杀虫剂的筛选测定法

杀虫剂的筛选测定法
【专利摘要】本发明涉及多肽，优选来自黑腹果蝇的多肽(DmShal)作为杀虫剂的靶标。
【专利说明】杀虫剂的筛选测定法
[0001] 本申请是申请日为2009年11月5日、发明名称为"杀虫剂的筛选测定法"的中国 专利申请200980153714. 3 (国际申请号PCT/EP2009/064700)的分案申请。
[0002] 本发明涉及作为杀虫剂祀标的优选来自黑腹果蝇（Drosophila melanogaster)的 具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）活性的（DmShal)钾通道。在 一个实施方案中，电压门控性钾通道Shal与其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白），优 选地其假定的辅助蛋白CG5890,果蝇属KChIP(钾通道相互作用蛋白）直向同源物共表达。
[0003] 本发明提供具有优选来自黑腹果蝇（DmShal)昆虫电压门控性钾通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker样）及其辅助蛋白KChIP (钾通道相互作用蛋白），优选其 假定的辅助蛋白CG5890,果蝇属KChIP (钾通道相互作用蛋白）直向同源物活性作为杀虫剂 靶标的多肽，提供编码具有昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）及 其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功 能等同物。
[0004] 本发明还涉及具有昆虫电压门控性钾通道Shal和/或其辅助蛋白KChIP (钾通道 相互作用蛋白）活性的多肽，在鉴定降低昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或 Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的杀虫活性化合物的方 法和测定法中的用途。此外，本发明涉及通过上述方法鉴定的杀虫化合物和这些化合物用 作杀虫剂的用途。
[0005] 在另一实施方案中，本发明涉及具有优选来自黑腹果蝇Shaker钾通道活性 的作为杀虫剂靶标的钾通道。在一个实施方案中，Shaker通道与优选来自黑腹果蝇的 HyperkineticP亚基，优选H-kvP亚基A或C亚型共表达。
[0006] 本发明还提供在杀虫剂筛选测定法中使用的具有优选来自黑腹果蝇昆虫Shaker 通道和Hyperkinetic^亚基，优选H-kvP亚基A或C亚型活性的多肽，提供编码具有昆 虫Shaker通道和HyperkineticP亚基，优选H-kvP亚基A或C亚型活性的多肽的新核酸 序列及其上述核酸序列的功能等同物。
[0007] 本发明此外还涉及具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基， 优选H-kv β亚基A或C亚型活性的多肽分别在鉴定分别降低昆虫Shaker通道和 Hyperkinetic β亚基，优选H-kv β亚基A或C亚型活性的杀虫活性化合物中的方法和测定 中的用途。此外，本发明涉及通过上述方法鉴定的杀虫化合物和这些化合物用作杀虫剂的 用途。
[0008] 在另一实施方案中，本发明涉及具有优选来自黑腹果蝇酚乙醇胺受体活性的作为 杀虫剂革巴标的G蛋白偶联受:体（GPCR)。
[0009] 本发明还提供杀虫剂的筛选测定法中使用的具有优选来自黑腹果蝇酚乙醇胺受 体活性的多肽，提供编码具有优选来自黑腹果蝇酚乙醇胺受体活性的多肽的新核酸序列及 其上述核酸序列的功能等同物。
[0010] 本发明还涉及具有选自优选来自黑腹果蝇〇a2、Oamb、Oct-0-2R和Oct-0-3R 的酚乙醇胺受体活性的多肽，在鉴定降低选自优选来自黑腹果蝇〇a2、Oamb、Oct-β-2R和 Oct-β-3R的酚乙醇胺受体活性的杀虫活性化合物的方法和测定中的用途。此外，本发明涉 及通过上述方法鉴定的杀虫化合物和这些化合物用作杀虫剂的用途。
[0011] 在另一实施方案中，本发明涉及作为杀虫剂靶标的SK-通道。
[0012] 本发明此外提供作为杀虫剂靶标的具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多 肽，提供编码具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序 列的功能等同物。
[0013] 本发明还涉及具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽，在鉴定降低昆虫小 电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活性化合物的方法和测定中的用途。此外，本发明涉及通 过上述方法鉴定的杀虫化合物和这些化合物用作杀虫剂的用途.
[0014] 昆虫引起许多人和动物疾病。昆虫还引起相当大的农业和财产损害，导致经济损 失。尽管使用和滥用了所有的昆虫毒药，但是昆虫还是每年破坏超过30%的全球粮食作 物。
[0015] 已经开发出许多方法以限制由昆虫引起的破坏。
[0016] 一种方法是使用用于昆虫控制的化学药品。许多杀虫剂如DDT的问题在于它们需 要高浓度应用和它们具有非特异的广谱活性的事实。化学杀虫剂通常影响有益和无益的物 种。它们当中许多久存于环境中并且因此在食物链中积累。
[0017] 另一种方法是表达杀虫毒素，例如来自细菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)蛋白质毒素的转基因作物。
[0018] 昆虫害虫有获得对所有杀虫剂抗性的倾向，因为它们具有适应其环境的罕见能 力，这是因为它们具有在昆虫群体中引起快速出现抗性的机制，如短生活周期、高繁殖率和 长距离行进的能力。现在，表现出杀虫剂抗性的害虫在日益增加。
[0019] 因此，仍然有寻找具有对昆虫害虫极其特异作用的有效且经济的杀虫剂的需求。 杀虫剂越有效，其造成的环境危险越小。
[0020] 这可以通过鉴定和分离编码将会控制昆虫发育和/或存活的蛋白质的基因实现。
[0021] 本发明提供昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或 其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）作为杀虫剂的新的靶标。本发明还提供用于鉴 定降低昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋白 KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。
[0022] 在许多果蝇属胚胎和幼体神经元中发现的外向电压依赖性K+电流源于Shaker 家族成员 Shaw、Shab 和 Shal 产生的混合电流（Tsunoda，S.和 L. Salkoll (1995) J Neuroscience. March ; 15 (3) : 1741-1754)。Shal 产生这些宏观 K+ 电流的瞬时部分（"A-型" 电流）并且通过例如某些神经元中引起延缓的电流脉冲调整这些电流（Yu，D.，Feng，C.和 A. Guo (1999) J Neurobiology· Aug ;40 (2) : 158-70)。选择性剪接、翻译后修饰和其他 Shal 相关的加工可能部分地负责在这些神经元中观察到的广泛的调整（Choi，J.C.，Park，D.和 L. C. Griffith (2004) J Neurophysiology. 91:2353-2365)。
[0023] 已经证明Kv4. x(Shal)辅助蛋白KChIP可能通过促进四聚体通道组装急剧增加 Shal向细胞膜的运输，和引起Shal通道门控特性的不同变化（Kunjilwar，K. , Strang, C.，DeRubeis，D.和 P.J. Pfaffinger (2004) J Biological Chemistry. Dec ;279 (52): 54542-54551)。
[0024] 不管Shal在神经元传导中的作用如何，对于该靶标的确认案例仍有待确立。我 们的原位数据表明在胚胎腹神经索和内脏肌肉组织中低水平表达。位于Berkeley的果蝇 属基因组计划显示在胚胎/幼体内脏肌肉、纵向内脏肌肉纤维、腹中线和胚胎中枢神经系 统包括腹神经索中有染色。DmShal mRNA是在胚胎中期表达达到高峰的罕见转录物（内部 Lynx数据）。在哈佛医学院果蝇保藏中心有两个内含子转座子插入系，但是没有与此相关 的生存力数据，并且也得不到其它的Shal突变体。在公众领域也没有微列阵或者northern 数据。
[0025] 在市场上还没有已经鉴定具有Shal钾通道调节作为其主要作用方式的杀虫剂， 这意味着化合物不仅仅通过杀虫活性的"副作用"起作用，而且其活性是关键的致死作用。
[0026] 在另一实施方案中，本发明提供分别作为杀虫剂新靶标的昆虫Shaker通道和/或 HyperkineticP亚基，优选H-kvP亚基A或C亚型。本发明还提供用于鉴定分别降低昆虫 Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或C亚型活性的杀虫活性化 合物的方法和测定法。
[0027] 果蝇Hyperkinetic (Hk)突变改变编码哺乳动物K+通道P亚基同系物的基因。 Wang 等（Biophysical Journal Volume71，Decemberl996, 3167-3176)已经证明，Hk P 亚 基调节大范围的 Shaker (Sh)K+ 电流特性。从 CH0UINARD 等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92，pp. 6763-6767, Julyl995Neurobiology)还可知道Hk与Sh在爪蟾卵母细胞中共表 达，这证明该共表达增加电流波幅并且改变电压依赖性和活化与失活的动力学。
[0028] 令人惊奇地发现，Shaker通道和Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或B 亚型的共表达导致产生新的杀虫剂筛选测定法。
[0029] 在市场上还没有已经鉴定具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选 H-kv β亚基A或C亚型调节作为其主要作用方式的杀虫剂，这意味着化合物不仅仅通过杀 虫活性的"副作用"起作用，而且其活性是关键的致死作用。
[0030] 在另一实施方案中，本发明提供选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-i3-2R和 Oct-β -3R的昆虫酚乙醇胺受体作为杀虫剂的新靶标。本发明还提供用于鉴定降低选自优 选来自黑腹果蝇〇a2、Oamb、Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的杀虫活性 化合物的方法和测定法。
[0031] 酚乙醇胺是结构上与去甲肾上腺素有关的生物源单胺，其是在脊椎动物外周和中 枢神经系统中介导不同生理过程的主要神经递质、神经调质和神经激素。酚乙醇胺与酪胺 一起仅是神经活性的非肽递质，其生理作用局限于脊椎动物。
[0032] 酚乙醇胺的作用通过多种受体类别像oa2、Oamb、Oct-β -2R或Oct-β -3R介导。
[0033] 酚乙醇胺受体仅仅/主要发现于无脊椎动物中这一事实使得它们成为杀虫剂的 重要的靶标。因此，特异性调节酚乙醇胺受体的化合物将具有低的脊椎动物毒性。除了选 择性之外，酚乙醇胺受体由于其在神经元中表达而成为杀虫剂的良好靶标。酚乙醇胺与酪 胺一起仅是神经活性的非肽递质，其生理作用局限于无脊椎动物。
[0034] 虽然酚乙醇胺是昆虫中的主要神经介质，但是已经证明其受体难以克隆。目前，仅 少数酚乙醇胺受体已经被克隆。
[0035] 本发明提供克隆章鱼碱受体并将其引入优选细胞的膜中的方法。优选地，额外连 接的蛋白质引入到膜中。
[0036] 取决于受体同种型，酚乙醇胺受体可通过环AMP产生或细胞内钙释放调节它们的 活性。酚乙醇胺受体，优选〇a2内源性地通过cAMP传导信号。受体活性的检测是困难的。
[0037] 因此，本发明提供强制偶联至钙的方法，这导致当其活化时钙释放。钙释放通过 荧光的钙传感染料测量。
[0038] 令人惊奇地发现，选自优选来自黑腹果蝇oa2、0amb、0ct_ β -2R和Oct- β -3R的酚 乙醇胺受体的表达和泛宿主性G-α蛋白的表达导致产生新的杀虫剂筛选测定法。
[0039] 当配体结合至GPCR细胞外部分时，GPCR介导跨细胞膜的信号转导。GPCR的细胞 内部分与G-蛋白相互作用以调整从细胞外至细胞内部的信号传导。因此，GPCR被称作"偶 联"至G-蛋白。G-蛋白由三个多肽亚基组成：结合和水解GTP的α亚基，和二聚体的β γ 亚基。某些G-蛋白被认为是"泛宿主性"G-蛋白，因为它们的G亚基允许它们偶联至正常 情况下与其它家族G-蛋白偶联的GPCR。
[0040] 在市场上还没有已经鉴定具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct- β -2R和 Oct-i3_3R的酚乙醇胺受体调节作为其主要作用方式的杀虫剂，这意味着化合物不仅仅通 过杀虫活性的"副作用"起作用，而且其活性是关键的致死作用。
[0041] 在另一实施方案中，本发明提供作为杀虫剂的新靶标的小电导钙激活钾通道。本 发明还提供用于鉴定降低昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活性化合物的方法和测 定法。
[0042] 钙激活钾通道是由细胞内钙增加所活化的功能多种多样的一组离子通道。在哺乳 动物中，它们主要存在于神经细胞中，在其中它们促进动作电位的形成并调节神经元兴奋 性。更加具体而言，它们的电流是动作电位后超极化的基础；它们还表现出参与神经元放电 频率精度（对于综述见：Stocker 等，Nature Reviews Neuroscience5, 2004)。
