一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体，利用根癌农杆菌介导法转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株。对转基因黄花蒿植株进行PCR基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析，筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。本发明获得的转基因黄花蒿中青蒿素含量显著提高，最高可达非转化黄花蒿含量的1.5倍，本发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
【专利说明】一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及属于生物【技术领域】的提高青蒿素含量的方法，特别涉及一种转iaaM 基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。
【背景技术】
[0002] 青蒿素是从植物黄花蒿中提取的含过氧基团的倍半萜内酯药物，是当今疟疾治疗 的最理想药物，能有效治疗对传统药物氯奎产生抗药性的疟原虫感染。青蒿素主要从黄花 蒿中直接提取得到，或提取黄花蒿中含量较高的青蒿酸，然后半合成而成。目前除黄花蒿、 青蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。因此黄花蒿仍是青蒿素药物生产的惟 一药源。
[0003] 虽然黄花蒿系世界广泛分布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大。研究证实 黄花蒿中合成青蒿素的主要部位是其叶片表面的腺毛细胞。由于其合成部位的特异性，黄 花蒿中青蒿素的含量仅占叶片干重的〇. 8%-1. 4%，因而使其分离成本高、产量低、废弃物多。 野生黄花蒿中青蒿素含量很低，仅为〇. 1-0. 8%。通过杂交和定向育种开展了大量提高黄花 蒿中青蒿素含量的尝试，但目前报道的最高青蒿素含量也未超过1. 4%，说明了常规选育方 法的局限性。本发明提供一种采用基因工程的植物遗传转化法提高黄花蒿中青蒿素含量的 方法，涉及到生长素合成酶基因在其腺毛细胞中特异表达，是一种运用现代生物技术开展 的黄花蒿育种新方法。
[0004] 本发明采用的iaa#基因是植物通过色氨酸途径合成生长素（IAA)的关键酶，该基 因最初来自于感染植物的土壤细菌根癌农杆菌，为编码色氨酸单加氧酶的基因，在植物中 表达后能利用色氨酸合成吲哚乙酸，即生长素。因此转化iaaM基因后的植物细胞由于能过 量合成生长素，使其分裂和分化不受植株整体控制，出现如冠瘿瘤的恶性生长现象。但若使 用特异性启动子使iaaM基因在特定的组织或细胞中表达，就有可能促进特定细胞和组织 的生长。本发明使用腺毛细胞特异性启动子，该启动子是来自于拟南芥表皮毛细胞特异性 表达的G12基因启动子，能在黄花蒿中有效作用，保证iaaM基因仅在腺毛细胞中表达，从而 不影响植株的整体发育，提高其青蒿素含量。
[0005] 根据本发明要解决的技术问题和本发明采用的技术方案进行专利检索，其检索结 果如下。
[0006] 专利 1 : 专利权人为上海交通大学，申请号为200710170423. 8。本发明是一种生物【技术领域】的 转ads基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆紫穗槐二烯合成酶ADS基 因，构建含ads基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ads基因转入青蒿并再生出植 株，PCR检测外源目的基因 ads的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基 因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基 因青蒿中青蒿泰的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的2. 3倍，从而提供了一种提 高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。
[0007] 专利 2 : 专利权人为上海交通大学，申请号为200710170427. 6。本发明是一种生物【技术领域】的 用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆鲨烯合酶SQS基因 sqs片 段，构建含sqs hairpin的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将sqs hairpin基因转入青蒿 中获得再生植株，PCR和RT - PCR检测目的基因 sqs hairpin的整合和表达情况，高效液相 色谱法及蒸发光散射检测器测定青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素合量提高的转基因 青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株 的2. 8倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产 青蒿素打下了基础。
[0008] 专利 3 : 专利权人为上海交通大学，申请号为201110099411. 7。本发明是一种生物【技术领域】的 转A0C基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆丙二烯氧化环化酶A0C基 因，构建含A0C基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将A0C基因转入青蒿并再生出植 株，PCR检测外源目的基因 A0C的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基 因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基 因青蒿中青蒿素的含量显著提高，在非转化普通青蒿含量为1. 53mg/g DW时，同时期转A0C 基因青蒿中青蒿素的含量最高达到10. 17mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的6. 65倍，从 而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了 基础。
[0009] 专利 4 : 专利权人为中国科学院研究生院，申请号为201110344258. X。本发明公开了青蒿bHLH 转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的青蒿bHLH转录因子，是如下a)或b)的蛋 白质：a)由序列表中序列2所不的氣基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所不的 氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与青蒿素合成相关 的由a)衍生的蛋白质。本发明将bHLH转录因子瞬时转化到青蒿植株内过表达，其所调控 的青蒿素生物合成代谢中的关键酶表达量大幅度提高，可以用来生产青蒿素。本发明调控 青蒿素合成的方法解决了原料的限制问题，且生产工艺简单，有利于青蒿素的大规模工业 生产。
