萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法
【专利摘要】萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，包括采集萱藻成熟叶状体，培养至褐色丝状体作为包埋材料；将丝状体打碎与含蔗糖和甘油的褐藻酸钠溶液混匀；滴入NaCl溶液中形成胶球，硬化完成包埋过程；将完成固定化的胶球进行预培养；将胶球置于培养皿，放在底部铺有干燥硅胶的大培养皿，封口，随即放入21℃的培养箱中在黑暗条件下干燥脱水；将脱水后的胶球放入的冻存管中，密封后立即投入液氮中保存。本发明有效解决了萱藻种质保存过程中变异和污染等问题；冻存后经过恢复的萱藻丝状体具有完全的生长发育能力和扩增能力，能够形成正常的孢子囊并释放孢子，进而发育成叶状体，无需昂贵的仪器，也不需要使用对保存材料有毒害作用的抗冻保护剂，有利于该方法的推广和应用。
【专利说明】萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，属于海藻种质保存【技术领域】。
【背景技术】
[0002]萱藻(Scytosiphon 1mentaria)隶属于褐藻门，是一种广泛分布于我国北起辽东半岛南至广东省海陵岛之间沿海海域的大型海藻。萱藻不仅口味鲜美、营养价值高，而且具有抗氧化性、抗肿瘤和抗病毒的特点，是一种经济价值极高的新型海藻。萱藻具有异形世代交替的生活史，由大型的叶状配子体世代和微小的孢子体世代构成。孢子体世代主要有垫状体、类垫状体和丝状体三种形式。萱藻丝状体是实验室扩增和工厂化育苗的主要对象，而且丝状体能够形成单室孢子囊并释放游孢子，进而发育成叶状体，因此是种质保存的最佳材料。
[0003]超低温保存是指在低共熔点以下的温度保存材料，通常采用液态氮作冷媒。生物材料之所以在超低温下能够长期保存，是因为低温能抑制生物细胞的生化活动，尤其在超低温条件下，细胞的整个代谢活动等都几乎完全停止，可排除遗传性状的变异，同时保存细胞活力。因此，该方法能有效解决海藻种质保存中的污染、混杂和变异问题，有望实现藻类种质的长期保存。
[0004]包埋脱水超低温保存法是一种将生物材料用褐藻酸钠包埋，然后经脱水后投入液氮保存的一种较为广泛使用的种质保存方法，最早被法国学者应用于保存马铃薯茎尖的研究中。与传统的两步法相比，包埋脱水法不仅能获得较高的存活率，而且具有省时省力、无需复杂的设备和仪器，因无需使用抗冻保护剂而避免了其对生物材料的毒性等优点，这无疑是超低温保存技术的一项重大进步。近年来，包埋脱水法被广泛应用于植物细胞、组织和器官的保存，在藻类方面，包埋脱水法在诸如坛紫菜自由丝状体、裙带菜配子体以及多种微藻等的保存上取得了初步的成功。但是，关于萱藻种质的包埋脱水超低温保存方法还未见报道。在超低温保存法中，高效的冻存过程因`保存材料的不同而有较大的差异，没有一种冻存过程是适合多种保存材料的，冻存过程的建立主要依靠经验性的实验结果，这也是超低温保存法的一个主要难点。
[0005]传统的萱藻种质保存方法就是对萱藻种质进行液体保存，但该法具有一系列不足:(1)液体保存基本上每隔一个月就要更换一次培养液，耗费的人力、物力和财力较大；
(2)液体保存的种质不稳定，容易发生形态异常等现象，并且被细菌和杂藻等污染的几率也比较高；(3)液体保存方法单一，限制了种质保存的效率和规模。
[0006]两步冻存法是常规的超低温保存法，该方法的第一步是在保存材料中加入抗冻保护剂，然后用程序降温仪将材料按照不同的降温速率降至某一特定温度进行预冻一段时间，然后投入液氮冷冻保存。控速降温法的缺点是需要在预冻过程中严格控制降温速率，同时要求特殊的设备和技术，而且大多数使用对生物材料有害的抗冻保护剂，这在一定程度上限制了两步冻存法的使用。
【发明内容】