[0043] 该类型钾通道基于单通道导电性存在于三大通用类型中。大、中和小电导通道分 别被称作BK、IK和SK。在果蝇中，基因分别被称作slo、slack和SK。
[0044] 每一类型的钾离子通道表现出不同的药理学特性。钾离子通道与大量生理过程相 关，包括心跳的调节、动脉的扩张、胰岛素的释放、神经细胞的兴奋和肾电解质运输的调节。 因此，钾离子通道早已知作为治疗大量疾病中的治疗靶标，如W02005 099711和US2005 0239800中所公开。
[0045] 特别地，SK通道已经显示具有不同的药理学特性。如在W02005 100349中所公开， 使用膜片钳技术发现不同化合物具有临床相关的心理活性。所评价的化合物结构上与三环 抗抑郁剂相关并且包括阿米替林、卡马西平、氯丙嗪、赛庚啶、丙咪嗪、他克林和三氟拉嗪。 发现所测试的每一化合物以微摩尔亲和性封闭SK2通道电流。存在影响SK通道的大量神 经肌肉抑制剂，如蜂毒明肽、阿曲库铵、泮库溴铵和筒箭毒碱（Shah等，Br J Pharmac〇1129 : 627-30(2000))。
[0046] 还描述了使用SK通道作为药物活性化合物靶标用于治疗疾病的测定法：
[0047] 重组大鼠脑SK2通道在HEK293哺乳动物细胞中表达以通过膜片钳技术研究中 心作用性肌肉松弛剂化合物如氯唑沙宗的作用（Cao等，J. PharmacoI. Exp. Ther. 296 : 683-689, 2001)。还使用转化的HEK293细胞通过膜片钳技术研究了金属离子对重组人SK4 通道活化的影响（Cao 等，FEBS，446 :137-141，1999)。
[0048] 鉴定增加或降低经钙激活钾SK通道的钾离子流的化合物的方法描述于 W098/11139 中。
[0049] 时至今日，典型的昆虫中的分子靶标是乙酰胆碱酯酶、电压依赖性钠通道、离子型 受体例如烟喊型乙酸胆喊和GABA受体。Gautier等（J. Pharm. Exp. Therapeutics, jpet. 1 07. 128694,2007)已经得到了钙激活钾通道作为间接靶标参与杀虫剂神经毒性的证据。他 们通过使用反义寡核苷酸处理蟑螂（美洲蟑螂（Periplaneta americana))DUM(背侧不成 对中线）神经元敲低DUM神经元BK通道，指出DMDS (二甲基二硫）抑制钙激活钾电流。
[0050] 抑制Ca2+激活钾通道活性的另外的特异毒素已经从几种生物中鉴定，最熟知的 是如在US5, 607, 843中所述的来自蜂毒的蜂毒明肽。
[0051] 然而，目前在市场上还没有已经鉴定具有Ca2+激活钾通道，优选SK通道调节作为 其主要作用方式的杀虫剂，这意味着化合物不仅仅通过杀虫活性的"副作用"起作用，而且 其活性是关键的致死作用。
[0052] 通常，极大地需要检测可能组成杀虫剂新靶标的多肽。原因是上述抗性问题和不 懈的努力以鉴定新的杀虫活性成分，其通过尽可能宽的作用谱、生态和毒理学可接受性和/ 或低应用率相区别。
[0053] 现在本发明提供昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/ 或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）作为杀虫剂靶标和用于鉴定降低昆虫电压门 控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP (钾通道相互作 用蛋白）活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。
[0054] 本发明还分别提供Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选H_kv β亚基A 或C亚型作为杀虫剂祀标和用于鉴定分别降低Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基， 优选H-kv β亚基A或C亚型活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。
[0055] 本发明还提供选自优选来自黑腹果蝇oa2、0amb、0ct_P -2R和Oct-β -3R的酚乙 醇胺受体作为杀虫剂靶标和用于鉴定降低选自优选来自黑腹果蝇〇a2、Oamb、Oct- β -2R和 Oct-β -3R的酚乙醇胺受体活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。
[0056] 本发明此外提供昆虫小电导Ca2+激活钾通道作为杀虫剂靶标和用于鉴定降低昆 虫小电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活性化合物的方法和测定法。
[0057] 实际上，新靶标的检测具有极大困难，因为多肽活性的抑制经常对昆虫的存活无 进一步的影响。这可归因于昆虫可以转变至替代的活性这一事实，由此编码蛋白质的基因 的数量比微生物中的高至少3倍。
[0058] 此外，以SK-通道为例，关于在人医学中的研究结果，例如W02005 100349,其教导 甚至对经钾离子通道的钾离子流的抑制在治疗疾病中是有用的，令人惊奇的是本发明的SK 通道是杀虫剂的靶标，因为它们影响其存活。
[0059] 本发明的目标是鉴定对于昆虫发育或存活必需的新靶标，和提供适宜鉴定杀虫活 性化合物的方法。
[0060] 我们发现，该目标通过使用具有昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或 Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽实现。
[0061] 本发明的一个实施方案涉及用于鉴定降低具有昆虫电压门控性钾通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活 性的多肽的杀虫活性化合物的方法，该方法包括：
[0062] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有昆虫电压门控性钾通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活 性的多肽，
[0063] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力 的化合物，
[0064] c)检测所述多肽的活性，和
[0065] d)鉴定在（b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。
[0066] 在另一实施方案中，我们发现，该目标通过分别使用具有昆虫Shaker通道和/或 HyperkineticP亚基，优选-kvP亚基A或C亚型活性的多肽实现。
[0067] 本发明的一个实施方案涉及用于鉴定分别降低具有昆虫Shaker通道和/或 Hyperkinetic β亚基，优选-kv β亚基A或C亚型活性的多肽活性的杀虫活性化合物的方 法，所述方法包括：
[0068] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、分别具有昆虫Shaker通道和/或 HyperkineticP亚基，优选-kvP亚基A或C亚型活性的多肽，
[0069] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力 的化合物，
[0070] c)检测所述多肽的活性，和
[0071] d)鉴定在（b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。
[0072] 在另一实施方案中，我们发现，该目标通过使用具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、 Oamb、Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽实现。
[0073] 本发明的一个实施方案涉及用于鉴定降低具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、 Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽活性的杀虫活性化合物的方法， 所述方法包括：
[0074] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、 Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽，
[0075] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力 的化合物，
[0076] c)检测所述多肽的活性，和
[0077] d)鉴定在（b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。
[0078] 在另一实施方案中，我们发现，该目标通过使用具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道 活性的的多肽实现。
[0079] 本发明的一个实施方案涉及鉴定降低昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的杀虫活 性化合物的方法，所述方法包括：
[0080] a)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性 的多肽，
[0081] b)在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力 的化合物，
[0082] c)检测所述多肽的活性，和
[0083] d)鉴定在（b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。
[0084] 根据本发明，膜是类似于半渗透板或层的结构，其充当两相或溶液之间的屏障， 因此膜是溶剂渗透性的，优选水渗透性的。在一个实施方案中，膜是生物的膜、生物膜或 者脂质层或者脂质双层。膜优选由流体脂质双层组成。在一个实施方案中，膜是细胞的 外表面、细胞腔室、泡、脂质体（由为两性分子的磷脂组成的泡）、聚合物囊泡或者合成体 (synthosome)〇
[0085] 聚合物囊泡常常称作"聚合物体"，其已经被详细研究并且进展已经在综述中总结 [Discher等，Science2002, 297 ;967973]。聚合物体或聚合物囊泡由自组装的二或三嵌段 共聚物组成。
[0086] 合成体是功能化的纳米腔室系统，其已经被开发出用于推定的生物技术应用
[Nardin等，Chem. Commun. 2000,14331434]。合成体是中空球体，其由具有嵌段共聚物膜的 机械稳定囊泡和充当选择性门的工程改造跨膜蛋白组成。
[0087] 本发明的优选昆虫的电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/ 或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）被装配入或嵌入、植入或整合入膜中，这些术 语是同义词并且可互换。
[0088] 本发明的优选昆虫的Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选_kv β亚基 A或C亚型被分别装配入或嵌入、植入或整合入膜中，这些术语是同义词并且可互换。
[0089] 本发明的优选昆虫的选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R 的酚乙醇胺受体被装配入或嵌入、植入或整合入膜中，这些术语是同义词并且可互换。
[0090] 昆虫小电导Ca2+激活钾通道被装配入或插入、植入或整合入膜中，这些术语是同 义词并且可互换。
[0091] 为了本发明的目的，通常复数旨在包括单数，反之亦然。
[0092] 除非另外指出，术语"多核苷酸"、"核酸"和"核酸分子"在本文上下文中可互换。 除非另外指出，术语"肽"、"多肽"和"蛋白质"在本文上下文中可互换。术语"序列"将涉 及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于术语"序列"所使用的环境。如本 文所使用的术语"一个或多个基因"、"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或"一个或多 个核酸分子"指任何长度的聚合形式的核苷酸，或者是核糖核苷酸或者是脱氧核糖核苷酸。 这些术语仅指分子的一级结构。
[0093] 因此，如本文所使用的术语"一个或多个基因"、"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸 序列"或"一个或多个核酸分子"包括双链和单链DNA和RNA。它们还包括已知类型的修饰， 例如具有类似物的一个或一个以上天然存在核苷酸的甲基化作用、"加帽"、取代。优选地， DNA或RNA序列包含编码本文所定义多肽的编码序列。
[0094] "编码序列"是这样的核苷酸序列，当其置于适当的调节序列控制之下时被转录成 RNA，例如调节RNA如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核糖核酸酶等或者被转录成被翻 译成多肽的mRNA。编码序列的边界通过位于5' -末端的翻译起始密码子和位于3' -末端 的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括，但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因 组DNA，而在某些情况下也将出现内含子。
