面中活化的具体操作为:制备斜面培养基II，并将斜面培养基II置于121°C下灭菌20min，接着冷却至60°C以下加入无水乙醇，且每IOOOml斜面培养基II需加入IOOml无水乙醇，之后用接种环将醋酸杆菌接种于斜面培养基II上，然后于30°C下好氧培养1-2天；所述斜面培养基II的组分:酵母粉10克、葡萄糖10克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH5.5。
4.根据权利要求1所述的一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其特征在于:所述步骤(I)中沼泽红假单胞菌在斜面中活化的具体操作为:用接种环将沼泽红假单胞菌接种于已灭菌的斜面培养基III上，之后于28°C-30°C厌氧钨丝灯光照培养5-7天；所述斜面培养基III的灭菌温度为121°C、灭菌时间为15min ;且该斜面培养基III的组分:酵母粉10克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH7.0-7.2。
5.根据权利要求1所述的一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其特征在于:所述步骤(I)中酿酒酵母在斜面中活化的具体操作为:用接种环将酿酒酵母接种于已灭菌的斜面培养基IV上，之后于28-30°C下好氧培养3天；所述斜面培养基IV的灭菌温度为121°C、灭菌时间为30min ;且该斜面培养基IV的组分:马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂15-20克、水1000ml、PH 自然。
6.根据权利要求1所述的一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其特征在于:所述步骤(2)中液体培养基I的组分:蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05、碳酸钙20克、琼脂15克、水1000ml、PH6.8 ;液体培养基II的组分:酵母粉10克、葡萄糖10、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH5.5 ;液体培养基III的组分:酵母粉10克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH7.0-7.2 ;液体培养基IV的组分:马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然。
7.根据权利要求1所述的一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其特征在于:所述步骤(3)中发酵培养基I的组分:桔水5%、酵母粉0.5%、蛋白胨1%、氯化铵0.1%、氯化钠0.1%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.05%、硫酸锌0.025%、硫酸亚铁0.025%，余量水。
8.根据权利要求1所述的一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其特征在于:所述步骤(4)中发酵培养基II的组分:桔水5%、酵母粉0.1%、蛋白胨0.1%、氯化铵0.1%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁 0.05%、硫酸锌0.025%、硫酸亚铁0.025%，余量为水。
9.根据权利要求1所述的一种用于生猪辅助防疫的复合微生态制剂，其特征在于:所述步骤(5)中发酵培养基III的组分:桔水5%、氯化铵0.2%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、硫酸锌0.025%、硫酸亚铁0.025%，余量为水。
【文档编号】A01N63/02GK103444784SQ201310373237
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】陈琳, 莫艳华, 秦火保, 周世须 申请人:福州大用生物应用科技有限公司