[0010] 专利 5 : 专利权人为上海交通大学，申请号为201110430810. 7。本发明涉及一种生物【技术领域】 的高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，包括如下步骤：从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1 和CPR三个基因，构建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导， 将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基 因青蒿植株。在非转化普通青蒿含量为6. 43mg/g DW时，本发明得到的转基因青蒿株系中 青蒿素的含量最高达到15. 09mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2. 35倍，本发明的方法 对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
[0011] 通过专利文件的检索，没有发现能够破坏本发明专利新颖性的现有技术，也不存 在相互结合能破坏本发明创造性的文件。
【发明内容】
[0012] 本发明提供一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，通过转基因技术， 将生长素合成酶iaaM基因转入黄花蒿，利用特异性G12基因启动子保证iaaM基因在黄花 蒿腺毛细胞中特异表达，促进黄花蒿腺毛细胞发育和代谢，从而提高其青蒿素含量。本发明 建立了稳定提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，为利用黄花蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的 基础。
[0013] 实现以上目的，本发明所采用的技术方案为：一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿 素含量的方法，其特征在于，其包括以下步骤： 步骤1、构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体：将iaaM基因与G12基因启 动子重组，克隆到Ti质粒的T-DNA区pBI121质粒的Hindlll及PstI位点，以NPT-II基因为 选择标记基因，载体以PBI121作为出发载体进行改造和载体构建，获得pBI121-G12-iaaM 的重组Ti质粒，提取重组Ti质粒做PRC检测和酶切验证； 步骤2、工程化根癌农杆菌菌株的制备：构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根 癌农杆菌，转化后的根癌农杆菌经过筛选、培养至对数生长后期，所述的根癌农杆菌为 LBA4404 ； 步骤3、利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植 株，具体包括以下步骤： 1) 外植体预培养：黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至4-6cm时 剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化； 2) 黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化：将黄花蒿幼苗子叶在培养至对数生 长后期的根癌农杆菌液中侵泡30min ; 3) 诱导愈伤组织：将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +500 mg/L 羧苄青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固体培养基上培养2d进行诱导抗性愈伤组织； 4) 抗性再生植株的筛选：抗性愈伤组织团生长至3-4_大小，取出叶盘采用无菌吸水 纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧苄青霉 素+20mg/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基， 温度控制在22-24°C之间，16h/8h进行光暗交替培养；28-35d后诱导出抗性丛生芽，切下 带芽愈伤部分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至3-5cm后，将其 从愈伤组织基部切下，并将其移入1/2 MS+0. 5mg/L NAA+0. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼 脂的MS3生根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在22-24°C之 间，16h/8h进行光暗交替培养；根诱导分化14d后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼 苗7d，然后移栽至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株； 步骤4、转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察：提取转基因黄花蒿植株叶 片DNA，PCR法进行基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行 观察与分析； 步骤5、建立转基因黄花蒿品系：筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过 组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。
[0014] 所述步骤1中G12基因启动子获得途径为：从GenBank中的Nucleotide数据库中 获得拟南芥G12基因核心序列，根据其核苷酸序列设计两条特异性引物，对拟南芥基因组 DNA扩增，获得G12基因启动子。
[0015] 所述步骤2中电激转化法过程为制备的重组Ti质粒DNA 0. 1 ug与1 mL感受态根 癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细菌转化模式进行电激转化。
[0016] 所述步骤2中根癌农杆菌筛选与培养过程为将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那 霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体 培养基28-30°C摇瓶培养过夜至对数生长后期，按1:10接种到扩大的培养体系继续摇瓶4 h〇
[0017] 所述步骤4中转基因黄花蒿植株腺毛发育细胞情况及青蒿素含量观察与分析过 程为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面 积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿比较，可以估测青蒿素含量提高情况。