[0095] 如在本文上下文中所使用，核酸分子还可以包括位于编码基因区3'和5'端的非 翻译序列，例如编码区5'端上游序列的至少500、优选200、特别优选100个核苷酸和编码 基因区3'端下游序列的至少100、优选50、特别优选20个核苷酸。在例如反义核酸、RNAi、 snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核糖核酸酶等技术的情况下，可有利地 使用编码区以及5' -和/或3' -区。
[0096] 然而，仅选择编码区用于克隆和表达目的常常是有利的。
[0097] "多肽"指氨基酸的聚合物（氨基酸序列）并且不指特定长度的分子。因此，肽和 寡肽被包括在多肽的定义之内。该术语还指或者包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰 化、磷酸化等等。定义所包含的是例如包含一个或更多个氨基酸类似物（包括例如非天然 氨基酸等）的多肽、具有取代连接的多肽，以及本领域已知的天然存在或者非天然存在的 其他修饰。
[0098] 术语"包含"、其语法变体当在本说明书中使用时用于指其所述特征、整数、步骤或 构成成分或基团的存在，但不排除其一种或更多种其他特征、整数、步骤、构成成分或基团 的存在或加入。
[0099] 术语"减少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"涉及生物、生物部分如组织或细胞内特性 的相应改变。"特性的改变"应当理解为活性以相对于对照、参照或野生型相应容量或数量 蛋白质的指定容量或指定数量蛋白质的改变。
[0100] 术语"减少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"包括所述特性在仅本发明受试者的部分中 的改变，例如修饰可以存在于细胞腔室如细胞器中或者生物的部分如组织、翼、腿、躯干等 中。优选地，"减少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"被发现于细胞内的，因此术语"活性的减少、 降低或抑制"涉及与野生型细胞或者对照细胞相比细胞内的减少、降低或抑制。
[0101] 因此，术语"减少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"意思是指，基因产物蛋白质或者调节 性RNA比活性以及化合物或如多肽、核酸分子代谢物、离子或编码mRNA或DNA的量可以在 比容量内被减少、降低或抑制。术语"减少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"包括，对于所述"减 少"、"阻抑"、"降低"或"抑制"的理由可以是向生物或其部分施用的化学化合物。
[0102] 术语"减少"、"阻抑"或"降低"是可互换的。如果不另外指出的话，术语"减少"将 包括术语"阻抑"，"降低"或"抑制"。
[0103] 减少还理解为意思是指活性的修饰。在该上下文中，功能或活性，如"功能性活性" 或"生物学活性"与对照、参照或野生型相比减少至少10%、有利的20%、优选30%、特别 优选40%、50%或60%、非常特别优选70%、80%、85%或90%或更多，非常特别优选的是 95%，更优选地是99%或更高。最优选地，活性的减少、降低或缺失总计基本上100%。因 此，特别有利的实施方案是失活，例如化合物如多肽或核酸分子功能的抑制。
[0104] 术语"野生型"、"对照"或"参照"可互换并且可以是没有根据本文所述方法修饰或 处理的生物的细胞或部分，例如细胞器或组织，或者生物，特别是昆虫。因此，用作野生型、 对照或参照的生物的细胞或部分，例如细胞器或组织，或者生物，特别是昆虫尽可能对应于 其细胞、生物或部分并且除了本发明方法的结果，在任何其他性质中尽可能与本发明的主 题相同。因此，野生型、对照或参照被同样地处理或者尽可能相同的处理，也就是说，仅条件 或特性将不同，这不影响所测试特性的性质。
[0105] 优选地，任何比较在相似条件下开展。术语"相似条件"意思是指所有条件例如培 养或生长条件、测定条件（例如缓冲液组成、温度、底物、病原体品种、浓度等等）在待比较 的实验之间保持相同。
[0106] "参照"、"对照"或"野生型"优选没有用本发明所述方法修饰或处理的并且具有与 本发明受试者尽可能相似的任何其他特性的受试者，例如细胞器、细胞、组织、生物、特别是 昆虫。参照、对照或野生型在其基因组、转录物组、蛋白质组或代谢物组上尽可能与本发明 受试者相似。优选地，术语"参照"、"对照"或"野生型"细胞器、细胞、组织或生物涉及遗传上 与本发明的细胞器、细胞、组织或者生物或其部分几乎相同，优选95%、更优选98%、甚至 更优选 99.00%、特别是99.10%、99.30%、99.50%、99.70%、99.90%、99.99%、99.999% 或更高相同的细胞器、细胞、组织或者生物。最优选地，"参照"、"对照"或"野生型"是除了负 责核酸分子活性赋予核酸分子或它们所编码的基因产物根据本发明的方法被修正、操作、 交换或引入之外，与根据本发明方法使用的生物、细胞或细胞器遗传上相同的受试者，例如 细胞器、细胞、组织、生物。
[0107] 优选地，参照、对照或野生型与本发明的受试者仅在本发明多肽或者本发明方法 中所使用多肽的活性上不同。
[0108] "显著降低"：关于根据本发明的核酸序列所编码多肽的活性，其应理解为意思是 指，与对照相比，例如与没有与测试化合物温育的多肽活性相比，以测试化合物处理的多肽 以测量误差之外的量度降低。
[0109] 关于离子通道的"功能活性"应当理解为离子通道表现出或者参与的任何一个或 更多个功能和/或特性。
[0110] 关于酚乙醇胺受体的"功能活性"应当理解为酚乙醇胺受体表现出或者参与的任 何一个或更多个功能和/或特性。
[0111] 在一个实施方案中，术语具有昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或 Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽的"功能性活性" 或"生物学活性"通过钾离子的跨膜运输定义。
[0112] 在另一实施方案中，术语分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基， 优选H-kv β亚基A或C亚型活性的多肽的"功能性活性"或"生物学活性"通过钾离子跨 膜的运输定义。
[0113] 在另一实施方案中，术语具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、Oamb、Oct-0_2R和 Oct- β -3R的酚乙醇胺受体活性的多肽的"功能性活性"或"生物学活性"通过这样的事实 定义，即酚乙醇胺受体被α-肾上腺素能拮抗剂选择性封闭和被α-肾上腺素能激动剂活 化。
[0114] 在另一实施方案中，术语具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的"功能性 活性"或"生物学活性"通过钾离子跨膜的运输定义。该运输被钙离子以选自200-1000nM、 300-900nM、300-800nM和400-800nM间隔的半最大活化或Ca2+敏感性K0. 5活化。本发明 的SK通道具有选自2-20pS、3-20pS、4-15pS、5-12pS和5-10pS间隔的单通道电导。本发明 多肽的生物学活性是蜂毒明肽不敏感性的。
[0115] 术语化合物的"活性"指生物系统中，例如细胞、器官或者生物内化合物的功能。例 如，术语化合物的"活性"指化合物的酶功能、调节功能或其作为结合配偶体、转运体、调节 物或者载体等的功能。
[0116] 化合物的杀虫活性指所述化合物杀死或者麻痹昆虫的能力，或者以昆虫提供较少 损害的方式抑制昆虫发育或者生长的能力。具有杀虫活性的化合物也被称为对昆虫具有毒 性。化合物的杀虫活性不只引起昆虫的死亡，还包括对昆虫的其它有害作用，例如疾病、抗 饲育剂活性、生长迟缓、降低的繁殖能力和降低的生殖力。
[0117] 如本文所使用的具有杀虫活性的化合物是"杀虫剂"。术语"杀虫剂"通常指不利 影响昆虫生存力的化学药品、生物学试剂和其他化合物，其例如杀死、麻痹农作物保护、人 和动物健康区的昆虫物种、使其不育消灭或者致残。
[0118] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种 多肽的膜实现：
[0119] a)编码SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；
[0120] b)SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子；
[0121] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID N0:2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；
[0122] d)与包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的 核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0123] e)核酸分子，编码与核酸分子（a)至（c)所编码多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分别具有昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或 其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽；
[0124] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0125] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且分别具有昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族 物1或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽产生；
[0126] h)核酸分子，其编码包含SEQ ID NO :33和/或34中分别所述共有序列或SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 中分别所述一个或更多个基 序的多肤；
[0127] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :3、4 ;7、8 ;11、 12 ;15、16 ;19、20 ;23、24 ;27、28和/或31、32中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组 文库得到；
[0128] 和
[0129] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，探针包含 (a)或（b)核酸分子的互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码分别具有昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或 其辅助蛋白KChIP (钾通道相互作用蛋白）活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0130] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现，例如Shal_ delN突变体，其具有2-40个氨基酸编码区的N末端缺失。
[0131] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含具有SEQ ID N0:2、6、10、14、18和/或 22所述电压门控性钾通道Shal或其同源物活性的多肽的至少一种功能等同物或同源物和 /或Shal_delN突变体的膜实现，Shal_delN突变体具有连接至具有SEQ ID NO :26和/或 30中所述其辅助蛋白KChIP或其同源物活性的多肽的2-40个氨基酸编码区的N末端缺失。
[0132] 在另一实施方案中，本发明方法使用包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种 多肽的膜实现：
[0133] a)编码包含SEQ ID勵：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核 酸分子；
[0134] b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分 子；
[0135] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；
[0136] d)与包含SEQ ID勵：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷 酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0137] e)核酸分子，编码与（a)至（c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或 C亚型活性的多肽；
[0138] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0139] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且分别具有昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic β 亚基，优选H-kv β亚基A或C亚型活性的多肽产生；
