一种新型植物育性调控构建体及其用途
【专利摘要】本发明涉及植物育种领域。具体地，本发明涉及纯合隐性核雄性不育水稻植株的育性恢复及其用途。进一步本发明涉及构建植物雄性不育系、保持系的方法以及遗传转化材料，更具体地，本发明涉及一种构建体，一种水稻细胞、组织或器官，一种构建水稻雄性不育系和保持系的方法，一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法，一种制备水稻种子的方法，一种遗传转化材料，一种用于制备杂交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。
【专利说明】一种新型植物育性调控构建体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物育种领域。具体地，本发明涉及纯合隐性核雄性不育水稻植株的育性恢复及其用途。进一步本发明涉及构建植物雄性不育系、保持系的方法以及遗传转化材料，更具体地，本发明涉及一种构建体，一种水稻细胞、组织或器官，一种构建水稻雄性不育系和保持系的方法，一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法，一种制备水稻种子的方法，一种遗传转化材料，一种用于制备杂交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。
【背景技术】
[0002]杂交育种是选育新品种主要途径，是近代育种最重要的方法，杂交种的创制、利用和产业化是国际农业跨国集团种业市场竞争的焦点。由于杂交引起基因重组，后代会出现组合双亲控制的优良性状基因型，产生加性效应，并利用某些基因互作，形成具超亲类型新个体。作物杂交育种具有巨大的发展潜力，已经成为提高粮食产量的主要途径。近几十年来，杂种优势作为一种提高作物产量、改良作物品质、提高作物抗虫、抗病、抗逆的手段已被广泛利用。利用杂种优势育种已成为许多作物的主要育种方法。而有效控制作物自花授粉、受精是获得高纯度杂交Fl种子、从而利用作物杂种优势的关键。而杂交育种中必须要解决的关键问题是(1)获得可用的不育系:一般为雄性不育(由细胞质不育或隐性核不育基因控制)；(2)杂交配组:不育系可与相应的父本植物组合生产具有优良性状的杂交后代；(3)不育系的繁殖:不育系能在一定条件下恢复育性使其得到保持。因此，作物雄性不育系的选育是杂种优势利用的关键环节。
[0003]上世纪七、八十年代，以袁隆平为代表的中国科学家们利用水稻野败型细胞质不育基因资源创制了 “三系”杂交水稻，使水稻产量提高了近20%，被称为第二次“绿色革命”，为保障我国粮食供应起到了非常重要的作用，使我国的水稻育种与生产技术处于世界领先水平，也向世人展示了杂种优势的强大作用。水稻杂交育种中常用的是“三系”和“两系”杂交。“三系”杂交需要有特定的恢复系和保持系，育种程序和生产环节复杂，选育新不育系及新组合的周期长、效率低，种质资源的利用率低于5%。另外，三系杂交粳稻优势不强，不育细胞质较单一，存在某种毁灭性病虫害暴发的潜在危险。“两系”杂交水稻由于不受恢复系、保持系之间关系的制约，亲本的遗传多样性得到明显改善，选育出高产杂交稻组合的速度明显加快，促进了超级杂交稻的研究和生产。但目前“两系”杂交中采用的不育系多为“光温敏”不育系，其育性受环境中的温度和光照影响。这些环境因素的不稳定会直接影响杂交种子的纯度和数量，加大制种风险，严重时会使企业和农民造成重大经济损失，限制“两系”杂交稻的大面积推广。而且利用目前技术所能选用的两系杂交稻不育系十分有限，例如粳稻品种中几乎没有很好的两 系杂交组合，限制了品种资源的充分利用。因而，培育不受环境影响且可自主繁殖的稳定不育系已成为限制“两系”杂交技术广泛应用的技术瓶颈。
[0004]玉米是利用杂种优势最早，且杂交种在世界上普及推广最成功的作物。玉米是雌雄异花作物，繁殖系数高的作物，杂交种生产时，在隔离区内父、母本按比例种植，母本雄穗刚露出时拔掉，父本花粉自由授粉杂交。玉米杂交优势的利用及生产上应用杂交种，使得玉米生产水平产生了巨大变化。但是，玉米杂交种生产中存在着常用育种的亲本遗传基础差异不够大，并因此影响到主要育种目标如高产、稳产、抗逆、早熟等的尽快实现。同时，在杂交种生产过程中，存在着母本去雄工作繁重且不彻底、进而影响杂交种产量和质量不稳定的问题，急待解决。
[0005]杂种优势在双子叶植物如烟草和油菜的生产中也得到应用。油菜是世界的第三大油料作物，而中国油菜总产和面积占世界三分之一，是最大的油菜生产国，中国的油菜杂种优势利用处于世界领先水平。油菜中常用的杂交育种也是基于细胞质不育和细胞核不育两大类，存在“三系”和“两系”杂交育种，因此，与水稻中一样，存在同样的种质资源利用率低、杂交种纯度较低的问题。
[0006]因而，目前的植物杂交育种技术仍有待改进。
【发明内容】
[0007]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能够有效构建新型稳定的水稻雄性不育系和相应保持系并充分利用水稻种质资源用于杂交育种、提高杂交种纯度的手段。
[0008]在本发明的第一方面，发明人提出了一种调控植物育性的方法，具体方案描述为:本发明以植物纯合隐性核雄性不育突变体为转化受体材料创制一种新型保持系。通过将紧密连锁的2个目标基因(育性恢复基因和颜色筛选基因)转化至纯合隐性不育受体植株中。其中，育性恢复基因可使转化受体育性恢复，通过转化受体自交结实可分离得到外源基因(即上述2个目标基因)纯合的转基因种子，进一步培育成为植株，与不育系授粉杂交得到杂合转基因种子，进一步培育为植株作为保持系；保持系可以产生等量的两类花粉，一半为含有转基因，另一半为不含有转基因。将保持系作父本与纯合隐性不育系授粉杂交后，结实产生两类种子，一类为含有转基因的种子，另一类为不含转基因的种子，筛选基因可以用于两类种子的分拣，分拣出`的非转基因种子用作繁育不育系生产杂交种，转基因种子仍可继续用作保持系，与不育系杂交以源源不断地、稳定地生产不育系。
[0009]本发明中所述的“保持系”的定义是将构建体转化植物纯合隐性核雄性不育突变体后，产生的含有植物隐性核雄性不育基因和外源基因(即构建体含有的2个目的基因)的后代植株或种子，其中植物隐性核雄性不育基因位点为隐性纯合状态，外源基因(即2个目的基因)位点为转基因杂合状态。
[0010]本发明所述的育性恢复基因可分离自任何植物，所述育性调控方法可应用于任何植物，所述植物包括但不限于玉米(Zea mays)、芥菜(Brassica napus, Brassicarapassp.)、紫花首猜(Medicago sativa)、7_K稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高梁(Sorghum bicolor, Sorghum vulgare)、向曰葵(Helianthus annuus)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、黍(Panicumspp.)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)红薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananas comosus)、橘树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鱼尋梨(Persea americana)、无花果(Ficuscasica)、番石槽(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、撤揽(Olea europaea)、燕麦(Avena sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、油菜(Brassica napus)蔬菜、装饰植物和针叶树。优选地，植物包括玉米、大豆、向日葵、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、紫花苜蓿、水稻、棉花、油菜和高粱。