[0018] 综上所述，本发明的有益效果如下：本发明提供的一种转iaaM基因提高黄花蒿中 青蒿素含量的方法，通过转基因技术，将生长素合成酶iaaM基因转入黄花蒿，利用特异性 G12基因启动子保证iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞中特异表达，促进黄花蒿腺毛细胞发育和 代谢，从而提高其青蒿素含量。在普通非转化黄花蒿含量为10. 53mg/g DW时，转iaaM基因 黄花蒿植株中青蒿素的含量最高达到15. 8mg/g DW，其含量是非转化黄花蒿含量的1. 5倍， 该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
【具体实施方式】
[0019] 为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本 发明进行详细描述。
[0020] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021] 实施例1 : iaaM基因的获取 从GenBank中的Nucleotide数据库中获得编码色氨酸单加氧酶的iaaM基因序列（登 录号为U83987. 1)，送深圳华大基因公司合成该基因 pMD18-iaaM，并将该基因 pMD18-iaaM 转化至E. coliDH5a中保存。
[0022] 具体操作步骤为： 1) 通过设计引入BamH I和Pst I酶切位点的iaaM基因特异性引物 上游引物 iaaMUP :5' -GCGGATCCATGTCAGCCTCATCTCTTCT-3' 下游引物 i aaMDN : 5，-AACTGCAGTTAAITTCTATTGCGGTAGTTATATC-3' 2) 以pMD18-iaaM为模板，iaaMUP和iaaMDN为引物，利用PCR技术扩增iaaM基因。PCR 反应体系为：pMD-iaaM质粒（约 100ng)luL，lOXBuffer 2. 5uL，dNTPs(10mmol/L)luL，MgCl2 (25mmol/L) 1. 5uL，iaaMUP (10umol/L) luL，iaaMDN (10umol/L) luL，TaqDNA 聚合酶（1U/ uL) luL，补 ddH20 至 25uL。反应程序为：95°C预变性 4min，94°C变性 lmin、62°C退火 lmin、 72°C延伸2. 5min、共35个循环，最后72°C延伸10min。
[0023] 3 )PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、切胶回收后，用BamH I和Pst I双酶切，酶 切体系为：iaaM 基因 10uL，10XBuffer Tango 2uL，BamH I (10U/uL) luL，Pst I (10U/uL) luL，补ddH20至20uL。37°C酶切12h，1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段。
[0024] 本实施例合成的iaaM基因为通过转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量提供了一 个重要关键酶基因。
[0025] 实施例2 : 构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体 从GenBank中的Nucleotide数据库中获得拟南芥G12基因核心序列（登录号： L32873. 1)根据其核苷酸序列设计以下两条特异性引物： 上游引物为 1G12: 5，-CCCAAGCTTTTTCCTTCACTATACGTCTTCG-3' 下游引物为 2G12: 5' -CGCGGATCCCAAATCCTGTCCCTAGCTAG-3' 对拟南芥基因组DNA扩增，获得G12启动子片段。将iaaM基因与G12基因启动子重组， 克隆到Ti质粒的T-DNA区pBI121质粒的Hindlll及PstI位点，以NPT-II基因为选择标 记基因，载体以PBI121作为出发载体进行改造和载体构建，获得pBI121-G12-iaaM的重组 Ti质粒，提取质粒做PRC检测和酶切验证。
[0026] 本实施例获得了 G12启动子片段，将iaaM基因与G12基因启动子重组，构建了 iaaM基因在腺毛细胞特异表达的载体，保证iaaM基因仅在黄花蒿腺毛细胞中表达，从而不 影响植株的整体发育，提高其青蒿素含量。
[0027] 实施例3 : 1.工程化根癌农杆菌菌株的制备 构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404,电激转化法过程为制备 的重组Ti质粒DNA 0. 1 ug与1 mL感受态根癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细 菌转化模式进行电激转化。将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基28°C摇瓶培养过夜 至对数生长后期，按1:10接种到扩大的培养体系继续摇瓶4 h。结果表明，构建的iaaM基 因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
[0028] 2.利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植 株 1) 外植体预培养：黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至4cm时 剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化； 2) 黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化：将黄花蒿幼苗子叶在实施例3中得 到的培养至对数生长后期的根癌农杆菌液中侵泡30min ; 3) 诱导愈伤组织：将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +500 mg/L 羧苄青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固体培养基上培养2d进行诱导抗性愈伤组织； 4) 抗性再生植株的筛选：抗性愈伤组织团生长至3_大小，取出叶盘采用无菌吸水纸 吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧苄青霉素 +20mg/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基，温 度控制在22°C之间，16h/8h进行光暗交替培养；35d后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤部 分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至5cm后，将其从愈伤组织基 部切下，并将其移入1/2 MS+O. 5mg/L NAA+O. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂的MS3生根 培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在22°C之间，16h/8h进行 光暗交替培养；根诱导分化14d后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7d，然后移栽 至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株。