[0140] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO : 102和/或103中分别所述共有序列或者SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128中分别所述一个或更多个基序的 多肽；
[0141] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ; 92、93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组 文库得到；
[0142] 和
[0143] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码分别具有昆虫Shaker通道和/或HyperkineticP亚基，优选H-kvP亚基A或 C亚型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0144] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、 h) 、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现，由此核 酸分子包含Kozak序列（例如ACCATG)。
[0145] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i) 或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现，由此核酸 分子包含编码Shaker通道的400bp或500bp的5' -片段的序列，优选包含Shaker ATG密 码子，优选加上适当的Kozak,和/或Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β 亚基A或C亚型的1770bp片段。
[0146] 在一个实施方案中，本发明方法使用选自SEQ ID NO :73、75、77、79、81和83的至 少一种多肽或其功能等同物或同源物和选自SEQ ID NO :85和87的多肽或其功能等同物或 同源物的任意组合的膜实现。
[0147] 在另一实施方案中，本发明方法使用包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种 多肽的膜实现：
[0148] a)编码 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174 中所不多肽的核酸分子；
[0149] b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所 不核酸分子；
[0150] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO :130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列；
[0151] d)与包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0152] e)核酸分子，编码与（a)至（c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分别具有选自优选来自黑腹果蝇的〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的昆虫 酚乙醇胺受体活性的多肽；
[0153] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0154] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-0_2R 和Oct-β -3R的昆虫酚乙醇胺受体活性的多肽产生；
[0155] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分别所述共有序列或者 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、 210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 中分 别所述一个或更多个基序的多肽；
[0156] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :131、132 ;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156、159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；
[0157] 和
[0158] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的昆虫酚乙醇 胺受体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0159] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物和另外的标记蛋白质 如GFP的膜实现，由此其优选地与本发明的多肽，例如由选自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)项的核酸分子编码的多肽连接。
[0160] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由SEQ ID NO :173中所述核酸分子或其 同源物编码的，SEQ ID NO :46中所示多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现。
[0161] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、 h)、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物和另外的"泛宿主 性" G-蛋白的膜实现，其G亚基使得G-蛋白与正常情况下与其它家族G-蛋白偶联的GPCR 偶联，由此"泛宿主性" G-蛋白优选地与本发明的多肽，例如由选自a)、b)、c)、d)、e)、f)、 g) 、h)、i)或j)项的核酸分子编码的多肽连接。
[0162] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、 h) 、i)或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物和另外的标记蛋 白质如GFP，和/或另外的"泛宿主性"G-蛋白的膜实现，由此标记蛋白质和/或"泛宿主 性"G-蛋白优选地与本发明的多肽，例如由选自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)项 的核酸分子编码的多肽连接。
[0163] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由SEQ ID NO :173中所述核酸分子或其 同源物编码的，SEQ ID NO :46中所示多肽至少一种功能等同物或同源物和另外的"泛宿主 性"G-蛋白的膜实现，由此蛋白质优选地与其连接。
[0164] 在一个实施方案中，"泛宿主性"G-蛋白是泛宿主性G-α -16-蛋白质或其同源物。
[0165] 在另一实施方案中，本发明方法使用包含由选自下列的核酸分子编码的至少一种 多肽的膜实现：
[0166] a)编码SEQ ID NO :228、230、232中所示多肽的核酸分子；
[0167] b) SEQ ID NO : 227、229、231 中所示核酸分子；
[0168] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO :228、230、232 的多肽序列；
[0169] d)与包含SEQ ID NO :227、229、231所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具 有至少50 %同一'丨生的核酸分子；
[0170] e)核酸分子，编码与（a)至（c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；
[0171] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0172] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；
[0173] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或选自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的多 肽；
[0174] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ;和237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；
[0175] 和
[0176] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0177] 在一个实施方案中，本发明方法使用包含由选自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i) 或j)项所述核酸分子所编码多肽的至少一种功能等同物或同源物的膜实现。
[0178] 术语如上所述多肽的"功能等同物"是基本上赋予如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、 22、26和/或30中所述多肽活性的多肽，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为 SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶联受体为SEQIDN0:130、134、 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 并且至于 SK-通道为 SEQ ID NO :228、 230、232。
[0179] 术语如上所述核酸分子的"功能等同物"是基本上赋予如SEQ ID NO :1、5、 9、13、17、21、25和/或29中所述核酸分子活性的多核苷酸，至于shaker通道和/或 HyperkineticP 亚基为 SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86,至于 G 蛋白偶联受 体为 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 并且至于 SK-通道为 SEQ ID N0:227、229、231。
[0180] 根据本发明，蛋白质或多肽具有如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所 述多肽的活性，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为SEQ ID NO :73、75、77、79、 81、83、85 和 / 或 87,至于 G 蛋白偶联受体为 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、 158、162、166、170和/或174并且至于SK-通道为SEQIDN0 :228、230、232，如果其活性的 减少、阻抑、降低或抑制介导经膜的钾流降低的话。
[0181] 根据本发明，核酸分子或多核苷酸具有如SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或 29中所述核酸分子的活性，至于shaker通道和/或HyperkineticP亚基为SEQ ID NO :72、 74、76、78、80、82、84和/或86，至于G蛋白偶联受体为SEQIDN0:129、133、137、141、145、 149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 并且至于 SK-通道为 SEQ ID NO :227、229、231 如 果其表达的减少、阻抑、降低或抑制介导经膜的钾流降低的话。
[0182] 本发明多肽的同源物（=同源物），特别是由如SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和/或29中所示核酸分子编码或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :33和/或34 中分别所示共有序列或分别选自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70和/或71的一个或更多个基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源 物赋予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。
[0183] 至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，本发明多肽的同源物（=同源物）， 特别是由如SEQ ID勵：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子编码或者包含其 的多肽，或者包含含有SEQ ID NO : 102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO : 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、 122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽的多肽的 同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物赋予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能 等同物。