[0011]本领域技术人员应该知晓，本发明中所提到的雄性不育是指雄配子不能正常发育的现象，一旦形成，是可遗传的，该种雄性不育的植株，雌蕊能正常发育。本发明中所提到的雄性不育基因，是指导致雄配子不能正常发育的关键基因之一被突变、遏制或受到其它影响所造成的结果，其野生型序列结构可作为雄性不育恢复基因。
[0012]为了更好的实施本方案，所述雄性不育为完全不育，即不育株花粉完全无活性或彻底无花粉，育性恢复基因最好有彻底恢复育性的恢复能力(即将完全不育植株的育性恢复至90%以上)。
[0013]到目前为止，已经文献发表公开的育性基因有很多，其中包括Arabidopsis ABORTED MICROSPORES (AMS)基因，Sorensen et al., The PlantJournal (2003)33 (2):413-423) ；Arabidopsis MSI 基因(Wilson et al., ThePlant Journal(2001)39(2):170-181) ；NEF1 基因(Ariizumi et al., The PlantJournal(2004)39(2):170-181) ；Arabidopsis AtGPATl 基因(Zheng et al., ThePlant Cell (2003) 15:1872-1887) ；Arabdiopsis dde2_2 突变(其显示出丙二烯氧化物合酶(syntase)基因的缺陷)(Malek et al.，Planta(2002) 216:187-192)；Arabidopsis 匿名(faceless)花粉-1 基因(flpl) (Ariizumi et al, Plant Mol.Biol.(2003)53:107-116) ；Arabidopisis MALE MEIOCYTE DEATHl 基因(Yang et al., ThePlant Cell (2003) 15:1281-1295);绒毡层特异性锌指基因 TAZl (Kapoor et al., ThePlant Cell (2002) 14:2353-2367)和 TAPETUM DETERMINANT1 基因(Lan et al, The PlantCell (2003) 15:2792-2804)。
[0014]本发明所述的颜`色筛选基因，包括但不限于红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙Pi基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因。
[0015]本领域技术人员应该知晓，在获得任意一个纯合隐性核雄性不育突变体材料，及其相应的雄性不育恢复基因后，均可应用本发明所公开的方案构建含有育性恢复基因和颜色筛选基因的载体，转化相应的纯合隐性核雄性不育突变体植物材料，通过转化受体自交结实可分离得到外源基因(即育性恢复基因和颜色筛选基因)纯合的转基因种子，进一步培育成为植株，与不育系授粉杂交得到杂合转基因种子，进一步培育成为植株作为保持系；其中获得的保持系可以继续与不育系杂交用于生产不育系和相应的保持系，以获得稳定分离的50%的保持系和50%的不育系，获得的不育系可直接用于杂交制种。
[0016]在本发明的第二方面，具体地，发明人提出了一种调控水稻育性的方法，具体方案描述为:发明人以纯合隐性核雄性不育水稻突变体为转化受体材料创制一种新型保持系。通过将紧密连锁的2个目标基因(育性恢复基因和颜色筛选基因)转化至纯合隐性不育受体植株中。其中，育性恢复基因可使转化受体育性恢复，通过转化受体自交结实可分离外源基因纯合的转基因种子，进一步培育成为植株，与不育系授粉杂交得到杂合转基因种子，进一步培育成为植株作为保持系；保持系可以产生等量的两类花粉，一半为含有转基因，另一半为不含有转基因。将保持系作父本与纯合隐性不育系授粉杂交后，结实产生两类种子，一类为含有转基因的种子，另一类为不含转基因的种子，颜色筛选基因可以用于两类种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，而转基因种子仍可继续用作保持系，与不育系杂交以源源不断地、稳定地生产不育系。
[0017]更具体地，，本发明可以水稻核隐性不育ms26 / ms26突变体为遗传转化受体材料，将紧密连锁的2个目标基因(Ms26即0sCYP704B2和荧光色选基因)遗传转化至上述受体材料，目标基因之一的育性恢复基因0sCYP704B2 (对应野生型Ms26基因)可使转化受体育性恢复，通过自交结实，可分离外源基因纯合的种子，进一步培育为转基因植株，与不育系授粉杂交使不育系育性恢复，并结实得到转基因杂合的种子，进一步培育为植株，即为，稳定的保持系(mS26/mS26，转基因杂合);另一目标基因即荧光色选基因用于保持系与相应的不育系授粉杂交后，不育系植株上结实的转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子继续用作保持系与不育系进行授粉杂交以源源不断地稳定地生产不育系和保持系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。 [0018]在本发明的第三方面，本发明提出了一种调控植物育性的构建体，该构建体包括:第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码植物雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码筛选基因(如荧光色选基因)。利用该构建体，能够有效地将植物雄性不育恢复基因和筛选基因引入到植物纯合隐性核雄性不育突变体植株中，通过自交结实，可分离外源基因纯合的转基因种子，进一步培育为植株，与不育系授粉杂交得到转基因杂合的种子，进一步培育为植株，即为稳定的保持系，不携带外源基因的种子及植株作为不育系。由此，可以有效地用于植物杂交育种。
[0019]其中，所述的第一表达盒还可以进一步包括:第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地相连，所述第一启动子为雄配子发育过程中的特异性启动子，具体的所述雄配子特异性启动子可以启动所连接的第一核酸分子特异性地在雄配子中的表达并可以恢复上述纯合隐性核雄性不育水稻突变体的育性；以及第一终止子，所述第一终止子与所述第一核酸分子可操作地相连。
[0020]在本发明的一个实施例中，所述第二表达盒进一步包括:第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地相连，所述第二启动子为愈伤组织和/或种子、种皮、胚和胚乳等特异性的启动子；第二终止子，所述第二终止子与所述第二核酸分子可操作地相连。
[0021]在本发明的第四方面，具体的，本发明提出了调控水稻育性的构建体，该构建体包括:第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码筛选基因(如荧光色选基因)。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和筛选基因引入到纯合隐性核雄性不育水稻突变体植株中，通过自交结实，可分离外源基因纯合的转基因种子，进一步培育为植株，与不育系授粉杂交得到转基因杂合种子，进一步培育为植株，即为稳定的保持系，不携带外源基因的种子作为不育系。由此，可以有效地用于水稻杂交育种。