[0029] 3.转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察 提取转基因黄花蒿植株叶片DNA，PCR法进行基因扩增检测；并对转基因青蒿腺毛发育 细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析，具体操作为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光 体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿 比较，可以估测青蒿素含量提高情况。
[0030] 4.建立转基因黄花高品系 筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿 素含量的黄花蒿品系。
[0031] 实施例4 1.工程化根癌农杆菌菌株的制备 构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404,电激转化法过程为制备 的重组Ti质粒DNA 0. 1 ug与1 mL感受态根癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细 菌转化模式进行电激转化。将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基30°C摇瓶培养过夜 至对数生长后期，按1:10接种到扩大的培养体系继续摇瓶4 h。结果表明，构建的iaaM基 因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
[0032] 2.利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植 株 1) 外植体预培养：黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至6cm时 剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化； 2) 黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化：将黄花蒿幼苗子叶在实施例3中得 到的培养至对数生长后期的根癌农杆菌液中侵泡30min ; 3) 诱导愈伤组织：将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +500 mg/L 羧苄青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固体培养基上培养2d进行诱导抗性愈伤组织； 4) 抗性再生植株的筛选：抗性愈伤组织团生长至4_大小，取出叶盘采用无菌吸水纸 吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧苄青霉素 +20mg/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基，温 度控制在24°C之间，16h/8h进行光暗交替培养；28d后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤部 分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至5cm后，将其从愈伤组织基 部切下，并将其移入1/2 MS+0. 5mg/L NAA+O. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂的MS3生根 培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在24°C之间，16h/8h进行 光暗交替培养；根诱导分化14d后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7d，然后移栽 至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株。
[0033] 3.转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察 提取转基因黄花蒿植株叶片DNA，PCR法进行基因扩增检测；并对转基因青蒿腺毛发育 细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析，具体操作为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光 体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿 比较，可以估测青蒿素含量提高情况。
[0034] 4.建立转基因黄花高品系 筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿 素含量的黄花蒿品系。
[0035] 实施例5 1.工程化根癌农杆菌菌株的制备 构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404,电激转化法过程为制备 的重组Ti质粒DNA 0. 1 ug与1 mL感受态根癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细 菌转化模式进行电激转化。将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基29°C摇瓶培养过夜 至对数生长后期，按1:10接种到扩大的培养体系继续摇瓶4 h。结果表明，构建的iaaM基 因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
[0036] 2.利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植 株 1) 外植体预培养：黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至5cm时 剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化； 2) 黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化：将黄花蒿幼苗子叶在实施例3中得 到的培养至对数生长后期的根癌农杆菌液中侵泡30min ; 3) 诱导愈伤组织：将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +500 mg/L 羧苄青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固体培养基上培养2d进行诱导抗性愈伤组织； 4) 抗性再生植株的筛选：抗性愈伤组织团生长至3. 5_大小，取出叶盘采用无菌吸水 纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧苄青霉 素+20mg/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基， 温度控制在23°C之间，16h/8h进行光暗交替培养；32d后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤 部分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至4cm后，将其从愈伤组织 基部切下，并将其移入1/2 MS+0. 5mg/L ΝΑΑ+0. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂的MS3生 根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在23°C之间，16h/8h进 行光暗交替培养；根诱导分化14d后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7d，然后移 栽至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株。
