一种延长水稻生育期的育种方法
【专利摘要】本发明涉及一种延长水稻生育期的育种方法，包含以下步骤：在水稻生育期决定基因Ehd3外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体，导入水稻细胞并再生成苗；利用载体中的表达框实现对水稻细胞中Ehd3外显子区DNA的剪切，从而引起水稻细胞的自我修复；通过对再生株系基因组目标片段的测序，获取携带两个等位Ehd3基因同时发生功能缺失突变的株系，经过表型鉴定，确认再生植株生育期的延长。实验表明，本方法可快速获得生育期延长的水稻材料。
【专利说明】一种延长水稻生育期的育种方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水稻生物技术育种领域，具体涉及一种延长水稻生育期的育种方法。【背景技术】
[0002]水稻是我国的第一大粮食作物，目前水稻种植面积为3000万hm2左右，其中杂交水稻种植面积占总水稻面积的57%，杂交稻制(繁)种面积18万hm2左右。杂交稻种子质量的优劣是实现水稻优质、高产和高效生产的基础，杂交稻种子生产水平高低直接关系到我国粮食安全。
[0003]杂交水稻种子生产为水稻的异交栽培，即利用杂交稻雄性不育系作母本，雄性不育恢复系作父本，按照一定的行比相间种植，使双亲能够花期相遇，不育系接受恢复系的花粉而授精结实作为杂交种子应用于生产。同时为了保证下年的杂交种子生产，还要利用杂交稻雄性不育系作母本，雄性不育保持系作父本，按照一定的行比相间种植，使其花期相遇，不育系接受保持系的花粉而授精结实作为雄性不育系种子繁殖应用于下年制种。
[0004]目前我国的杂交水稻制种技术与研制初期并没有根本的改进，杂交稻制种程序复杂而严格，仍然采用不育系和恢复系差期播种和移栽、人工赶粉、分别仔细收获等，才能防止机械混杂,劳动强度大，因此,杂交稻制种效率不高。并且杂交稻制种产量受技术人员的经验丰富与否及气候条件好坏影响极大，因此，制种效益也不稳定。由于目前我国农村劳动力结构发生了变化，青壮年外出务工，妇女与老年劳力在家务农。因此，积极发展杂交稻机械化制种技术，实现杂交稻制种规模化，是提高我国杂交稻制种效益的必由之路。
[0005]不育系和恢复系和生育期一致是实现机械化混播制种的关键。但目前目前绝大多数强优杂交稻组合父母本生育期不一致，主要表现在不育系的生育期短于恢复系，严重的制约了杂交水稻制种的机械化进程。因此，发展可快速定向延长现有水稻不育系生育期的育种方法，对杂交水稻机械化混播制种的推进将有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种延长水稻生育期的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:
[0007]步骤1，在水稻生育期决定基因Ehd3(L0C_0s08g01420)外显子区选取靶标片段，所述祀标片段的双链结构中的一条链具有5 ’ - (N) X-NGG_3 ’结构，(N)x代表数目为X的一段碱基序列(N1, N2……Nx}，X代表碱基的数量，N1, N2……Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也表不A、T、G、C中的一种；
[0008]步骤2，利用所述靶标片段，构建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框；
[0009]步骤3，将步骤2所获 的所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达；
[0010]步骤4，剪切Ehd3基因的双链靶标片段，再通过水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内Ehd3基因的功能缺失突变；
[0011]步骤5，用导入所述重组载体的水稻细胞再生水稻植株；
[0012]步骤6，对再生的水稻植株中Ehd3基因包含靶标片段的DNA区段测序；
[0013]步骤7，选择两个等位Ehd3基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，观察再生株系子代的生育期，挑取生育期显著推迟的株系，作为所创制的生育期推迟的水稻材料。
[0014]优选地，X为19或20。
[0015]优选地，所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框均能够在水稻细胞中表达。
[0016]优选地，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
[0017]优选地，所述向导RNA表达框包括:水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；结构特征为(N)X的靶标序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第351至358位所示。
[0018]优选地，所述Cas9核酸酶表达框包括:玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq IDN0.2第I至2031位所示；植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如SeqID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所示。
[0019]在所述Ehd3基因外显子上，具有所述(N)X-NGG_3’结构的片段可选为靶标的共有75个。
[0020]构建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体是按照靶标序列的核酸排列顺序进行的，其中所述重组载体中包括CRISPR RNA(CrRNA)序列，其为所述靶标区段5，-(N)x-NGG-3，中的(N)x或与之互补的序列。
[0021]所述Cas9核酸酶表达框与向导RNA表达框位于同一载体中。
[0022]在所述步骤3中，将步骤2所获重组载体导入水稻细胞，从而使细胞同时含有向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，能够对Ehd3基因的双链的所述靶标片段进行剪切，再通过水稻细胞自身的DNA修复功能，最终实现细胞内Ehd3基因靶标片段的随机插入和/或随机缺失。
[0023]所述方法中，将重组载体导入水稻细胞所采用的方法为PEG介导的水稻原生质体瞬时转化或农杆菌介导的水稻愈伤组织稳定转化。这两种方法最适合用于本发明的育种方法，尤其是如者。