[0022]其中，所述调控水稻育性的构建体的第一表达盒还可以进一步包括:第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地相连，所述第一启动子为雄配子特异性启动子，具体的所述雄配子特异性启动子可以启动所连接的第一核酸分子特异性地在雄配子中的表达，并可以恢复上述纯合隐性核雄性不育水稻突变体的育性；以及第一终止子，所述第一终止子与所述第一核酸分子可操作地相连。具体地，根据本发明的实施例，对于育性恢复基因0sCYP704B2 (Ms26)，可以采用0sCYP704B2的内源启动子、ORF区或基因组序列及终止区的序列，均为野生型水稻基因组序列。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第一终止子具有如SEQID NO:12所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，利用该启动子和终止子的组合，能够显著地提闻表达相应蛋白的效率，进而能够提闻利用该构建体构建保持系和不育系的效率，并且能够更有效地使水稻mS26/mS26不育受体植株的育性得到恢复。
[0023]其中，所述调控水稻育性的构建体的第二表达盒进一步包括:第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地相连，所述第二启动子为愈伤组织和/或种子、种皮、胚和胚乳等特异性的启动子；第二终止子，所述第二终止子与所述第二核酸分子可操作地相连。具体地，在本发明的一个实施例中，所述第二启动子包括一个35S增强子和LTP2启动子，其中35s增强子具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列，LTP2具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第二终止子具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，RFP (r)的开放读码框连接于来自大麦且为愈伤组织和种子(种皮)特异性启动子LTP2和来自马铃薯的终止子PIN II之间，在LTP2启动子前还有一个来自烟草花叶病毒的35S增强子序列，重组成RFP(r)基因表达盒(35S::LTP2:: RFP(r):: PINII)。含有该表达框的水稻愈伤及种子在荧光激发下呈现非常容易辨认的红色，因此该表达框在本发明中用于遗传转化的筛选标记和用于辨认和分选保持系和不育系种子。
[0024]由此，可以通过常`规技术，将前述构建体引入到相应的植物细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第五方面，本发明提出了一种植物细胞、组织或器官。根据上述内容可知，该植物细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。
[0025]在本发明中，所述将核苷酸序列或构建体“引入”到植株，表示可通过直接转化的方法获得，如对植物细胞、组织或器官进行农杆菌介导的转化、微粒轰击、电穿孔，或本领域技术人员已知的多种方法的任何一种；或者，可通过将具有异源核苷酸序列的植株与另一植株杂交来获得，使其后代具有该异源核苷酸序列。具体地，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，本发明提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该水稻细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。
[0026]在本发明的第六方面，本发明提出了一种构建植物雄性不育系和保持系的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到第一植物纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子，通过自交结实，可分离得到外源基因纯合的转基因种子，并进一步培育成为植株与不育系授粉杂交，使不育系恢复结实，得到的种子遗传背景与第二植株相同(即纯合隐性雄性不育基因位点，杂合外源基因位点)，使该第二植株得到扩繁，从而构建为稳定的保持系；将所述第二植株或由第二植株扩繁后得到的保持系(即纯合隐性雄性不育基因位点，杂合外源基因位点)与不育系授粉杂交，使不育系植株恢复结实，产生一半的不携带外源基因的种子，从而构建植物雄性不育系。进一步，所构建的保持系可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，与不育系授粉杂交后，使不育系植株恢复结实，获得两类分别携带和不携带外源基因的种子。其中，携带外源基因的种子作为保持系，可以与不育系杂交源源不断地继续生产不育系和保持系，而不携带外源基因的植株可以作为不育系用作杂交的亲本。
[0027]在本发明的第七方面，具体地，本发明提出了一种构建水稻雄性不育系和保持系的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子，通过自交结实，可分离得到外源基因纯合的转基因种子，并进一步培育成为植株与不育系杂交，使不育系恢复结实，得到的种子遗传背景与第二植株相同(即纯合隐性雄性不育基因位点，杂合外源基因位点)，使该第二水稻植株得到扩繁，从而构建为稳定的保持系；将所述第二水稻植株或由第二水稻植株扩繁后得到的保持系(即纯合隐性雄性不育基因位点，杂合外源基因位点)与不育系授粉杂交，使不育系植株恢复结实，产生一半的不携带外源基因的种子，从而构建水稻雄性不育系。进一步，所构建的保持系可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，与不育系授粉杂交后，使不育系植株恢复结实，获得两类分别携带和不携带外源基因的种子。其中，携带外源基因的种子作为保持系，可以与不育系杂交源源不断地继续生产不育系和保持系，而不携带外源基因的植株可以作为不育系用作杂交的亲本。由此，可以有效地用于水稻杂交。
[0028]在本发明的第八方面，本发明提出了一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。
[0029]在本发明的第九方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:将前面所述的构建体引入到水稻植株中；以及将所述水稻植株自交，可分离得到外源基因纯合的转基因种子，并进一步培育成为植株与与不育系杂交，以获得含有前面所述的构建体的种子。
[0030]在本发明的第十方面，本发明提出了一种水稻转化材料。根据本发明的实施例，该水稻转化材料的基因组中包含选自SEQ ID NO:3和9至少一种DNA序列。由此，根据本发明的实施例，本发明提出了一种植物材料，其中，所述植物材料的基因组中包含了选自SEQID NO:3和9的至少一种DNA序列或其互补序列。并且本发明提出了由该植物衍生得到的种子、细胞和组织。
[0031]在本发明的第十一方面，本发明提出了一种用于制备杂交水稻的方法。根据本发明的实施例，该方法采用新型水稻雄性不育系和保持系，该新型水稻雄性不育系和保持系是通过前面构建水稻雄性不育系和保持系的方法构建的。 [0032]在本发明的第十二方面，本发明提出了水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。根据本发明的实施例，所述水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。