[0184] 至于G蛋白偶联受体，本发明多肽的同源物（=同源物），特别是由如SEQ ID NO: 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所示核酸分子编码或者包 含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选 自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、 193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一个或更多个基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物赋予本文 所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。
[0185] 至于SK-通道，本发明多肽的同源物（=同源物），特别是由如SEQ ID N0:227、 229、231中所示核酸分子编码或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :239中所示共 有序列或选自 SEQ ID 勵：240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253的一个或更多个基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物赋予本 文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。
[0186] 此外，根据本发明，术语"同源物"涉及生物的、与所述生物的所有表达序列的本文 所述或所列序列具有优选最1?或者基本最1?序列同源性的序列。
[0187] 本领域技术人员已知如何发现、鉴定和证实假定的同源物具有本文所述的相同活 性。如果知道的话，生物中的生物学功能或活性基本上涉及或对应于如对于SEQ ID NO: 1、5、9、13、17、21、25和/或29中所述基因所述的活性或功能，至于shaker通道和/或 HyperkineticP 亚基为 SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86,至于 G 蛋白偶联受 体为 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且至于 SK-通道为 SEQ ID N0:227、229、231。
[0188] 因此，在一个实施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :1、5、9、13、 17、21、25和/或29中所指出序列的核酸分子编码的多肽的序列或者在SEQ ID NO :2、6、10、 14、18、22、26和/或30中所述的多肽序列、如分别在SEQ ID NO :33和/或34中所示的共 有序列或分别选自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一个或更多个基序，或者其是包含SEQ ID勵：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所指出 多核苷酸的核酸分子的表达产物。
[0189] 至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，因此，在一个实施方案中，同源物 或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所指出序列的核酸 分子编码的多肽序列或者在SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所述的多肽 序列、如分别在SEQ ID NO :102和/或103中所示的共有序列或分别选自SEQ ID NO :104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序，或者其是包含SEQ ID NO : 73、75、77、79、81、83、85和/或87中所指出多核苷酸的核酸分子的表达产物。
[0190] 至于G蛋白偶联受体，因此，在一个实施方案中，同源物或功能等同物包含由含有 SEQ ID NO : 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 所指出序列的核 酸分子编码的多肽序列或者在 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、 170和/或174中所述的多肽序列、如分别在SEQ ID NO :177、178和/或179中所示的共 有序列或分别选自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、 和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225和/或226的一个或更多个基序，或者其是包含SEQ ID N0:130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170和/或174中所指出多核苷酸的核酸分子的表达产物。
[0191] 至于SK-通道，因此，在一个实施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :227、229、231所指出序列的核酸分子编码的多肽序列或者在SEQ ID NO :228、230、232 中所述的多肽序列、如在SEQ ID N0:239中所示的共有序列或选自SEQ ID N0:240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序，或者其是 包含SEQ ID N0:228、230、232中所指出多核苷酸的核酸分子的表达产物。
[0192] 本文所公开的关于序列、活性、共有序列、多肽基序和测试的信息将本领域技术人 员引向生物中的各个同源或功能等效表达产物。
[0193] 在一个实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫并且具有至少50 % 的序列同一性并且优选与昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和 /或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）分别具有基本相同或者相似的活性。
[0194] 在另一实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫并且具有至少50% 的序列同一性并且优选与Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或 C亚型分别具有基本相同或者相似的活性。
[0195] 在另一实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫并且具有至少50% 的序列同一'丨生并且优选与选自优选来自黑腹果蝇〇a2、Oamb、Oct-0 -2R和Oct-β -3R的酚 乙醇胺受体具有基本相同或者相似的活性。
[0196] 在进一步的实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫并且具有至 少50%的序列同一性并且优选与昆虫小电导Ca2+激活钾通道具有基本相同或者相似的活 性。
[0197] 在一个实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自昆虫，优选来自选自有 翅亚纲、新翅目、半翅目、鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、拟步行虫总科、拟步行虫科、拟步 行虫属、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果妮科、Drosophilinae 和果妮属的昆虫 并且具有至少50%的序列同一性并且优选与
[0198] i)昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋 白KChIP (钾通道相互作用蛋白），或
[0199] ii) Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选H_kv β亚基A或C亚型，或
[0200] ;1;[;0选自优选来自黑腹果蝇032、(^11]113、〇(31：-0-21?和〇(31：-6-31?的酚乙醇胺受体， 或
[0201] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道
[0202] 分别具有基本相同或者相似的活性。
[0203] 在一个实施方案中，任何一个本发明多肽的同源物衍生自
[0204] i)黑腹果蝇、亚热带粘虫、拟谷盗属、褐稻飞虱，或者
[0205] ii)黑腹果蝇、亚热带粘虫、拟谷盗属、桃蚜、棉蚜和/或苜蓿蚜，或者
[0206] iii)黑腹果蝇、亚热带粘虫（Spodoptera eridania)、赤拟谷盗（Tribolium castaneum)、桃姆（Myzus persicae)和银叶粉風（Bemisia argentifolii)，或者
[0207] iv)昆虫，优选来自选自有翅亚纲、新翅目、半翅目、鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅 目、拟步行虫总科、拟步行虫科、拟步行虫属、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果蝇 科、Drosophilinae and果蝇属的昆虫并且具有至少50 %的序列同一'丨生并且优选与昆虫小 电导Ca2+激活钾通道具有基本相同或者相似的活性。
[0208] 本发明多肽的功能等同物或者同源物分别具有
[0209] i)昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋 白KChIP (钾通道相互作用蛋白），或
[0210] ii)昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基,优选H_kv β亚基A或C亚型， 或
[0211] iii)选自优选来自黑腹果蝇〇82、0&11113、0(^1-21?和0(^-@-31?的昆虫酚乙醇胺 受体，或
[0212] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道
[0213] 的活性
[0214] 和与选自SEQ ID勵：2、6、10、14、18、22、26和/或30的序列所示多肽具有至少 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%或63%、优选至少64%、65%、66%、67%、 68%或69%、更优选至少70%、71%、72%、73%、74%，75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81%、82%、83%、84%或85%、最优选86%、87%、88%、89%或90%、特别优选至少91%、 92%、93%，94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，至于shaker通道和 / 或 Hyperkinetic^ 亚基为 SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85 和 /或87,至于G蛋白偶 联受体为 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且 至于 SK-通道为 SEQ ID N0:228、230、232。
[0215] "功能等同物"在本文上下文中描述在标准条件下与编码具有下列生物学活性的 多肽的核酸序列杂交的核酸序列
[0216] i)昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋 白KChIP (钾通道相互作用蛋白），或
[0217] ii)昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基,优选H_kv β亚基A或C亚型， 或
[0218] ;1;[;0选自优选来自黑腹果蝇032、(^11]113、〇(31：-0-21?和〇(31：-6-31?的酚乙醇胺受体， 或
[0219] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道
[0220] 或上述核酸序列的部分，其能够在细胞或生物内引起具有下列生物学活性的多肽 的表达
[0221] i)昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋 白KChIP (钾通道相互作用蛋白），或
[0222] ii)昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选H_kv β亚基A或C亚型， 或
[0223] iii)选自优选来自黑腹果蝇oa2、0amb、0ct_P-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺 受体，或