[0024]在步骤4中，再生植物的方法为细胞或组织经过组织培养，获得植株。
[0025]在步骤5中，还可以通过基因组PCR方法克隆再生植株中Ehd3基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。所述基因组PCR方法为，针对包含靶标片段的基因组区域，设计位点特异性引物，以再生植株的基因组DNA为模板，扩增所述包含靶标片段的基因组区域。扩增产物测序是指，对PCR产物中的目的条带测序。
[0026]在步骤6中，两个等位Ehd3基因都出现功能缺失突变是指测序结果在Ehd3基因靶标位点出现两种功能缺失突变序列，且没有出现野生型序列；其中所述功能缺失突变序列指的是正常Ehd3编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
[0027]在步骤7中，观察再生株系及自交子代的生育期，挑取生育期推迟2周以上的株系，该材料即为所改良的生育期延长的水稻材料。
[0028]在一种实现方式中，所采用的向导RNA表达框具体为(Seq ID N0.1):ggatcatgaaccaacggcctggctgtatttggtggttgtgtagggagatggggagaagaaaagcccgattctcttcgctgtgatgggctggatgcatgcgggggagcgggaggcccaagtacgtgcacggtgagcggcccacagggcgagtgtgagcgcgagaggcgggaggaacagtttagtaccacattgcccagctaactcgaacgcgaccaacttataaacccgcgcgctgtcgcttgtgtgGCCCCCCACCACCGCGCAAGgttttagagctatgctgaaaagcatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttt
[0029]在一种实现方式中，所采用的Cas9核酸酶表达框具体为(Seq ID N0.2):ctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgetccgctgtcggcatccagaaatgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcagcccgggggatccccaatacttgtatggccgcggccgctctagatggattacaaggaccacgacggggattacaaggaccacgacattgattacaaggatgatgatgacaagatggctccgaagaagaagaggaaggttggcatccacggggtgccagctgctgacaagaagtactcgatcggcctcgatattgggactaactctgttggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccctcaaag
【权利要求】
1.一种延长水稻生育期的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 步骤I，在水稻生育期决定基因Ehd3外显子区选取靶标片段，所述靶标片段的双链结构的一条链具有5，- (N) x-NGG-3，结构，(N) x代表数目为X的一段碱基序列(N1, N2……Nj,X代表碱基的数量，N1, N2……Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也表示A、T、G、C中的一种； 步骤2，利用所述靶标片段，构建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框，以及Cas9核酸酶表达框； 步骤3，将所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达； 步骤4，剪切Ehd3基因的双链靶标片段，诱发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内Ehd3基因的功能缺失突变； 步骤5，用导入所述重组载体的水稻细胞再生水稻植株； 步骤6，对再生植株中Ehd3基因包含靶标片段的DNA区段测序。 步骤7，选择两个等位Ehd3基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，观察再生株系子代的生育期，挑取生育期推迟超过预定时间段的株系，作为所创制的生育期推迟的水稻材料。
2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，X为19或20。
3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框均能够在水稻细胞中表达。
4.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
5.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于， 所述向导RNA表达框包括:水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；结构特征为(N)x的靶标序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第351至358位所示。
6.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于， 所述Cas9核酸酶表达框包括:玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示；植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所/Jn ο
7.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，在所述步骤7中，挑取子代生育期推迟超过两周的株系作为所创制的生育期推迟的水稻材料。
8.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤7还包括对所得植株进行自交，观察再生株系子代的生育期。
【文档编号】A01H5/00GK104004782SQ201410209121
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】秦瑞英, 杨剑波, 魏鹏程, 李莉, 马卉, 李 浩, 杨亚春, 倪金龙, 倪大虎, 宋丰顺, 陆徐忠 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所