[0033]在本发明的又一方面，本发明还提出了一种构建水稻雄性不育系的方法，其是利用分子标记和杂交创制新型水稻不育系。根据本发明的实施例，该方法包括:采用水稻ms26/ms26雄性不育植株作为母本，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因；将所述母本与轮回亲本进行回交转育，以便获得具有所述轮回亲本性状的水稻雄性不育系，其中，所述轮回亲本不具有Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，利用本发明的方法，可以在ms26纯合隐性雄性水稻不育系的基础上，开发更多的不同遗传背景的不育系。根据本发明的实施例，利用常规回交育种方法，所有不同类型的水稻都可以创制成相应的不育系，使杂种优势资源利用率达到95%以上。
[0034]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0036]图1为根据本发明一个实施例的植物表达载体pZNl的结构示意图，其中，自右边界(RB)到左边界(LB)，依次包含了 0sCYP704B2基因表达框，35S增强子::Ltp2启动子::红色荧光蛋白基因(RFP): ιΡΙΝΙΙ终止子表达框；
[0037]图2为根据本发明一个实施例的植物表达载体pZNl的构建示意图；
[0038]图3显示了 根据本发明一个实施例，水稻核隐性不育ms26 / ms26突变体为遗传转化的受体材料，通过转化图1和图2的构建体所得到的转化体通过自交结实，可分离得到外源基因纯合的转基因种子(图3-1 )，并进一步培育成为植株与不育系授粉杂交扩繁(图3-2)，得到外源基因杂合的转基因种子培育成植株后进一步与不育系杂交，使不育系恢复结实得到不育系和保持系的示意图(图3-3)；
[0039]图4显示了根据本发明一个实施例的保持系与不育系授粉杂交后，不育系植株结实产生的突光种子和非突光种子的结果；
[0040]图5显示根据本发明一个实施例，通过分子标记辅助筛选(MAS)的方法来通过回交转育构建不育系的流程示意图。
[0041]图6显示在载体的荧光基因的启动子前增加了 35S增强子(35S enhancer)后，该载体产生的种子的荧光强度都要远远高于不增加35S增强子序列的其他载体的转基因种子，其中LTP2为启动子，RFP为红色荧光蛋白基因。
[0042]发明详细描述
[0043]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0044]本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。
[0045]除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。
[0046]术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0047]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人以水稻纯合核隐性不育突变体为遗传转化受体材料，通过将紧密连锁的2个目标基因转化至不育系，其中，育性恢复基因可使转化受体及保持系育性恢复，筛选基因可以用于保持系与不育系杂交后，不育系植株结实的转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系与不育系授粉杂交来源源不断地、稳定地生产不育系和保持系。例如，根据本发明的一个实施例，可以以水稻纯合核隐性不育ms26 / ms26突变体为转化受体材料，将紧密连锁的2个目标基因转化至不育系:育性恢复基因0sCYP704B2 (Ms26)可使转化受体及保持系育性恢复，荧光色选基因用于保持系与不育系杂交后，不育系结实中的转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系与不育系杂交来源源不断地、稳定地生产不育系和保持系。该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。
[0048]由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括:第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码筛选基因。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和筛选基因引入到水稻植株例如水稻纯合隐性雄性不育植株中，从而得到携带外源基因的可育株经过自交结实，分离出外源基因纯合的种子培育成植株后，与不育系授粉杂交扩繁后使不育系结实而收获的种子，可以作为保持系，不携带外源基因的不育系种子及其植株可以用作杂交之中的亲本。由此，可以有效地用于水稻杂交。
[0049]在本文中，构建体的形式不受特别限制，根据本发明的具体示例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体(有时也称为表达载体、遗传载体`或载体)呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。根据本发明的实施例，可以采用Ti载体，例如可以采用将第一和第二表达盒设置在表达载体PZNl的T-DNA之左右边界之间。由此，可以通过农杆菌介导的转化方法将第一和第二表达盒转化至受体植株，例如水稻ms26/ms26隐性核雄性不育突变体中，由此，可以获得不含除草剂抗性标记基因和抗生素抗性标记基因的水稻转基因株系，经过自交结实，并按照本发明的方法进一步扩繁后获得稳定的保持系，如此获得的保持系有如下特点:(I)保持系产生两类花粉，一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因；(2)保持系与不育系杂交，不育系可结实，所结可育种子与不育种子的比例为1:1，可育株(带有外源基因)用作保持系，可以通过与不育系杂交方便地、源源不断地生产不育系和保持系，不育株(不含转基因成分)在生产上用作杂交制种的亲本；(3)因为不育株不含转基因，因此用其生产的杂交种子不含转基因，用此杂交种生产的水稻商品粮食更不含转基因，从而消除了转基因生物安全的隐患。该新型杂交育种体系充分利用水稻杂种优势，提供了切实可行的技术新突破。
[0050]在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的载体，优选核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
[0051]根据本发明的实施例，水稻雄性不育恢复基因的类型并不受特别限制，可以采用但不限于Ms26，Ms22，Ms45，Msl，等等。在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，其编码具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的蛋白质。即，可以采用的水稻雄性不育恢复基因为0sCYP704B2(Ms26)，由此，可以将其作为水稻受体ms26/ms26纯合突变体(完全雄性不育)的野生型育性恢复基因。0sCYP704B2基因编码的蛋白属于细胞色素P-450家族，在花药发育的P8到PlO阶段的绒粘层和小孢子中特异表达。该基因突变后会导致绒粘层膨胀，花粉外壁残缺而发育终止及花药角质层终止发育，从而导致植株雄性不育，而雌性育性正常。进一步的化学成分分析发现，在该基因缺失突变体的花药中，几乎检测不到角质单体，进而发现该基因的功能是催化产生含有16和18个碳链的羟基脂肪酸。