[0224] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道。
[0225] 为了开展杂交，有利的是使用如保守区或其它区域长度约10_50bp、优选15_40bp 的短寡核苷酸，其可以以技术人员熟悉的方式通过与其它相关基因的比较确定。然而，本发 明核酸的长度100_500bp的较长片段或完整序列也可用于杂交。取决于所使用的核酸/寡 核苷酸、片段或完整序列的长度或取决于什么类型核酸用于杂交，即DNA或RNA，这些标准 条件可变化。因此，例如，对于DNA: DNA杂合体的解链温度比相同长度DNA: RNA杂合体的解 链温度低大约KTC。
[0226] 标准杂交条件应理解为意思是指，取决于核酸，例如42和58°C之间的温度，在水 性缓冲溶液中具有0. 1至5x之间的SSC浓度（IX SSC = O. 15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7. 2) 或者另外在50%甲酰胺存在下，例如42°C，5x SSC，50%甲酰胺。对于DNA = DNA杂合体的杂 交条件有利的是〇. Ix SSC和约20°C和65°C之间的温度，优选约30°C和45°C之间的温度。 以DNA: RNA杂合体为例，杂交条件有利的是0. Ix SSC和约30°C和65°C之间的温度，优选约 45°C和55°C之间的温度。已经描述的这些杂交温度是解链温度值，其已经通过实例如在甲 酰胺缺乏下长度约100个核苷酸和50%的G+C含量的核酸计算出。对于DNA杂交的实验条 件描述于遗传学的专业教科书中，例如在Sambrook等，〃Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989中，并且可以使用技术人员熟悉的公式，例如作为核酸长度、杂合 体类型或G+C含量的函数计算。技术人员将在下列教科书中找到关于杂交的进一步的信 息：Ausubel 等（eds), 1985, Current 方案 s in Molecular Biology, John ffiley&Sons, New York ；Hames and Higgins(eds),1985, Nucleic Acids Hybridization ：A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press, Oxford ；Brown (ed),1991,Essential Molecular Biology ：A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
[0227] 此外，功能等同物还理解为意思是指，尤其是由根据本发明的核酸序列所编码蛋 白质的各个核酸序列的天然或人工突变和来自其他生物的它们的同源物。
[0228] 因此，本发明还包括，例如，通过修饰SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29的 核酸序列得到的那些核苷酸序列，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86,至于 G 蛋白偶联受体为 SEQ ID NO :129、133、137、 141、145、149、153、157、161、165、169和/或173，并且至于SK-通道为SEQIDN0 :227、229、 231。例如，此类修饰可以通过技术人员熟悉的技术，例如"定点诱变"、"易错PCR"、"DNA改 组"（Nature370,1994，PP. 389-391)或者"交错延伸方法"（Nature Biotechnol. 16,1998， pp. 258-261)产生。此种修饰的目的可以是，例如插入用于限制酶的更多的酶切位点、去除 DNA以便将序列截短、替代核苷酸以优化密码子或加入更多的序列。由所修饰核酸序列编码 的蛋白质必须保留预期的功能，尽管是有偏差的核酸序列，其是下列的生物学活性
[0229] i)昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋 白KChIP (钾通道相互作用蛋白），或
[0230] ii)昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选H_kv β亚基A或C亚型， 或
[0231] iii)选自优选来自黑腹果蝇oa2、0amb、0ct_P-2R和Oct-β-3R的昆虫酚乙醇胺 受体，或
[0232] iv)昆虫小电导Ca2+激活钾通道。
[0233] 因此功能等同物包括本文所述序列的天然存在变体和人工核酸序列，例如已经通 过化学合成得到的那些和适应密码子选择以及从它们衍生的氨基酸序列的那些。
[0234] 对应于包含 SEQ ID 勵：2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于81^1?51'通道和/或 Hyperkinetic^ 亚基为 SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85 和 / 或87,至于 G 蛋白偶联受 体为 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且至于 SK-通道为SEQ ID NO :228、230、232中所示多核苷酸的核酸分子的天然变体同源物的核酸 分子，例如本发明的核酸分子和还可以是cDNA的核酸分子，可以基于它们与本文所公开核 酸分子的同源性，使用SEQ ID勵：1、5、9、13、17、21、25和/或29，至于811&1?51'通道和/或 HyperkineticP 亚基为 SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86,至于 G 蛋白偶联受 体为 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且至于 SK-通道为SEQ ID NO :227、229、231中所示核酸分子，如本发明的核酸分子或其片段作为 杂交探针，根据严格杂交条件下的标准杂交技术分离。
[0235] 有利地用于本发明方法的核酸分子可以基于它们与本文所公开核酸分子的同源 性，使用序列或其部分作为杂交探针并在严格杂交条件下按照标准杂交技术分离。
[0236] 术语"同源性"意思是指，各个核酸分子或所编码的蛋白质是功能和/或结构等效 的。与上述核酸分子同源和为所述核酸分子衍生物的核酸分子是，例如，核酸分子的变体， 所述变体呈现出具有相同的生物学功能，特别是编码具有相同或者基本相同生物学功能的 蛋白质的修饰。它们可以是天然存在的变体，例如来自其他植物品种或物种或突变的序列。 这些突变可天然发生或者可通过诱变技术得到。等位基因变体可以是天然存在的等位基因 变体以及合成产生的或遗传工程产生的变体。结构等同物可以通过例如测试所述多肽与抗 体的结合或者基于计算机的预测鉴定。结构等同物具有相似的免疫学特性，例如包含相似 的表位。
[0237] "杂交"意思是指，核酸分子在常规杂交条件，优选在严格杂交条件下，例如 Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual, 第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989))或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N. Y. (1989)，6. 3. 1-6. 3. 6 中所述的条件下杂交。
[0238] 根据本发明，本发明核酸的DNA以及RNA分子可以用作探针。此外，作为用于鉴定 功能同源物的模板，可以开展Northern印迹分析以及Southern印迹分析。Northern印迹 分析有利地提供关于所表达基因产物的更多的信息：例如表达模式、加工步骤的出现，像剪 接和加帽等。Southern印迹分析提供关于编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织 的附加信息。
[0239] 严格Southern印迹杂交条件的优选、非限定实例是，在6x氯化钠/柠檬酸钠 (=SSC)中于大约45°C下杂交，接着是在0. 2x SSC，0. 1%SDS中于50至65°C，例如在 50°C、55°C或60°C下开展一次或更多次的洗涤步骤。技术人员已知，这些杂交条件因核酸 类型的不同而不同，并且例如当存在有机溶剂时，关于温度和缓冲液的浓度的杂交条件 因核酸类型的不同而不同。"标准杂交条件"下的温度因核酸类型的不同而不同，例如在 具有0.11、0.51、11、21、31、41或5义55(：(?!17.2)浓度的水性缓冲液中在421：和581：之 间，优选在45°C和50°C之间。如果在上述缓冲液中存在一种或多种有机溶剂，例如50% 甲酰胺，标准条件下的温度约40°C、42°C或45°C。对于DNA = DNA杂合体的杂交条件优选 的为例如 〇· lx SSC 和 20°C、25°C、30°C、35°C、40°C或 45°C，优选在 30°C和 45°C之间。对 于DNA:RNA杂合体的杂交条件优选的为例如0. Ix SSC和30°C、35°C、40°C、45°C、50°C或 55°C，优选在45°C和55°C之间。对于例如在甲酰胺缺乏下长度约100bp(=碱基对）和 50%的G+C含量的核酸确定了上述杂交温度。技术人员知道借助于教科书确定所需要的 杂交条件，例如上面提到的教科书或者下列教科书：Sambrook等，"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 ；Hames 和 Higgins(Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization ：A Practical Approach"， IRL Press at Oxford University Press, Oxford ;Brown (Ed. ) 1991, ''Essential Molecular Biology ：A Practical Approach"，IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
[0240] -个此类严格杂交条件的其他实例是在4XSSC中于65°C下杂交，接着在0. IXSSC 中于65°C下洗涤一小时。备选地，示例性的严格杂交条件是在50 %甲酰胺，4XSSC中于42°C 下杂交。此外，洗涤步骤过程中的条件可以选自由低严格条件（约2X SSC中于50°C下）和 高严格条件（约〇. 2XSSC中于50°C下，优选于65°C下）（20X SSC:0. 3M柠檬酸钠，3M NaCl， PH7.0)所界定的条件范围。此外，洗涤步骤过程中的温度可以从室温约22°C的低严格条件 升高约65°C的较高严格条件。
[0241] 盐浓度和温度参数两者可同时变化，或者两个参数之一可以保持恒定而仅另一个 变化。在杂交过程中还可以使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。在50%甲酰胺存在下，杂交优 选地在42°C下实现。相关因素如i)处理长度、ii)盐浓度、iii)去污剂条件、iv)竞争DNA、 V)温度和vi)探针选择可以依情况组合以致于并非所有的可能性均在此提到。
[0242] 对于DNA杂交（Southern印迹分析）和洗漆步骤的条件的一些实例示于下面：
[0243] (1)可以从下列条件中选择杂交条件：
[0244] a)4X SSC，65°C，
[0245] b)6X SSC，45°C，
[0246] c) 6X SSC，lOOmg/ml 变性的片段化的鱼精 DNA，68°C，
[0247] d)6X SSC，0. 5% SDS，lOOmg/ml 变性的鲑精 DNA，68°C，
[0248] e)6X SSC，0. 5% SDS，lOOmg/ml 变性的片段化鲑精 DNA，50% 甲酰胺，42°C，
[0249] f)50% 甲酰胺，4X SSC，42°C，
[0250] g)50% (vol/vol)甲酰胺，0· 1%牛血清白蛋白，0· 1% Ficoll，0. 1%聚乙烯批咯 烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH6. 5,750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42°C，
[0251] h) 2X 或 4X SSC，50°C (低严格条件），或
[0252] 丨）30至40%甲酰胺，2乂或4乂55(：，421：(低严格条件）。
[0253] (2)洗涤步骤可以从例如下列条件中选择：
[0254] a) 0· 015M NaCl/0. 0015M 柠檬酸钠 /0· 1 % SDS，50°C。
[0255] b)0. IX SSC，65°C。
[0256] c)0. IX SSC，0. 5% SDS，68°C。
[0257] d)0. IX SSC，0. 5% SDS，50% 甲酰胺，42°C。
[0258] e) 0· 2X SSC，0· I % SDS，42°C。
[0259] f)2X SSC，65°C (低严格条件）·
[0260] g)0,2XSSC，0, 1% S DS，60°C (中高严格条件），或
[0261] h)0, 1XSSC，0, 1% S DS，60°C (中高严格条件），或
[0262] i) 0, 2XSSC，0, 1 % S DS，65°C (高严格条件），或
[0263] h) 0, 1XSSC，0, 1 % S DS，65°C (高严格条件）。
[0264] 在一个实施方案中，术语"严格条件下的杂交"旨在描述对于这样的杂交和洗漆的 条件，在该条件下彼此至少30%、40%、50 (%或65(%同一性的核苷酸序列通常仍然彼此杂 交。优选地，条件是这样的，以致于彼此至少约70 %、更优选至少约75 %或80 %并且甚至更 优选至少约85%、90%或95%或更高同一性的序列通常仍然保持彼此杂交。
