一种生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及了利用固态发酵技术生产富含苯乳酸的凝结芽孢杆菌固态发酵饲料。利用凝结芽孢杆菌进行固态发酵，对发酵过程的控制，及发酵后期苯乳酸提取、检测条件的探索，来确定样品中苯乳酸的产量。最终，通过培养基优化和底物的添加，获取苯乳酸最高产量的凝结芽孢杆菌固态发酵饲料。该饲料有效的提高了产蛋鸡的产蛋率，降低死淘率和料蛋比，最佳使用浓度为0.15%。苯乳酸是一种新型抑菌物质，具有增强动物免疫力，提高畜禽肉质，降低家畜体内大肠杆菌数量等功能。固态发酵中苯乳酸的产生，使凝结芽孢杆菌更好的发挥益生功能，从而进一步提高了这种固态发酵饲料的利用价值，富含苯乳酸的凝结芽孢杆菌固态发酵饲料在畜禽养殖业中具有更高的应用价值。
【专利说明】一种生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料及其制备
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制剂领域，是一种利用固态发酵凝结芽孢杆菌提高苯乳酸的产量，从而获取富含苯乳酸的固态发酵饲料，获取具有更高应用价值的固态制剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]微生态制剂又称活菌制剂或生菌剂，主要是用于调节动物机体微生态平衡，具有直接通过增强动物对肠内有害微生物的抑制作用或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，从而促进动物生长或提高饲料转化率的一类药物或饲料添加剂。微生态制剂具有无毒副作用、无耐药性、无残留、成本低、效果显著、不污染环境等特点，可以促进动物胃肠道正常微生物区系的建立，阻碍有害物质及废物的吸收，改善畜产品的质量等，克服了抗生素所产生的菌群失调、二重感染和耐药性等缺点，具有显著的经济效益和社会效益。
[0003]凝结芽孢杆菌是被美国，欧盟，日本批准做为饲料添加剂使用的微生物。它具有调节肠道功能紊乱，增加动物消化功能，维持肠道内菌群平衡和提高机体健康水平以及生产性能，提闻动物免疫力等功能。另外，芽抱的广生还使凝结芽抱杆菌具有耐酸喊，耐闻温抗逆性强这些优点，从而凝结芽孢杆菌能很好的适应培养环境，容易培养。
[0004]凝结芽孢杆菌主要以两种方式来影响机体的消化作用:一是促进产生多种消化酶的分泌，提高对营养物质的消化与吸收；二是通过该菌种在动物消化道内生长、繁殖和定植，直接产生如维生素、氨基酸、短链脂肪酸等多种营养物质，并明显增加小肠蠕动的速度，改善肠道消化功能，促进对饲料中各种营养成分的消化与吸收。
[0005]苯乳酸最早发现存在蜂蜜里面，最近发现一些微生物例如大部分的乳酸菌，芽孢杆菌属等也能产生苯乳酸。作为一种防腐剂，苯乳酸具有广谱抑菌活性:能够抑制许多细菌例如李斯特菌属，葡萄球菌，大肠杆菌，沙门氏菌和许多真菌包括酵母，许多的霉菌(娄地青霉，桔青霉)；苯乳酸已经用在了饲料中，它对母鸡的免疫系统产生一些积极的影响，最终有效提高产蛋量和蛋的质量。苯乳酸添加在鸡的饲料中时，能够提高产量，在肠道内产生抗病原体的活性，降低肉质发黄；苯乳酸在刚断奶的和增长的猪体内能够提高与免疫有关的血细胞的数量，降低大肠杆菌的数量。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种固态发酵凝结芽孢杆菌提高苯乳酸产量，从而获取富含苯乳酸的固态发酵饲料的一种方法。
[0007]本发明实现目的的技术方案如下:
[0008]凝结芽孢杆菌液体种子接入固态培养基中进行固态发酵培养，固态培养基的基本成分为豆柏，米糠，麦芽浸粉和水分组成，所述固态培养基中加入苯丙酮酸或者苯丙氨酸，来提高苯乳酸的产量；固态发酵55-65h，发酵温度为33-38°C，发酵室内的相对湿度控制在75-80%，发酵期间每隔12h翻匀一次。固态发酵培养后获得固态发酵饲料。
[0009]固态培养基组分为水分，豆柏，米糠，麦芽浸粉；所述固态培养基中各组分的的添加量如下:水分，豆柏，米糠，麦芽浸粉分别为500-700g/kg，200-250g/kg，50_100g/kg, 20-50g/kg。
[0010]固态发酵培养基接种量范围为5-15%，接种量为10%时苯乳酸产量最大。苯丙酮酸的添加浓度为2-3g/kg ;苯丙氨酸的添加量为2.5-3.5g/kg时；
[0011]苯丙酮酸的最适添加浓度为2.7g/kg,苯乳酸产量最大为815mg/kg,此时的转化率为98.7% ；
[0012]苯丙氨酸的添加量为3g/kg时，苯乳酸产量为752mg/kg，此时转化率为94.9%。
[0013]优选的固态培养基组分和添加量如下:水分的添加量为600g/kg。豆柏225g/kg，米糠75g/kg时，麦芽浸粉30g/kg。