[0052]根据本发明的具体实施例，在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因0sCYP704B2 (Ms26)具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。与野生型的0sCYP704B2(Ms26)基因相比，SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列分别引入了三个单核苷酸突变，但不改变其编码的氨基酸序列，这三个单核苷酸突变在0sCYP704B2基因编码区上的位置及具体突变分别为:238位核苷酸A突变为C ；240位的核苷酸G突变为C ；243位的核苷酸G突变为C。发明人惊奇地发现，利用该SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列能够便于在各种分子鉴定中区别外源基因与内源基因，并且能够更有效地使水稻mS26/mS26不育受体植株的育性得到恢复。水稻受体ms26/ms26纯合突变体是经过辐射诱导所得，突变是由3103bp缺失(包含0sCYP704B2大部分片段)导致(缺失区段物理位置:ensembl plants oryza japonica groupversion64.6 (MSU6) chromosome3:3, 701, 319-3，704, 421)。大片段缺失突变使回复突变的概率极低，因此不育性状稳定，从而保障了不育系的稳定性，降低杂交制种风险。
[0053]在本发明的一个实施例中，所述第一表达盒还可以进一步包括:第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地相连，所述第一启动子为雄配子特异性启动子；以及第一终止子，所述第一终止子与所述第一核酸分子可操作地相连。根据本发明的实施例，第一启动子和第一终止子的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，对于0sCYP704B2 (Ms26)基因，可以采用0sCYP704B2的内源启动子、ORF区或基因组序列及终止区的序列，均为野生型水稻基因组序列。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子具有如SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第一终止子具有如SEQID NO: 12所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，利用该启动子和终止子的组合，能够进一步显著地提高表达相应蛋白的效率，进而能够提高利用构建体构建保持系和不育系的效率，并且能够更有效地使水稻mS26/mS26不育受体植株的育性得到恢复。
[0054]另外，根据本发明的实施例，构建体还可以进一步包括:第二表达盒，所述第二表达盒包含第二核酸分子， 所述第二核酸分子编码筛选基因，所述筛选基因为发光基因。由此，便于通过筛选基因的表达来确定植物及其部分是否含有构建体所引入的基因。[0055]根据本发明的实施例，可以采用选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙Pi基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因的至少一种作为筛选基因，但不限于这些可以作为筛选的基因。在本发明的一个实施例中，可以采用红色荧光蛋白作为筛选基因。红色荧光蛋白基因(RFP)，来源于礁珊瑚(Discosoma sp.),是表达框内唯一非粮食作物来源的基因序列。红色突光蛋白最大吸收波长为558nm,最大发射波长为583nm。将RFP编码的氨基酸序列通过与过敏原及毒蛋白序列比对显示，相似性极低，无毒性及致敏性。RFP常用作遗传转化的筛选基因，从未发生过转基因生物安全事题。在本发明的一个实施例中，所述筛选基因RFP具有如SEQ ID N0:3所述的核苷酸序列。SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列与野生型RFP基因(其核苷酸序列如SEQID NO:4所示)相比，具有两个单核苷酸突变，命名为RFP (r)。这两个单核苷酸突变分别为:由第21位碱基C转换为G、由第315位碱基G转换为C。发明人惊奇地发现，这两个位点的突变可以更加有效地表达红色荧光蛋白，增强红色荧光蛋白基因在水稻中的表达。
[0056]在本发明的一个实施例中，所述第二表达盒进一步包括:第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地相连，所述第二启动子为愈伤组织和/或种子、种皮、胚和胚乳等特异性的启动子；第二终止子，所述第二终止子与所述第二核酸分子可操作地相连。在本发明的一个实施例中，所述第二启动子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第二终止子具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，RFP(r)的开放读码框连接于来自玉米且为愈伤组织和种子(种皮)特异性启动子LTP2和来自马铃薯的终止子PIN II之间，在LTP2启动子前还有一个来自烟草花叶病毒的35S增强子序列，重组成RFP(r)基因表达盒(35Senhancer::LTP2::RFP(r):: PINII)。含有该表达框的水稻愈伤及种子在荧光激发下呈现非常容易辨认的红色，因此该表达框在本发明中用于遗传转化的筛选标记和用于辨认和分选保持系和不育系种子。
[0057]由此，根据本发明的实施例，可以利用根据本发明的实施例的构建体，以纯合隐性核雄性不育水稻(mS26/mS26)作为转化的受体，进行遗传转化，得到整合含有以下紧密连锁的两个外源基因RFP (r)和`Ms26 (0sCYP704B2育性基因)的水稻植株，进一步经过自交结实、扩繁后获得保持系。外源基因的插入与内源纯合隐性核雄性不育位点(mS26/mS26)是非连锁的，因此得到的转基因水稻保持系含有独立的纯合的mS26/mS26隐性不育位点及杂合的外源基因(包括RFP (r)和0sCYP704B2基因)整合位点。
[0058]由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该水稻细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。在本发明的一个实施例中，所述水稻细胞、组织或器官来自水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，本发明的水稻细胞、组织或器官，可以有效地用于构建保持株并进一步与不育株杂交。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该水稻细胞、组织或器官，不再赘述。
[0059]由此，在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建水稻保持系并进一步生产雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，参考图3，该方法包括:[0060]第一步:将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源目的基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子，并且第二水稻植株中的外源目的基因处于杂合状态；