[0037] 3.转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察 提取转基因黄花蒿植株叶片DNA，PCR法进行基因扩增检测；并对转基因青蒿腺毛发育 细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析，具体操作为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光 体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿 比较，可以估测青蒿素含量提高情况。
[0038] 4.建立转基因黄花高品系 筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿 素含量的黄花蒿品系。
[0039] 以上实施例利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因 黄花蒿植株。并通过对黄花蒿腺毛细胞发育情况进行观察，结果表明本发明中转iaaM基因 显著提高了黄花蒿中青蒿素的含量，转iaaM基因黄花蒿中青蒿素的含量最高可达15. 8mg/ g DW，是非转化黄花蒿含量的1. 5倍。通过筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株， 经过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系，为规模化生产青蒿素提供了一 种可行方法。
[0040] 以上对本发明所提供的一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法进行了 详细介绍，本文中对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮 助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思 想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对 本发明的限制。 〈11〇>赵燕 〈120> -种转iaaM基因提高青蒿中青蒿素含量的方法 <160> 1 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 2268 <212> DNA 〈213> 根癌农杆菌（agrobacterium tumefaciens) <400> 1 atgtcagcct catctcttct tgataaacaa tgcgatcatt tctctaccaa aattgtggat 60 ctgataatgg tcgacaaggc tgatgagttg gaccgccgcg ttgccgcagc cttctcagaa 120 cgagaagctt cgagggaaag aagaattagt caaatttccg gcgagtgcaa cgctgggtta 180 gcttgcaaaa ggctggccga cggtcgcttt ccggagatat cagccggtca gagggtcgca 240 gtcctctccg cttacatcta tgttggcgag gaaattctga ggtggatact cgaaccagaa 300 gcttcggtgc gaacaagagt gagtggtctc gttgccatcg accttgcacc atcttgcatg 360 gatatttcca gagctcaact tctccaaacc atgaatttgc tgagtggtaa aagatgtgca 420 cccagcgacc ttagtcattt cgtggccatt tcaatctctg agactgcccg ctcccgaacc 480 ctgcaaatgg cgccgtacga agaaggctcg ttgaaaagcg ttaccgggtt taccgtaatc 540 attgaagagg cagtaccatt tgacatggta gcttatggtc gaaacctgat gctgaaagcc 600 tcggcagggt cctttccaac gatcgacttg ctctatgact acagattgtt tctcgacaaa 660 tgttccgata gtgggcggat cggcttcttt ccggaagatg ttcccaggcc aaaagtagcg 720 gtcattgggg ctggcatttc cgggctcgtg gtggcaagcg aactgcttca tgctggcgta 780 gacgatgtta caatatatga agcaggtgat cgggttggag gtaagctttg gtcacatgcc 840 ttcaaggacg ctccgggcgt cgtggccgaa atgggggcga tgcgatttcc tcctgctgca 900 tcgtgcttgt ttttcttcct cgagcgatac ggtctgtctt cgatgaggcc gttcccaaat 960 cccggcacag tcgacactga cttggtctac gagggttgcc gatacatgtg gaaagccggg 1020 cagcagccac cgaagttgtt ccatcgcgtt tacagcgggt ggcatgcgtt cttgaaggac 1080 ggtttccttg agggagatat tgtgttggcg tcgcctgatg ctatcactga ggccttgaaa 1140 tcaggggaca ttaggcgggc tcatgactcc tggcaaattt ggctgaaccg tttcgggagg 1200 gagtcgttct cctcagcgat agagaggatc tttctgggca cgcatcctcc tggtggagaa 1260 acatggagtt tccctcatga ttgggaccta ttcaagctaa tgggaatagg atctggcggg 1320 tttggtccag tttttgaaag cgggtttact gagatccttc gcttggtcat aaacggatat 1380 gaagaaaatc agcggatgtg ctctgaagga atctcagaac ttccacgtcg aatagcctct 1440 