[0007]本发明目的是提供一种萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，以解决萱藻种质保存过程中变异和污染等问题，可以应用于实验室萱藻丝状体种质的长期保存以及萱藻种质库构建过程。
[0008]一种萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，其特征在于包括以下步骤:
[0009](I)培养萱藻丝状体的步骤:
[0010]采集萱藻成熟叶状体，将叶状体用消毒棉棒擦洗干净后阴干刺激并放散雌、雄配子，雌、雄配子结合后培养一周形成黄褐色丝状体，收集丝状体在光照培养箱中扩增培养，培养条件为(22.0±0.5) V，光强 86.4 ~97.2 μ mol/(m2.s)，L:D=14:10，营养盐 NO3-N为5-9g/m3，PO4-P为l_2g/m3 ;当丝状体培养至褐色时作为包埋材料；
[0011](2)萱藻丝状体的包埋步骤:
[0012]将上述丝状体用搅拌器打碎至500~600 μ m长的小段，用200目的消毒筛絹过滤掉培养液，然后用灭菌海水冲洗两遍后再用消毒海水重新悬浮萱藻丝状体小段，之后与等体积的含0.4mol/L蔗糖和2mol/L甘油的6%的褐藻酸钠溶液混匀；然后用IOmL注射器将藻液滴入含有0.1moVLCaCl2的3%的NaCl溶液中形成胶球，摇动混合液，20min后胶球硬化完成包埋过程；
[0013](3)胶球的蔗糖预培养
[0014]将完成固定化的胶球 置于0.2~0.8mol/L的蔗糖溶液中预培养2~12h ;
[0015](4)胶球脱水
[0016]胶球在蔗糖溶液中预培养完成后，用吸水纸吸干胶球表面残留的液体；以每60个胶球为一组称量鲜重并置于直径为9cm的培养皿中，将装有胶球的培养皿放在底部铺有干燥硅胶且直径为15cm的大培养皿中，盖上大培养皿盖并用保鲜膜封口，随即放入21°C的培养箱中在黑暗条件下干燥脱水；
[0017](5)胶球的超低温保存
[0018]将脱水后的胶球每15个为一组间隔的放入2mL的冻存管中，密封后立即投入液氮
中保存。
[0019]以上是对萱藻丝状体保存的基本步骤，为了进一步检验该方法的保存效果，有以下步骤对其进行验证:
[0020](6)胶球的超低温保存后的化冻
[0021]投入液氮中保存24h后，取出冻存管，迅速放入20~60°C的恒温水浴锅中不停搅动，20s后胶球表面白色消失，化冻完成；
[0022](7)胶球的恢复、脱固定化与萱藻丝状体的恢复培养
[0023]将化冻后的胶球放入装有消毒海水的IOmL离心管中在21°C黑暗条件下恢复6~24h，然后用含0.05mol/L柠檬酸钠的3%的NaCl溶液对胶球脱固定，胶球溶解后重新得到含有丝状体小段的混合液；通过对混合液离心(2500r/min，3min)得到萱藻丝状体，后用含营养盐N03-N5-9g/m3，P04-Pl_2g/m3消毒海水重新悬浮丝状体，再将藻液置于扩增条件下恢复培养，培养两天后鉴定存活率；
[0024]( 8 )生长发育能力的鉴定[0025]将完成脱固定化的萱藻丝状体移至(22.0±0.5) °C，光强86.4~97.2 μ mol/(m2.s)，L:D=14:10下培养，定期观察丝状体的生长发育情况；待丝状体长到褐色后置于(17.0±0.5) °C, L:D=10:14，光强(28.0±2.7) μ mol/(m2.s)条件下诱导孢子囊，阴干刺激孢子囊使其放散孢子，观察孢子的发育情况。
[0026]实验证明，采用本发明长期保存萱藻丝状体，存活率可达54.79%。
[0027]上述步骤I中，当丝状体培养至褐色时移至(22.0±0.5) °C，光强42~50 μ mol/(m2*s)，L:D=14:10，营养盐NO3-N为5_9g/m3，PO4-P为l_2g/m3的条件下静止培养两周后再将该丝状体作为包埋材料。