[0061]第二步，进而培育所得到的第二水稻植株，使其自交后结实，可以获得25%的种子为ms26/ms26纯合隐性和外源目的基因纯合背景和50%的种子为ms26/ms26纯合隐性和外源目的基因杂合背景(即为保持系种子)，种子发芽后，通过基因组PCR及定量PCR可以将此两类种子鉴定出来；
[0062]第三步，培育第二步得到的25%的mS26/mS26纯合隐性和外源目的基因纯合背景的种子为植株，自交扩繁，所结实的种子全部为mS26/mS26纯合隐性和外源目的基因纯合
背景 ；
[0063]第四步，培育第三步得到的种子为植株，该植株产生的全部花粉都含有外源目的基因，通过为纯合隐性雄性不育系植株授粉杂交，可以使不育系恢复结实，所得到的种子全部为mS26/mS26纯合隐性和外源目的基因杂合背景，即为保持系种子；通过第三步和第四步使得保持系种子得到扩繁；
[0064]第五步，培育第四步的保持系种子为植株(背景为mS26/mS26纯合隐性突变位点和外源目的基因杂合)，也可以培育第二步得到的50%的背景为mS26/mS26纯合隐性和外源目的基因杂合的种子(保持系)为植株，保持系植株产生的花粉一半含有外源目的基因，一半不含外源目的基因，与纯合隐性雄性不育系植株授粉杂交后，雄性不育系植株恢复结实，并产生两类种子，其中一半含有外源目的基因为红色荧光种子(背景为mS26/mS26纯合隐性突变位点和外源目的基因杂合)，可以进一步作为保持系与不育系授粉杂交生产不育系及保持系种子，另一半不含有外源目的基因为非荧光正常种子(背景为mS26/mS26纯合隐性突变位点和不含有外源目的基因成分)，可以进一步作为不育系进行杂交育种。两类种子根据其有无荧光可以方便地通过色选仪检测并分选出来。
[0065]根据本发明的实施例，第一水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。另外，根据本发明的实施例，可以通过荧光检测进行种子分拣，即通过检测水稻种子是否携带发光基因，例如是否发出荧光来进行分拣，区分其是否携带外源基因，如图4所示。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0066]在本发明的第四方面，本发明提出了一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0067]在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:将前面所述的构建体引入到水稻植株中，进一步自交结实、再经过扩繁为保持系；将所述水稻保持系与不育系授粉杂交，以在不育系植株上获得两类种子，即含有前面所述的构建体的保持系种子和不含前述构建体的不育系种子。在本发明的一个实施例中，所述水稻植株为水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。
[0068]在本发明的第六方面，本发明提出了一种遗传转化材料。根据本发明的实施例，所述遗传转化材料是通过将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中获得的。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。在本发明的一个实施例中，通过农杆菌介导法引入所述构建体。
[0069]在本发明的第七方面，本发明提出了一种用于制备杂交水稻的方法。根据本发明的实施例，所述水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。该方法采用水稻雄性不育系，可以进一步进行水稻杂交，提高水稻杂交的效率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0070]在本发明的第八方面，本发明提出了水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。根据本发明的实施例，所述水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。由此，可以进一步利用本发明的水稻雄性不育系进行水稻杂交，提高水稻杂交的效率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该用途，不再赘述。
[0071]在本发明的又一方面，本发明还提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，该方法包括采用水稻纯合隐性雄性不育植株作为母本，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含ms26基因的纯合隐性等位基因；将母本与轮回亲本进行回交转育，以便获得具有所述轮回亲本性状的水稻雄性不育系，其中，所述轮回亲本不具有Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，利用本发明的方法，可以在ms26纯合隐性雄性水稻不育系的基础上，发展更多的不同遗传背景的不育系。根据本发明的实施例，利用常规回交育种方法，所有不同类型的水稻都可以创制成相应的不育系(即可以源源不断地生产相应的不育系品种)，使杂种优势资源利用达到95%以上。
[0072]根据本发明的实施例，可以作为轮回亲本的品系不受特别限制，根据具体的实施例，轮回亲本可以具有选自配合力强、株型好、抗病、抗虫和高产的至少一种性状。由此，可以获得具有这些性状的雄性水稻不育系。根据本发明的实施例，轮回亲本可以为选自天丰、华 268、华恢 624、华 211、华恢 3411、华恢 451、华恢 2855、R608、华恢 374、华恢 3501、H451、R608、华占、黄华占、H268、H819、沪闽粳等的至少一种。
[0073]根据本发明的具`体实施例，参考图5，可以通过分子辅助筛选(MAS)的方法来通过回交转育构建不育系。具体地，如图5所示，根据本发明的实施例，将所述母本与轮回亲本进行至少3次回交。另外，在进行回交的过程中，可以通过分子标记辅助进行前景选择和背景选择。
[0074]进一步，根据本发明的实施例，上述构建水稻雄性不育系的方法可以包括下列步骤:
[0075]首先，将ms26/ms26突变体(MS26纯合隐性雄性水稻不育系)与轮回亲本进行杂交，得到杂交Fl ；
[0076]接下来，将Fl与轮回亲本进行回交，得到BClFl ；
[0077]接下来，将BClFl与轮回亲本进行回交，得到BC2F1 ；
[0078]接着，将BC2F1进行自交，得到BC2F2 ；
[0079]接着，将BC2F2与轮回亲本进行回交，以便得到BC3F1 ；
[0080]最后，将BC3F1进行自交，得到新构建的不育系BC3F2。
[0081]根据本发明的实施例，可以通过分子标记对回交和自交产物进行前景(ms26和外源基因)选择和背景选择(轮回亲本)，以加速新型不育系的创制。根据本发明的实施例，用于回交转育的水稻纯合隐性雄性不育植株可以是通过前面所述的构建不育系的方法构建获得的。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0082]需要说明的是，根据本发明实施例的构建体及其用途是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。【具体实施方式】述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0083]下面根据具体的实施例对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。另外，除非特别说明，在下面的实施例中所涉及的方法为常规方法，所涉及的材料和制剂也为市售可得的。
具体实施例