[0265] 在一个实施方案中，本发明的核酸分子在严格条件下与SEQ ID NO :1、5、9、13、17、 21、25和/或29中所示序列，在shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基情况下SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶联受体情况下SEQIDN0:129、133、137、 141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且在 SK-通道情况下 SEQ ID NO :227、 229、231中所示序列杂交，并且对应于天然存在的核酸分子。如本文所使用，"天然存在"核 酸分子指具有自然出现的核苷酸序列的RNA或DNA分子（例如编码天然蛋白质）。
[0266] 除了在种群中存在的核酸或蛋白质序列的天然存在变体之外，技术人员将进一步 地认识到，可通过向编码多肽的核酸分子的核苷酸序列中引入突变而引入改变，由此导致 所编码多肽氨基酸序列中的改变并且由此改变多肽的功能能力，这意味着优选减少、降低 或缺失所述活性。例如，导致"必需"氨基酸残基位置上氨基酸替代的核苷酸替代可以在本 发明方法中待减少的核酸分子序列中进行，所述序列例如包含如SEQ ID NO :1、5、9、13、17、 21、25和/或29中所示对应核酸分子，在shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基情况下 SEQIDN0:72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶联受体情况下SEQIDN0 :129、 133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且在 SK-通道情况下 SEQ ID Ν0:227、229、231。"必需"氨基酸残基是这样的残基，S卩如果来自一个多肽野生型序列的残 基改变导致所述多肽活性改变，而"非必需"氨基酸残基对于蛋白质活性，例如对于作为酶 或通道的活性而言是不需要的。"必需"残基的改变常常导致多肽活性减少、降低或缺失。 优选地，多肽氨基酸以如此方式改变以致于活性被减少、降低或缺失，这意味着优选地必 需氨基酸残基和/或更多非必需残基被改变并且由此在降低多肽的表达或活性之后活性 减少。然而，其它氨基酸残基（例如在具有所述活性的结构域中不保守的或仅半保守的那 些）对于活性而言不是必需的，并且因此可以被改变而不改变所述活性，这是较不优选的。
[0267] 优选地，由核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID勵：2、6、10、14、18、22、26和/或30 中所示序列或者与包含SEQ ID NO :33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一个或更多个基序的序 列至少约60%、70%或80%相同，更优选与SEQIDN0:2、6、10、14、18、22、26和/或30所 示序列之一或者与包含SEQ ID NO :33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一个或更多个基序的序列 至少约85%同一，甚至更优选与SEQ ID勵：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示序列或 者与包含SEQ ID NO :33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO :35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的序列至少约90%、 91%、92%、93%、94%、95% 同源，并且最优选与 SEQ ID 吣：2、6、10、14、18、22、26和/或30 中所示序列或者与包含SEQ ID NO :33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一个或更多个基序的序列 至少约 96%、97%、98%或 99% 同一。
[0268] 在shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基的情况下，优选地，由核酸分子编码的 蛋白质与SEQIDN0:73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者与包含SEQIDN0 : 102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO: 104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126U27和/或128的一个或更多个基序的序列至少约60 %、70 %或80 %同一，更优选与 SEQIDN0:73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者与包含SEQIDN0:102和/ 或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、 112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 /或128的一个或更多个基序的序列至少约85%同一，甚至更优选与SEQ ID NO :73、75、77、 79、81、83、85和/或87中所示序列或者与包含SEQIDN0:102和/或103中分别所示共有 序列或分别选自 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一个或更多 个基序的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最优选与SEQIDN0:73、 75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者与包含SEQIDN0 :102和/或103中分别 所示共有序列或分别选自 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一 个或更多个基序的序列至少约96%、97%、98%或99%同一。
[0269] 在G蛋白偶联受体的情况下，优选地，由核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO : 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者与包含 SEQ IDN0:177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQIDN0:180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226的一个或更多个基序的序列至少 约 60%、70%或 80% 同一，更优选与 SEQ ID NO : 130、134、138、142、146、150、154、158、162、 166、170和/或174中所示序列或者与包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分别所示共 有序列或分别选自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、 和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225和/或226的一个或更多个基序的序列至少约85%同一，甚至更优选与SEQ ID NO: 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者与包含 SEQ IDN0:177、178和/或179中分别所示共有序列或分别选自SEQIDN0:180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一个或更多个基序的序列至 少约 90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最优选与SEQIDN0:130、134、138、142、 146、150、154、158、162、166、170和/或174中所示序列或者与包含SEQIDN0 :177、178和 /或179中分别所示共有序列或者分别选自SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、 187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225和/或226的一个或更多个基序的序列至少约96%、97%、 98%或 99% 同一。
[0270] 在SK-通道的情况下，优选地，由核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO :228、230、 232中所示序列或者与包含SEQ ID NO :239所示共有序列或者选自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的序列至少 约60%、70%或80%同一，更优选与SEQIDN0:228、230、232 中所示序列或者与包含SEQ ID N0:239 所示共有序列或者选自 SEQ ID N0:240、241、242、243、244、245、246、247、248、 249、250、251、252和253的一个或更多个基序的序列至少约85%同一，甚至更优选与SEQ IDN0 :228、230、232 中所示序列或者与包含SEQIDN0:239 所示共有序列或者选自SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个 基序的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最优选与SEQIDN0:228、 230、232所示序列或者与包含SEQ ID N0:239所示共有序列或者选自SEQ ID N0:240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的序列至少 约 96%、97%、98%或 99% 同一。
[0271] 为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸分子的同源性（=同一性）百分数，将一 个序列写在另一个序列的下方以便优化比较。可以向蛋白质或核酸分子序列中插入空位以 便产生与另一蛋白质或者另一核酸的最佳比对。然后在两个聚合物之间比较对应氨基酸位 置或核苷酸位置上的氨基酸残基或者核苷酸。如果在一个序列中的一个位置被与另一序列 对应位置上的相同的氨基酸残基或相同的核苷酸占据，则在该位置上分子是相同的。氨基 酸或者核苷酸"同一性"，如在本文上下文中所使用，对应于氨基酸或者核酸"同源性"。通 常，两个序列之间的同源性百分数是序列共享的相同位置数量的函数（即％同源性=相同 位置数量/总位置数量xlOO)。因此，术语"同源性"和"同一性"被认为对于本说明书是同 义词。
[0272] 为了确定两个或更多个氨基酸序列或者两个或更多个核苷酸序列之间的同源性 (=同一性）百分数，已经开发出数个计算机软件程序。两个或更多个序列的同源性可用 软件fasta计算，其目前已经有版本fasta3在使用（W. R. Pearson和D. J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological Sequence Comparison. PNAS85:2444-2448 ； ff. R. Pearson(1990)Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymologyl83:63_98;W.R.Pearson 和 D.J. Lipman (1988) Improved Tools for Biological Sequence Comparison. PNAS85:2444-2448 ；ff.R.Pearson (1990)； Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA Methods in Enzymologyl83:63 - 98)。用于计算不同序列同源性的另一有用的程序是标准的blast程 序，其包含在Biomax pedant软件之中（Biomax, Munich,德意志联邦共和国）。不幸的是， 这有时产生亚最佳的结果，因为blast不是经常把目标和查询序列的全部包括在内。虽然 该序列极其有效，其可以用于比较极大数量的序列。对于此类序列比较有代表性地使用下 列设置：-p程序名称[字符串];-d数据库[字符串];默认=nr ;-i查询文件[文件输 入];默认=stdin ;-e期望值（E) [Real];默认=10. 