[0028]上述步骤2中，通过控制针头与液面的高度在2~3cm以及藻液滴入的速度在60~80滴/min，将胶球的直径控制在3mm±0.3。
[0029]上述步骤3中，胶球脱水前，先用0.4mol/L蔗糖对胶球预培养6h，能有效提高萱藻丝状体冻存后的存活率。
[0030]上述步骤4中，胶球须脱水至较低的含水量(15%)再投入液氮中保存。
[0031]含水量的测量方法如下:
[0032]胶球脱水8h过程中，每隔0.5h取出一个培养皿秤取胶球脱水后的重量，通过烘干(105°C，4h)测出胶球的干重；胶球脱水后的含水量计算公式如下:
[0033]胶球脱水后的含水量=[(胶球脱水后的重量-胶球干重)/胶球鲜重]X 100%。
[0034]上述步骤4中，对胶球脱水这一过程，不仅可以使用硅胶对胶球脱水，也可将胶球放入低温冷藏柜中阴干脱水，或者用无菌层流空气干燥脱水。
[0035]上述步骤7中，胶球化冻后，置于消毒海水中在黑暗条件下恢复12-18h，使脱水的胶球复水，有助于提高保存效果。
[0036]本发明为萱藻丝状体的保存提供了一种简单、有效的方法。(I)将萱藻丝状体经过包埋、脱水后投入_196°C的液氮中保存，在超低温条件下，萱藻丝状体细胞处于一种静止的状态，并以这种形态进行保存，有效解决了萱藻种质保存过程中变异和污染等问题；(2)冻存后经过恢复的萱藻丝状体具有完全的生长发育能力和扩增能力，能够形成正常的孢子囊并释放孢子，进而发育成叶状体，因此包埋脱水法是保存萱藻丝状体一种较为理想的方法；
(3)该方法无需昂贵的仪器，也不需要使用对保存材料有毒害作用的抗冻保护剂，有利于该方法的推广和应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1、脱水时间与胶球含水量的关系图。
[0038]图2、含水量对冻存前后萱藻丝状体存活率影响的关系图。
[0039]图3、蔗糖浓度对冻存前后萱藻丝状体存活率影响的关系图。
[0040]图4、蔗糖预培养时间对冻存前后萱藻丝状体存活率影响的关系图。
[0041]图5、化冻温度对萱藻丝状体存活率影响的关系图。
[0042]图6、胶球恢复时间对萱藻丝状体存活率影响的关系图。
【具体实施方式】
[0043]下面结合实施例具体说明本发明的方法。[0044]一种萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，其特征在于包括以下步骤:
[0045](I)培养萱藻丝状体的步骤:
[0046]萱藻成熟叶状体于2012年4月采自长岛自然海区，将叶状体用消毒棉棒反复擦洗干净后阴干刺激并放散雌、雄配子，雌、雄配子结合后培养一周形成黄褐色丝状体，收集丝状体在光照培养箱中扩增培养，培养条件为(22.0±0.5) V，光强86.4~97.2 μ mol/(m2.s)，L:D=14:10，营养盐NO3-N为7g/m3，PO4-P为1.2g/m3 ;当丝状体培养至褐色时再将材料移至(22.0±0.5) °C，光强 42 ~50ymol/(m2.s)，L:D=14:10，营养盐 NO3-N 为 7g/m3, PO4-P为1.2g/m3的条件下静止培养两周后再将该丝状体作为包埋材料，能使成活率进一步提闻;[0047](2)萱藻丝状体的包埋步骤:
[0048]将上述丝状体用搅拌器打碎至约500~600 μ m长的小段，用200目的消毒筛絹过滤掉培养液，然后用灭菌海水冲洗两遍后再用消毒海水重新悬浮萱藻丝状体小段，之后与等体积的含0.4mol/L蔗糖和2mol/L甘油的6%的褐藻酸钠溶液混匀；然后用IOmL注射器将藻液滴入含有0.1moVLCaCl2的3%的NaCl溶液中形成胶球，摇动混合液，20min后胶球硬化完成包埋过程；该步骤中，通过控制针头与液面的高度在2~3cm以及藻液滴入的速度在60~80滴/min，将胶球的直径控制在3mm±0.3，胶球过小则保存的丝状体过少，胶球过大则不利于保存效果，因此控制胶球的直径是能够决定保存效果的重要因素；实验发现额外添加甘油要显著优于单纯添加蔗糖的效果；