[0014]本发明所述凝结芽孢杆菌的名称为TQ33,分类名称Bacillus coagulans,保藏编号为=CGMCC N0.5233保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0015]所述凝结芽孢杆菌的种子液培养基的组成(g/L):蛋白胨20.0、酵母膏10.0、葡萄糖 20.0，初始 ρΗ7.2-7.4。
[0016]种子液的培养条件:温度37±1°C，转速为ZOOr.mirT1，培养时间18h。
[0017]本发明使用生理盐水(超纯水配制)提取苯乳酸，将固态发酵样品和超纯水以1:4的比例混合，在4°C冰箱里放置4h后提取上清液，离心过膜后，利用高效液相测量苯乳酸的含量。
[0018]本发明所用的HPLC的条件
[0019]苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB_C18色谱柱，流动相为ImM H2SO4=Z腈90:10 (v/v)，进样量为1(^1^，流速为0.7111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。
[0020]苯丙酮酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱，流动相为ImM H2SO4:乙腈93:7 (v/v)，进样量为1(^1^，流速为0.4111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。
[0021]苯丙氨酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB_C18色谱柱,流动相为ImM H2SO4:乙腈95:5 (v/v)，进样量为1(^1^，流速为0.2111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。
[0022]有益效果:
[0023]本发明利用凝结芽孢杆菌固态发酵，通过底物的添加提高苯乳酸的产量，最终获取富含苯乳酸的饲料。这是首次通过固态发酵来提高苯乳酸产量，并且将获取的苯乳酸直接应用到发酵制剂中，省去了苯乳酸提取，分离等的下游处理工艺，既提高了这种饲料的利用价值，也不会增加这种固态发酵饲料的成本。
[0024]利用固态培养基发酵凝结芽孢杆菌获得的固态制剂本身就具有益生菌的效果，添加在词料里面，具有提闻动物的免疫力，促进动物生长等益生功能，在养殖业具有广阔的应用价值。固态制剂中苯乳酸产量的提高增强了凝结芽孢杆菌的益生功能，提高了这种固态制剂的利用价值，使这种固态制剂拥有更广泛的应用价值。
[0025]本发明的有益效果还在于通过凝结芽孢杆菌固态发酵提高了苯乳酸的产量，通过固态培养基的优化以及底物的添加确定了固态发酵饲料中苯乳酸的最终产量为815mg/kg。凝结芽孢杆菌是一种益生菌，利用其固态发酵所得到的制剂具有益生菌的多重功效。苯乳酸是一种新型的抑菌物质，具有增强动物免疫力，提高畜禽肉质，降低家畜体内的大肠杆菌数量等功能。固态发酵中苯乳酸含量的提高，使凝结芽孢杆菌能更好的发挥益生功能，从而进一步提高了这种固态发酵饲料的利用价值，这样的固态制剂在畜禽养殖业中具有更高的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1 (a)苯乳酸标样和样品的液相图谱，(b)苯丙酮酸标样和样品的液相图谱，(C)苯丙氨酸标样和样品的液相图谱
[0027]图2固态发酵生长曲线以及pH的变化
[0028]图3苯乳酸取样时间的确定
[0029]图4水分添加量对苯乳酸产量的影响
[0030]图5豆柏，米糠比例对苯乳酸产量的影响
[0031]图6麦芽浸粉对苯乳酸产量的影响
[0032]图7接种量对苯乳酸产量的影响
[0033]图8苯丙酮酸不同添加量对苯乳酸产量的影响以及苯丙酮酸的转化率
[0034]图9苯丙氨酸的添加量对苯乳酸的影响以及苯丙氨酸的转化率
【具体实施方式】
[0035]下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0036]本发明使用的菌种为凝结芽孢杆菌TQ33,分类名称Bacillus coagulans,保藏编号为:CGMCC N0.5233，保藏日期:2011年9月9日，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0037]斜面培养基、种子培养基
[0038]斜面培养基(g/L):蛋白胨20.0、酵母膏5.0、葡萄糖12.0、琼脂20.0初始ρΗ7.0-7.2。
[0039]种子培养基(g/L):蛋白胨20.0、酵母膏10.0、葡萄糖20.0，初始ρΗ7.2-7.4。