caagtggtta acggtgtgtc tgtaagccag cgtatacgcc atgttcaagt cagggcgatc 1500 gagaaggaaa agacaaaaat aaagataagg cttaagagcg ggatatcaga actttatgat 1560 aaagtggtgg ttacatctgg actcgcaaat atccaactca ggcattgtct gacatgcgat 1620 accaccattt ttcgtgcacc agtgaaccaa gcggttgata acagccacat gacaggctct 1680 tcaaaactct tcctgctgac tgaacgaaaa ttttggtttg accatatgct cccgtcctgt 1740 gtcctcatgg acgggttcgc aaaagcagtc tattgcctgg actatgagcc gcaggatccg 1800 aacggtaaag gtctggtgct catcagttat acatgggagg acgactccca caagctattg 1860 gcggtccccg acaaaaaaga gagattatgt ctgctgcgtg acgcaatttc aaaatctttc 1920
【权利要求】
1. 一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1、构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体：将iaaM基因与G12基因启 动子重组，克隆到Ti质粒的T-DNA区pBI121质粒的Hindlll及PstI位点，以NPT-II基因为 选择标记基因，载体以PBI121作为出发载体进行改造和载体构建，获得pBI121-G12-iaaM 的重组Ti质粒，提取重组Ti质粒做PCR检测和酶切验证； 步骤2、工程化根癌农杆菌菌株的制备：构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根 癌农杆菌，转化后的根癌农杆菌经过筛选、培养至对数生长后期，所述的根癌农杆菌为 LBA4404 ； 步骤3、利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植 株，具体包括以下步骤： 1) 外植体预培养：黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至4-6cm时 剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化； 2) 黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化：将黄花蒿幼苗子叶在培养至对数生 长后期的根癌农杆菌液中侵泡30min ; 3) 诱导愈伤组织：将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转 接到 MS+1% 6-BA+0. 05% NAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂 +500 mg/L 羧苄青霉素 +20 mg/L 卡那霉 素的MSI固体培养基上培养2d进行诱导抗性愈伤组织； 4) 抗性再生植株的筛选：抗性愈伤组织团生长至3-4_大小，取出叶盘采用无菌吸水 纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 05mg/L NAA+500mg/L羧苄青霉 素+20mg/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基， 温度控制在22-24°C之间，16h/8h进行光暗交替培养；28-35d后诱导出抗性丛生芽，切下 带芽愈伤部分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至3-5cm后，将其 从愈伤组织基部切下，并将其移入1/2 MS+0. 5mg/L NAA+0. 5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼 脂的MS3生根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在22-24°C之 间，16h/8h进行光暗交替培养；根诱导分化14d后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼 苗7d，然后移栽至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株； 步骤4、转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察：提取转基因黄花蒿植株叶 片DNA，PCR法进行基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行 观察与分析； 步骤5、建立转基因黄花蒿品系：筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过 组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。
2. 根据权利要求1所述的一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征 在于，所述步骤1中G12基因启动子获得途径为：从GenBank中的Nucleotide数据库中获 得拟南芥G12基因核心序列，根据其核苷酸序列设计两条特异性引物，对拟南芥基因组DNA 扩增，获得G12基因启动子。
3. 根据权利要求1所述的一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在 于，所述步骤2中电激转化法过程为制备的重组Ti质粒DNA 0. 1 ug与1 mL感受态根癌农 杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细菌转化模式进行电激转化。
4. 根据权利要求1所述的一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在 于，所述步骤2中根癌农杆菌筛选与培养过程为将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基 28-30°C摇瓶培养过夜至对数生长后期，按1:10接种到扩大的培养体系继续摇瓶4 h。
5.根据权利要求1所述的一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在 于，所述步骤4中转基因黄花蒿植株腺毛发育细胞情况及青蒿素含量观察与分析过程为取 转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺 毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿比较，可以估测青蒿素含量提高情况。
【文档编号】A01H5/00GK104059940SQ201410278312
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】赵燕, 荆风雪, 张学文, 傅瑶, 宋南, 刘爱云 申请人:赵燕