[0049](3)胶球的蔗糖预培养
[0050]将完成固定化的胶球置于0.2~0.8mol/L的蔗糖溶液中预培养2~12h ;
[0051 ] 蔗糖浓度对冻存前后萱藻丝状体存活率影响的实验结果(附图3)以及蔗糖预培养时间对冻存前后萱藻丝状体存活率影响实验结果(附图4)表明胶球脱水前，先用0.4mol/L蔗糖对胶球预培养6h，能有效提高萱藻丝状体冻存后的存活率；
[0052](4)胶球脱水与含水量的测定
[0053]胶球在蔗糖溶液中预培养完成后，用吸水纸吸干胶球表面残留的液体；以每60个胶球为一组称量鲜重并置于直径为9cm的培养皿中，将装有胶球的培养皿放在底部铺有干燥硅胶且直径为15cm的大培养皿中，盖上大培养皿盖并用保鲜膜封口，随即放入21°C的培养箱中在黑暗条件下干燥脱水；
[0054]对胶球脱水这一过程，不仅可以使用硅胶对胶球脱水，也可将胶球放入低温冷藏柜中阴干脱水，或者用无菌层流空气干燥脱水；
[0055]由于含水量与成活率密切相关，因此需要测量含水量，可在该步骤中进行，其测量方式如下:
[0056]胶球脱水8h过程中，每隔0.5h取出一个培养皿秤取胶球脱水后的重量，通过烘干(105°C，4h)测出胶球的干重；胶球脱水后的含水量计算公式如下:
[0057]胶球脱水后的含水量=[(胶球脱水后的重量-胶球干重)/胶球鲜重]X 100%
[0058]胶球脱水时间与含水量的实验结果(附图1)表明，胶球在脱水过程中，前5个小时脱水速度较快，5~8h脱水速度较慢；
[0059]胶球含水量对萱藻丝状体冻存后存活率影响的实验结果(附图2)表明胶球脱水至较低的含水量(15%)再进行下一步骤结果最好；[0060](5)胶球的超低温保存
[0061]将脱水后的胶球每15个为一组间隔的放入2mL的冻存管中，密封后立即投入液氮
中保存。
[0062]以上是对萱藻丝状体保存的基本步骤，为了进一步检验该方法的保存效果，还有以下步骤对其进行验证:
[0063](6)胶球的超低温保存后的化冻
[0064]投入液氮中保存24h后，取出冻存管，迅速放入20~60°C的恒温水浴锅中不停搅动，20s后胶球表面白色消失，化冻完成；
[0065]胶球化冻温度与萱藻丝状体冻存后存活率的实验结果表明(附图5)，在40°C条件下化冻能大幅度提高萱藻丝状体冻存后的存活率；
[0066](7)胶球的恢复、脱固定化与萱藻丝状体的恢复培养
[0067]将化冻后的胶球放入装有消毒海水的IOmL离心管中在21°C黑暗条件下恢复6~24h，然后用含0.05mol/L柠檬酸钠的3%的NaCl溶液对胶球脱固定，胶球溶解后重新得到含有丝状体小段的混合液；通过将混合液离心(2500r/min，3min)得到萱藻丝状体，后用含营养盐N03-N7g/m3，PO4-Pl.2g/m3消毒海水重新悬浮丝状体，再将藻液置于扩增条件下恢复培养，培养两天后鉴定存活率；
[0068]胶球恢复时间与萱藻丝状体冻存后存活率的实验结果(附图6)表明，胶球化冻后，置于消毒海水中在黑暗条件下恢复12-18h，使脱水的胶球复水，有助于提高保存效果；
`[0069](8)生长发育能力的鉴定
[0070]将完成脱固定化的萱藻丝状体移至(22.0±0.5) °C，光强86.4~97.2 μ mol/(m2.s)，L:D=14:10下培养，定期观察丝状体的生长发育情况；待丝状体长到褐色后置于(17.0±0.5) °C, L:D=10:14，光强(28.0±2.7) μ mol/(m2.s)条件下诱导孢子囊，阴干刺激孢子囊使其放散孢子，观察孢子的发育情况。
[0071]实验证明，采用本发明长期保存萱藻丝状体，存活率可达54.79%。
【权利要求】