[0084]若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0085]实施例1:水稻育性调控载体构建
[0086]通过装配下述DNA元件，构建图1所示的被称为pZNl的表达载体:
[0087]第一步:人工合成LTP2::RFP::PINII序列，其DNA序列如SEQ ID N0:1所示。PCR扩增人工合成的Pin I1-RFP(2SNP)-ltp2序列，扩增引物为:
[0088]Fi:ctt Igccggc丨 cgcattcgcaaaacacacctagac ；方框内为限制性内切酶 Nae I 酶切位点； [0089]Rl: CAA |GTTTAAAC| ATTGCAGTAC jGGCGCGC^ AACCGTCTCTTCGTGAGAATAACCG，方框内分别为Pme I和Asc I酶切位点.[0090]扩增得Pin I1-RFP (2SNP)-ltp2 片段(SEQ ID NO:1)连 T 测序正确后，用 Nae I和 Pme I
[0091]双酶切连入Xmn I与Pme I酶切的pCAMBIA1300质粒，鉴定正确即得中间载体1.[0092]第二步:从水稻基因组DNA中，分别扩增cypl和cyp2，cypl的扩增引物为:
[0093]F2:TAT ^GCGCGCC] GATTGGTCGAACACGAGGTAGGCG,方框内为 Asc I 酶切位点;
[0094]R2: TCGAAGGACCGCACCGTGACC |GTCGAC| ATG，方框内为 Sal I 酶切位点，阴影碱基
为为了区分水稻内源CYP序列同时使用水稻使用频率高的密码子而特意引入的三个SNP)，
[0095]cyp2扩增引物为:
[0096]F3: CAT '|GTCGAC[ GGTCACGGTGCGGTCCTTCGA，方框内为 Sal I 酶切位点，阴影碱基为为了区分水稻内源CYP序列同时使用水稻使用频率高的密码子而特意引入的三个SNP;
[0097]R3: ATA j3TTTAAAC| AGGTGGAAGACAAGGTGGTGAGGAT，方框内为 Pme I 酶切位点)两
个片段，连T-载体测序正确后，再分别用AscI，Sal I和Sal I7Pme I双酶切，同时连入用Asc I，Pme I双酶切的中间载体1，鉴定正确即得中间载体2。
[0098]第三步:PCR扩增人工合成的35S增强子序列，扩增引物为:
[0099]F4:TT Xi(,(.’(,UK.(’.ATCACATCAATCCACTTGCTTTGA，方框内为 Asc I 酶切位点;[0100]R4:GA ^GCGCGCC CGTCAACATGGTGGAGCACGACAC,方框内为 Asc I 酶切位点，扩
增得35S增强子片段连T测序正确后，用Asc I酶切后连入Asc I酶切开的中间载体2，鉴定正确即得载体PZN1。
[0101]实施例2:保持系的获得、扩繁及不育系的生产及原理
[0102]通过设计并验证，本发明提供了一种构建水稻保持系，并进一步生产雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，参考图3，该方法包括:
[0103]第一步:将实施例1所述的构建体(含有育性恢复基因和色选基因表达框)通过遗传转化引入到水稻纯合隐性雄性不育植株(mS26/mS26)中，获得携带外源基因的TO代水稻植株能够产生可育雄性配子，并且TO代转基因植株的外源基因处于杂合状态(图3-1)；
[0104]第二步，培育第一步所得到的TO代转基因植株，使其自交后结实，获得的Tl代种子根据遗传背景可分为三类，其中25%的种子为mS26/mS26纯合隐性和外源基因纯合背景，50%的种子为mS26/mS26纯合隐性和外源基因杂合背景(可直接作为保持系，进入以下第五步与不育系杂交)，还有25%的种子为ms/ms纯合隐性雄性不育且不含有转基因；通过种子荧光色选将不含有外源基因的25%的非荧光种子分离出来，并进一步培育其它的75%的所有荧光种子发芽后，通过提取幼苗叶片的基因组DNA，进行基因组PCR或Q-PCR技术可以将两类含有外源基因成分的种子或幼苗分别鉴定出来(图3-1)；
[0105]第三步，培育第二步中25%的ms26/ms26纯合隐性和外源基因纯合背景的Tl代种子或幼苗为Tl代植株，通过自交后结实的T2种子全部为mS26/mS26纯合隐性和外源基因纯合背景，为红色荧光种子；
[0106]第四步，培育第三步中T2代种子为T2代植株，这些植株均为mS26/mS26纯合隐性和外源基因纯合背景，通过这`些植株为纯合隐性雄性不育系植株授粉杂交，可以使不育系植株恢复正常结实，得到的种子全部为mS26/mS26纯合隐性和外源基因杂合背景，为红色荧光种子，即为保持系，由此通过第三步和第四步得以快速扩繁保持系的种子(图3-2)；
[0107]第五步，培育第四步的保持系种子为植株(背景为mS26/mS26纯合隐性和外源基因杂合)，也可以同时培育第一步中产生的50%的背景为mS26/mS26纯合隐性和外源基因杂合的保持系种子为植株，这些来源的保持系产生的花粉一半含有外源基因，另外一半不含外源基因，与纯合隐性雄性不育系植株授粉杂交，使雄性不育系得以结实，产生的种子中一半即50%含有外源基因且为红色荧光种子(背景为ms26/ms26纯合隐性突变位点和外源基因杂合)，可以进一步作为保持系；另一半50%不含有外源基因且为正常颜色的非荧光种子(背景为mS26/mS26纯合隐性突变位点和不含有转基因成分)，即为不育系。这两类种子可以通过色选仪分选出来，含有荧光的种子作为保持系重复第四步的实验，可以继续扩繁得到等量保持系和不育系的种子，而不含外源转基因的非荧光种子被作为不育系进行杂交育种或制种(图3-3) ο
[0108]实施例3:水稻转化
[0109]利用热激法将质粒pZNl转入农杆菌AGLO菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化，具体的转化受体材料为水稻ms26/ms26完全雄性不育纯合突变体，关于该材料的具体描述见中国专利CN200910309083.1 以及The Plant Cell Vol.22:173-190，2010年 I 月，该材料目前公众是可以获取的，通过将这两篇文献参照并入本文。通过遗传转化过程得到PZNl载体的水稻转基因材料。[0110]需要说明的是，也可以通过常规的基因敲除的方法，将水稻Ms26基因全部或部分敲除后，得到水稻ms26/ms26完全雄性不育纯合突变体。
[0111]实施例4:T0代转基因植株所结实的种子分离比分析
[0112]通过实施例3得到的TO代转基因幼苗(背景为mS26/mS26纯合隐性和外源基因杂合)，经过实验室炼苗，同时通过提取幼苗叶片基因组DNA，并利用定量PCR初步鉴定转基因拷贝数后，选择外源基因为单拷贝插入的植株，移栽到大棚和田间进行培育，与非转基因对照植株(野生型非转基因水稻品种武运粳7号)进行表型比较分析，二者之间没有观察到明显的形态上的不同，且转基因植株的雄性育性得到恢复。结实后分单株单穗收获，随机选取30个植株的分别30个单穗，分析了荧光种子与非荧光种子的分离比例，结果表明所有单穗的种子分离比均为荧光种子:非荧光种子=3:1，完全符合实验设计的预期。此外，发明人惊奇地发现，由于载体设计时，为了增强荧光在种子中的强度，在载体的荧光基因的启动子前增加了 35S增强子的序列，而该载体产生的种子的荧光强度都要远远高于不增加增强子序列的其他载体的转基因种子。种子中更容易分辨的高表达荧光基因，将对种子的分拣的精确度起到决定性作用，这是该技术成功的关键之一(图6)。
[0113]实施例5:保持系植株花粉育性检测
[0114]通过实施例3得到的水稻转基因材料，按照实施例2所描述的实验过程，得到了保持系(背景为ms26/ms26纯合隐性突变位点和外源基因杂合)。对保持系植株和非转基因对照植株(野生型非转基因水稻品种武运粳7号)进行表型分析，二者之间没有观察到明显的形态上的不同，且其雄性生育能力也基本相同。