[0040]固态培养基
[0041]最终确定的固态培养基是由豆柏225g/kg，米糠75g/kg，麦芽浸粉30g/kg和水600g/kg苯丙酮酸2.7g/kg或者苯丙氨酸3.0g/kg组成；培养基混勻分装后115°C灭菌20mino
[0042]实施例1
[0043]I菌种活化
[0044]挑取甘油管里面的菌体一平板培养24h —挑取菌体，接入斜面，培养24后，4°C冰箱保存。
[0045]2种子液培养
[0046]挑取斜面菌体2环，接入种子液，37± I°C，200r.mirT1通风培养，18h后转接到固态
培养基。
[0047]3固态发酵
[0048]I)固态培养基组成:水分500g/kg，麦芽浸粉10g/kg，豆柏200g/kg，米糠200g/kg,混合均勻后分装，115°C灭菌20min。[0049]2)固态培养基的培养:按照固态培养基重量的5%接入种子液，37土 1°C，相对湿度80%左右培养，分别在0、3、6、12、24、36、48、60、72h取样。
[0050]3)确定不同时间的菌体数以及pH变化:将不同时间所取样品装入三角瓶中(三角瓶装有生理盐水和玻璃珠)后，在摇床摇匀大约lh，吸取上清液移到试管(每根试管9ml生理盐水)中进行梯度稀释；稀释好的液体，移到平板中与培养基混匀后37±1°C培养；另外，稀释好的菌液，在80°C中水浴lOmin，测其的芽孢数；另外，利用pH仪测量三角瓶中样品稀释液，记录其数值。
[0051]4)苯乳酸的提取:将不时间的发酵样品与生理盐水以1:4的比例混匀，在4°C冰箱里静止4h后，提取上清液，离心过膜。
[0052]4苯乳酸浓度的检测
[0053]苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB_C18色谱柱,流动相ImM H2SO4:乙腈90:10 (v/v)，进样量为 1(^1^，流速为0.7111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。 [0054]结果表明:从绘出的固态发酵生长曲线以及pH变化(附图2)可以看出，凝结芽孢杆菌在固态培养基中培养48h左右达到稳定期，48h以后菌体量变化不大；发酵过程中，pH的变化先下降，36h时pH最低，此后固态培养基的pH开始上升。从绘制的苯乳酸取样时间(附图3)可以看出:苯乳酸在对数期就开始产生，但是36h之前产量很少，并且不同时间的产量差异也小，36h后苯乳酸的产量开始升高，在60h苯乳酸的积累量达到最大为121mg/
kg ο
[0055]实施例2
[0056]I种子液培养
[0057]挑取斜面菌体2环，接入到种子液中，37°C，200r.mirT1通风培养，18h后转接到固态培养基。
[0058]2固态发酵
[0059]I)固态发酵培养基的组成:固态培养基中的水分添加量分别为500g/kg，550g/kg,600g/kg,700g/kg ;麦芽浸粉,豆柏与米糠添加量分别为10g/kg, 200g/kg, 200g/kg,混匀以后115°C灭菌20min。
[0060]2)固态发酵:按照固态培养基重量的5%接入种子液，37± 1°C,相对湿度80%左右培养，60h取样；样品与生理盐水以1:4的比例混合，4°C冰箱里静止4h，提取上清液，离心过膜。
[0061]3苯乳酸含量的测量
[0062]苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB_C18色谱柱,流动相ImM H2SO4:乙腈90:10 (v/v)，进样量为 1(^1^，流速为0.7111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。
[0063]结果表明:由附图4可以看出，固态培养基中水分添加量为600g/kg时，苯乳酸产量最高，由此确定固态培养基中水分的添加量为600g/kg。
[0064]实施例3
[0065]I种子液培养
[0066]挑取斜面菌体2环，接入到种子液中，37°C，200r.mirT1通风培养，18h后转接到固态培养基。
[0067]2固态发酵[0068]I)固态发酵培养基组成:固态发酵培养基中水分的添加量为600g/kg，麦芽浸粉为 10g/kg,豆柏，米糠的添加量分别为 150g/kg, 150g/kg ；200g/kg, 100g/kg ；100g/kg, 200g/kg ；225g/kg, 75g/kg ；75g/kg, 225g/kg。
[0069]2)固态发酵:按照固态培养基重量的5%接入种子液，37土 1°C相对湿度80%左右培养，60h取样；样品与生理盐水1:4的比例混合后4°C冰箱里静止4h，提取上清液，离心过膜。
[0070]3苯乳酸含量的测定