1.一种萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，其特征在于包括以下步骤: (1)培养萱藻丝状体的步骤: 采集萱藻成熟叶状体，将叶状体用消毒棉棒擦洗干净后阴干刺激并放散雌、雄配子，雌、雄配子结合后培养一周形成黄褐色丝状体，收集丝状体在光照培养箱中扩增培养，培养条件为(22.0±0.5) V，光强 86.4 ~97.2ymol/(m2.s)，L:D=14:10，营养盐 NO3-N 为5-9g/m3, PO4-P为l_2g/m3 ;当丝状体培养至褐色时作为包埋材料； (2)萱藻丝状体的包埋步骤: 将上述丝状体用搅拌器打碎至500~600 μ m长的小段，用200目的消毒筛絹过滤掉培养液，然后用灭菌海水冲洗两遍后再用消毒海水重新悬浮萱藻丝状体小段，之后与等体积的含0.4mol/L蔗糖和2mol/L甘油的6%的褐藻酸钠溶液混匀；然后用IOmL注射器将藻液滴入含有0.1moVLCaCl2的3%的NaCl溶液中形成胶球，摇动混合液，20min后胶球硬化完成包埋过程； (3)胶球的蔗糖预培养 将完成固定化的胶球置于0.2~0.8mol/L的蔗糖溶液中预培养2~12h ; (4)胶球脱水 胶球在蔗糖溶液中预培养完成后，用吸水纸吸干胶球表面残留的液体；以每60个胶球为一组称量鲜重并置于 直径为9cm的培养皿中，将装有胶球的培养皿放在底部铺有干燥硅胶且直径为15cm的大培养皿中，盖上大培养皿盖并用保鲜膜封口，随即放入21 °C的培养箱中在黑暗条件下干燥脱水； (5)胶球的超低温保存 将脱水后的胶球每15个为一组间隔的放入2mL的冻存管中，密封后立即投入液氮中保存。
2.如权利要求1所述的萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，其特征在于上述步骤I中，当丝状体培养至褐色时再移至(22.0 ± 0.5 )°C，光强42~50 μ mol/ (m2.s)，L: D=14:10，营养盐NO3-N为5-9g/m3，PO4-P为l_2g/m3的条件下静止培养两周后再将该丝状体作为包埋材料。
3.如权利要求1所述的萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，其特征在于上述步骤2中，通过控制针头与液面的高度在2~3cm以及藻液滴入的速度在60~80滴/min，将胶球的直径控制在3mm±0.3。
4.如权利要求1所述的萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，其特征在于上述步骤3中，胶球脱水前，先用0.4mol/L蔗糖对胶球预培养6h。
5.如权利要求1所述的萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，其特征在于上述步骤4中，胶球须脱水至15%含水量，再投入液氮中保存。
6.如权利要求5所述的萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，其特征在于所述胶球须脱水至15%含水量的测量方法如下: 胶球脱水8h过程中，每隔0.5h取出一个培养皿秤取胶球脱水后的重量，通过烘干(105°C，4h)测出胶球的干重；胶球脱水后的含水量计算公式如下: 胶球脱水后的含水量=[(胶球脱水后的重量-胶球干重)/胶球鲜重]X 100%。
7.如权利要求1所述的萱藻丝状体包埋脱水超低温保存方法，其特征在于上述步骤4中，对胶球脱水这一过程，不仅可以使用硅胶对胶球脱水，也可将胶球放入低温冷藏柜中阴干脱水，或者用无菌层流空气 干燥脱水。
【文档编号】A01N3/00GK103621395SQ201310688966
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】宫相忠, 庄琰, 张文健, 高伟, 张必达 申请人:中国海洋大学