[0115]例如，以转化受体品系对应的野生型非转基因水稻品种武运粳7号(可育，下面简称为CKl)和转基因水稻对应的非转基因水稻品系武运粳7号ms26突变体(不育，下面简称为CK2)为对照，进行花粉可染率检测。
[0116]在水稻开花晚期，从转基因水稻(保持系)、CKl及CK2小区各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取I个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1%的I2-1K溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数。在CKl正常可育和CK2正常不育的前提下，分析转基因水稻(保持系)的花粉可染率。结果显示可育对照(CKl)的可育率在98.6%~100%之间；不育对照(CK2)可育率为O ;而多个随即抽取的转基因(保持系)植株中，花粉染色比例均与可育对照(CKl)相同，证明育性正常。即转基因(保持系)株系由于在武运粳7号mS26/mS26突变体中转化了前述的构建体，使得花粉育性从不育转为正常。
[0117]实施例6:保持系与不育系授粉杂交后，不育系所产生荧光种子与非荧光种子分离比例
[0118]通过实施例3得到的水稻转基因材 料，按照实施例2所描述的实验过程进行田间试验后，得到了保持系(背景为mS26/mS26纯合隐性突变位点和外源基因杂合)，与不育系进行授粉杂交后，使得不育系植株恢复结实，对不育系植株上的荧光与非荧光种子的分离比例进行了调查，结果显示不育系植株上的荧光和非荧光种子的比例均为1:1 (图4)，表明本发明中所提供的表达载体各元件(育性恢复基因和荧光色选基因)作为整体表达良好。即所构建的保持系(荧光种子)可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，与不育系授粉杂交后，使不育系植株恢复结实，获得两类分别携带和不携带外源基因的种子，其中，携带外源基因的荧光种子作为保持系，可以与不育系杂交源源不断地继续生产不育系和保持系，而不携带外源基因的非荧光正常种子培育的植株可以作为不育系用作杂交育种的亲本。
[0119]表1:保持系与不育系植株授粉杂交后，不育系所结荧光种子与非荧光种子数比例
[0120]
【权利要求】
1.一种方法，用于创制植物保持系，其特征在于所述方法包括: a)提供第一植株，其为纯合隐性核雄性不育的不育系； b)向第一植株中引入构建体，所述构建体含有第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子为育性恢复基因，第二核酸分子为筛选基因；和 c)获得的含所述构建体的转基因植株既为保持系。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的保持系可用于繁殖雄性不育系，所述方法包括:根据所述保持系所含外源构建体的纯合或杂合情况，分成两种途径进行雄性不育系的繁殖: i)转基因杂合的保持系，通过与权利要求1a中所述的第一植株杂交繁殖出稳定分离的不育系和保持系； ii)转基因纯合的保持系，先与不育系杂交获得转基因杂合的保持系，再与不育系杂交繁殖出稳定分离的不育系和保持系。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述的第一核酸分子与第三核苷酸序列可操作地相连，所述第三核苷酸序列指导偏好于植物雄性细胞的表达。
4.权利要求1-3之任一所述的方法，其中所述的第二核酸分子与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于愈伤组织和/或种子中的表达。
5.权利要求1或2 所述的方法，其中所述的第一植株为水稻雄性不育突变体植株。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的第一核酸分子为水稻雄性不育恢复基因。
7.权利要求5或6所述的方法，其中所述的水稻雄性不育突变体为水稻ms26基因的雄性不育突变体。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的水稻雄性不育恢复基因具有如SEQID N0:9所示的核苷酸序列。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的水稻雄性不育恢复基因编码具有如SEQID NO:10所示的氨基酸序列。
10.权利要求1-9之任一所述的方法，其中所述的第二核酸分子选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷Pl基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因构成的组。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的红色荧光基因具有如SEQID NO:3所示的核苷酸序列。
12.权利要求9所述的方法，其中所述的红色荧光基因编码具有如SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
13.权利要求1或2所述的方法，其中所述的第一植株为油菜雄性不育突变体植株。
14.一种构建体，其特征在于，包含:第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码植物雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码筛选基因。
15.权利要求14所述的构建体，其中所述的第一核酸分子与第三核苷酸序列可操作地相连，所述第三核苷酸序列指导偏好于植物雄性细胞的表达。
16.权利要求14或15所述的构建体，其中所述的第二核酸分子与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于愈伤组织和/或种子中的表达。
17.权利要求14所述的构建体，其中所述的第一核酸分子为水稻雄性不育恢复基因。
18.权利要求14或17所述的构建体，其中所述的水稻雄性不育突变体为ms26基因的雄性不育突变体。
19.权利要求18所述的构建体，其中所述的水稻雄性不育恢复基因具有如SEQID NO:9所示的核苷酸序列。
20.权利要求19所述的构建体，其中所述的水稻雄性不育恢复基因编码具有如SEQIDNO: 10所示的氨基酸序列。
21.权利要求14-20之任一所述的构建体，其中所述的第二核酸分子选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷Pl基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因构成的组。
22.权利要求21所述的构建体，其中所述的红色荧光基因具有如SEQID NO:3所示的核苷酸序列。
23.权利要求22所述的构建体，其中所述的红色荧光基因编码具有如SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
【文档编号】A01H5/00GK103805630SQ201310548284
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2012年11月12日
【发明者】唐晓艳, 王海洋, 周君莉 申请人:未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司, 兴旺投资有限公司