[0071]苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB_C18色谱柱，流动相为ImM H2SO4:Zj腈90: 10 (v/v)，进样量为IOyL,流速为0.7mL/min，柱温为30°C，检测波长210nm。
[0072]结果表明:根据结果绘制的图(附图5)可以看出，豆柏的含量对苯乳酸的产量有很大影响，豆柏225g/kg，米糠75g/kg时，苯乳酸的产量最大。
[0073]实施例4
[0074]I种子液培养
[0075]挑取斜面菌体2环，接入到种子液中，37°C，200r.mirT1通风培养，18h后转接到固态培养基。
[0076]2固态发 酵
[0077]I)固态培养基的组成:固态发酵培养基中水分的添加量为600g/kg，豆柏225g/kg,米糠75g/kg,麦芽浸粉添加量分别为10g/kg, 20g/kg,30g/kg,40g/kg,混匀后分装，115°C 灭菌 20min。
[0078]2)固态培养基的培养:按照固态培养基重量的5%接入种子液，37± I°C，相对湿度80%左右培养，60h后取样与生理盐水以1:4的比例混合，混匀后4°C冰箱里静止4h提取苯乳酸，过膜。
[0079]3苯乳酸含量的检测
[0080]苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB_C18色谱柱，流动相为ImM H2SO4:Zj腈90:10 (v/v)，进样量为1(^1^，流速为0.7111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。
[0081]结果表明:(附图6)可以看出，随着麦芽浸粉添加量的增加，苯乳酸的产量逐渐增加，当麦芽浸粉的添加量为30g/kg时，苯乳酸产量最大，超过此添加量浓度时，苯乳酸产量降低。
[0082]实施例5
[0083]I种子液培养
[0084]挑取斜面菌体2环，接入到种子液中，37°C，200r.mirT1通风培养，18h后转接到固态培养基。
[0085]2固态发酵
[0086]I)固态发酵培养基组成:水分添加量为600g/kg，豆柏225g/kg，米糠75g/kg，麦芽浸粉30g/kg,混匀后灭菌。
[0087]2)固态发酵:分别按照固态培养基重量的为5%，8%，10%, 12%接种；固态发酵培养基37 ± I °C，相对湿度80%左右培养；60h后取样与生理盐水以1:4的比例混合，混匀后4°C冰箱里静止4h提取上清液，过膜。
[0088]3苯乳酸含量的检测[0089]苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB_C18色谱柱，流动相为ImM H2SO4:Zj腈90:10 (v/v)，进样量为1(^1^，流速为0.7111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。
[0090]结果表明:通过(附图7)可以看出，接种量为10%的时候，苯乳酸的产量最大为137mg/kg。
[0091]实施例6
[0092]I种子液培养
[0093]挑取斜面菌体2环，接入到种子液中，37°C，200r.mirT1通风培养，18h后转接到固态培养基。
[0094]2固态发酵
[0095]I)固态培养基成分:水分添加量600g/kg，豆柏225g/kg，米糠75g/kg，麦芽浸粉30g/kg ;另外，培养基中分别补加苯丙酮酸(g/kg)0.45,0.9,1.4,1.8,2.1 Λ.5混匀后115°C灭菌。
[0096]2)固态培养基成分:水分添加量600g/kg，豆柏225g/kg，米糠75g/kg，麦芽浸粉30g/kg ;另外，培养基中分别补加苯丙氨酸(g/kg)0.5、1.0、1.5,2.0,3.0、4.5混匀后115°C灭菌。
[0097]3)固态培养基的培养:两种培养都按照固态培养基重量的10%接入种子液，培养基37 ± I °C，相对湿度80%左右培养，60h后取样与生理盐水以1:4的比例混合，混匀后4°C冰箱里静止4h提取苯乳酸，过膜。
[0098]3苯乳酸含量的检测以及苯丙氨酸，苯丙酮酸剩余含量的检测
[0099]苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB_C18色谱柱,流动相ImM H2SO4:乙腈为90:10 (v/v)，进样量为1(^1^，流速为0.7111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。
[0100]苯丙酮酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱，流动相为ImM H2SO4:乙腈为93:7 (v/v)，进样量为1(^1^，流速为0.4111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。
[0101]苯丙氨酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB_C18色谱柱,流动相为ImM H2SO4:乙腈为95:5 (v/v)，进样量为1(^1^，流速为0.2111171^11，柱温为301:，检测波长21011111。
[0102]结果表明:(附图8和9)可以看出苯丙酮酸和苯丙氨酸的添加有效的提高了苯乳酸的产量，但不同的是菌体对苯丙氨酸的利用比较好，其添加量为2.7g/kg时苯乳酸产量可达815mg/kg，是未添加底物时苯乳酸产量的6倍，此时苯丙酮酸的转化率也最大，为98.7% ;而对于苯丙氨酸来说，其添加量为3g/kg时，苯乳酸产量最大为752mg/kg，是未添加底物苯乳酸产量的5.5倍，转化率最大为94.9%。
[0103]实施例7凝结芽孢杆菌固态发酵饲料对高产蛋鸡产蛋性能的影响
[0104]1.将最终获得的固态发酵饲料进行动物试验，选取34周龄健康商品代海兰褐蛋鸡600随机分为5个处理组，每个处理组120只鸡，每3只鸡为I重复，即每处理组可以获得40个重复观察数据。
[0105]2.试验进行49天，采用的基础日粮组成以及营养成分见表1。
[0106]表1基础日粮配方及营养水平
[0107]
【权利要求】
1.一种生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料，由以下方法制得，凝结芽孢杆菌液体种子接入固态培养基中进行固态发酵培养，固态培养基的基本成分为豆柏，米糠，麦芽浸粉和水分，所述固态培养基中加入苯丙酮酸或者苯丙氨酸，固态发酵55-65h，发酵温度为33-38°C，发酵室内的相对湿度控制在75-80%，发酵期间每隔12h翻匀一次，固态发酵培养后获得固态发酵饲料。
2.根据权利要求1所述的生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料，其特征在于，所述固态培养基中各组分的的添加量如下:水分，豆柏，米糠，麦芽浸粉分别为500-700g/kg, 200-250g/kg, 50-100g/kg, 20_50g/kg。
3.根据权利要求1所述的生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料，其特征在于，所述固态发酵培养基接种量范围为5-15%。
4.根据权利要求3所述的生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料，其特征在于，所述固态发酵培养基接种量为10%。
5.根据权利要求1所述的生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料，所述苯丙酮酸的添加浓度为2-3g/kg。
6.根据权利要求1所述的生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料，其特征在于，所述苯丙氨酸的添加量为2.5-3.5g/kg时。
7.根据权利要求1所述的生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料，其特征在于，所述固态培养基组分和添加量如下:水分的添加量为600g/kg，豆柏225g/kg，米糠75g/kg时，麦芽浸粉30g/kg。
8.根据权利要求1所述的生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌的名称为TQ33，分类名称Bacillus coagulans，保藏编号为=CGMCCN0.5233。
9.根据权利要求1-8所述的生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料的制备方法，包括如下步骤:凝结芽孢杆菌液体种子接入固态培养基中进行固态发酵培养，固态培养基的基本成分为豆柏，米糠，麦芽浸粉和水分，所述固态培养基中加入苯丙酮酸或者苯丙氨酸，固态发酵55-65h，发酵温度为33-38°C，发酵室内的相对湿度控制在75_80%，发酵期间每隔12h翻匀一次，固态发酵培养后获得固态发酵饲料。
10.根据权利要求1所述所述的生产富含苯乳酸凝结芽孢杆菌固态发酵饲料，所述固态发酵制剂在饲料中的最佳添加浓度为0.15%。
【文档编号】A23K1/14GK103636923SQ201310544807
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】王海宽, 路福平, 张会图, 高雪芹 申请人:天津科技大学