0 ;-m比对观察选项：0 =配对；1 =查 询锚定的显示同一性；2 =查询锚定的无同一性；3 =平面查询锚定的，显示同一性；4 =平 面查询锚定的，无同一性；5 =查询锚定的无同一性和平端；6 =平面查询锚定的，无同一性 和平端；7 = XML Blast输出；8 =列表；9带有注解行的列表[整数];默认=0 ;-〇 BLAST 报告输出文件[文件输出]可选；默认=stdout ;-F过滤查询序列（DUST具有blastn， SEG具有其他）[字符串];默认=T ;-G空位打开代价（零调用默认行为）[整数];默认 =0 ;-E空位延长代价（零调用默认行为）[整数];默认=0 ;-X对于有空位比对的X减少 (in bits)(零调用默认行为）；blastn30, megablast20，tblastxO,所有其他 15 [整数]; 默认=〇;-1 Show GI's in deflines[T/F];默认=F;_q 核苷酸错配罚分（仅 blastn) [整数];默认=-3 ;-r核苷酸匹配奖励（仅blastn)[整数];默认=I ;-v对于（V)显示 一行描述的数据库序列数量[整数];默认=500 ;-b显示对于（B)比对的数据库序列数 量[整数];默认=250 ;-f对于延长命中的阈值，如果是零为默认；blastpll，blastnO， blastxl2，tblastnl3 ;tblastxl3，megablast0[整数];默认=0 ;_g执行有缺口的比对（对 于tblastx不可用）[T/F];默认=T ;-Q使用的查询遗传密码子[整数];默认=I ;-D DB 遗传密码子（仅对于tblast [nx])[整数];默认=I ;_a使用的处理器数量[整数];默认 =1 ;-0 SeqAlign文件[文件输出]可选；-J相信查询defline[T/F];默认=F ;-M矩阵 [字符串];默认=BL0SUM62 ;-W字大小，如果是零为默认（blastnll，megablast28,所有其 他3)[整数];默认=0;-z数据库的有效长度（对应真实大小使用零）[真];默认=0;-K 来自待保留区域的最佳命中数（默认为关，如果使用则数值100是推荐的）[整数];默认 =〇 ;-Ρ对于多次命中为〇,对于一次命中为1 [整数];默认=〇 ;-Υ搜索空间的有效长度 (对于真实大小使用零）[真];默认=〇 ;_S针对数据库搜索的查询链（对于blast [nx]， 和tblastx) ;3是两者，1是上面的，2是下面的[整数];默认=3 ;-T产生HTML输出[T/ F];默认=F ;-1对数据库搜索限制于GI's列表[字符串]可选；-U使用小写过滤FASTA 序列[T/F]可选；默认=F ;-y在命中中对于非空位延伸的X减少值（0.0调用默认行为）； blastn20, megablastlO,所有其他7[真];默认=0. 0 ;-Z在命中中对于最终缺口比对的 X减少值（〇·〇调用默认行为）；blastn/megablast50, tblastxO,所有其他25 [整数];默 认=0 ;-R PSI-TBLASTN检查点文件[文件输入]可选；-n MegaBlast搜索[T/F];默认= F ;_L查询序列上的位置[字符串]可选；-A多重命中窗口大小，如果是零为默认（blastn/ megablastO,所有其他40 [整数];默认=0;_w移码罚分（对blastx为00F算法）[整数]; 默认=0 ;_t用于连接HSPs的tblastn中允许的最大内含子长度（0不能连接）[整数]; 默认=0。
[0273] 通过使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法达到高质量的结 果。因此基于所述算法的程序是优选的。有利的，序列比较可以用程序PileUp(J.Mol. Evolution.，25, 351-360,1987, Higgins 等，CABI0S，51989 :151 - 153)或优选用程序 Gap 和 BestFit 进行，它们分别基于 Needleman 和 Wunsch[J. Mol. Biol. 48 ;443-453(1970)] 以及 Smith 和 Waterman[Adv. Appl. Math. 2 ;482_489 (1981)]的算法。两个程序是 GCG 软件包的一部分[Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711 (1991);Altschul 等（1997)Nucleic Acids Res.25:3389 以及下列等等]。因 此，优选地使用Gap程序在序列的整个范围上开展计算以确定序列同源性百分数。对于核 酸序列比较使用下列标准调整：空位加权：50,长度加权：3,平均匹配：10. 000,平均错配： 0. 000〇
[0274] 例如在核酸水平与SEQ ID NO. :1所示序列具有80%同源性的序列理解为意思 是指，当通过上述Gap程序算法应用上述参数设置与SEQ ID NO :1的序列比较时序列具有 80%同源性。
[0275] 两个多肽之间的同源性理解为意思是指，通过借助于程序算法Gap (Wisconsin Package VersionlO. 0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison，USA)，设置以下参数：空位加权：8 ;长度加权：2 ;平均匹配：2. 912 ;平均错 配：-2. 003经比较计算的，每一情况下整个序列长度上的氨基酸序列的同一性。
[0276] 例如在蛋白质水平与SEQ ID NO :2的序列具有80%同源性的序列理解为意思是 指，当通过上述Gap程序算法应用上述参数设置与SEQ ID NO :2的序列比较时序列具有 80%同源性。
[0277] 根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID勵：2、6、10、14、18、22、26和/或 30所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一个或更多个基序的 序列之一衍生的功能等同物，与SEQIDN0:2、6、10、14、18、22、26和/或30所示多肽之一 或者包含SEQ ID NO : 33和/或34中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO : 35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一个或更多个基序的多肽之一具有至少 30%、35%、40%、45%或50%，优选至少55%、60%、65%或70%，优选至少80%，特别优选 至少85%或90%、91%、92%、93%或94%，非常特别优选至少95%、97%、98%或99%同源 性，并且通过与SEQ ID勵：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽具有基本相同的特 性相区别。
[0278] 根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29 所示核酸序列衍生的功能等同物与SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示的根据 本发明的核酸具有至少30%、35%、40%、45%或50%，优选至少55%、60%、65%或70%优 选至少80 %，特别优选至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94 %，非常特别优选至少95 %、 97%、98%或99%同源性，并且编码与SEQ ID勵：2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示 多肽具有基本相同特性的多肽。
[0279] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为例，根据本发明通过取代、插入或者 缺失，从SEQ ID Ν0:73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽之一或者包含SEQ ID NO: 102和/或103中分别所示共有序列或分别选自SEQ ID NO: 104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽之一衍生的功能等同物，与SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽之一或者包含SEQIDN0:102和/或103中分别 所示共有序列或分别选自 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一 个或更多个基序的多肽之一具有至少30%、35%、40%、45%或50%，优选至少55%、60%、 65%或70%，优选至少80%，特别优选至少85%或90%、91 %、92%、93%或94%，非常特别 优选至少 95%、97%、98% 或 99% 同源性，并且通过与 SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85 和/或87所示多肽具有基本相同的特性相区别。
[0280] 以shaker通道和/或HyperkineticP亚基为例，根据本发明通过取代、插入或者 缺失，从SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸序列衍生的功能等同物， 与根据本发明的SEQ ID勵：72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸之一具有至少 30%、35%、40%、45%或50%，优选至少55%、60%、65%或70%，优选至少80%，特别优选 至少85%或90%、91%、92%、93%或94%，非常特别优选至少95%、97%、98%或99%同源 性，并且编码与SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽具有基本相同特 性的多肽。
[0281] 以G蛋白偶联受体为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO :130、 134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示多肽之一或者包含 SEQ ID NO : 177、178和/或179中分别所示共有序列或者分别选自SEQ ID NO : 180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一个或更多个基序的多肽之 一衍生的功能等同物，与 SEQ ID NO : 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 /或174中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :177、178和/或179中分别所示共有序列 或分别选自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、 和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 /或226的一个或更多个基序的多肽之一具有至少30 %、35 %、40 %、45 %或50 %，优选至 少55%、60%、65%或70%，优选至少80%，特别优选至少85%或90%、91%、92%、93%或 94%，非常特别优选至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通过与SEQ ID N0:130、134、 138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174所示多肽具有基本相同的特性相区别。
[0282] 以G蛋白偶联受体为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO :129、 133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸序列衍生的功能等同 物，与根据本发明的 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173中所示核酸之一具有至少30%、35%、40%、45%或50%，优选至少55%、60%、65%或 70 %，优选至少80 %，特别优选至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94%，非常特别优选 至少 95%、97%、98% 或 99% 同源性，并且编码与 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170和/或174中所示多肽具有基本相同特性的多肽。
[0283] 以SK-通道为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO :228、230、 232所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :239中所示共有序列或选自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的多肽之一 衍生的功能等同物，与SEQIDN0:228、230、232 中所示多肽之一或者包含SEQIDN0:239 所示共有序列或选自 SEQ ID N0:240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、 252和253的一个或更多个基序的多肽之一具有至少30 %、35 %、40 %、45 %或50 %，优选至 少55%、60%、65%或70%，优选至少80%，特别优选至少85%或90%、91%、92%、93%或 94%，非常特别优选至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通过与SEQIDN0 :228、230、 232所示多肽具有基本相同的特性相区别。
[0284] 以SK-通道为例，根据本发明通过取代、插入或者缺失，从SEQ ID NO :227、229、 231中所示核酸序列衍生的功能等同物，与根据本发明的SEQ ID N0:227、229、231中所示 核酸之一具有至少30%、35%、40%、45%或50%，优选至少55%、60%、65%或70%，优选 至少80 %，特别优选至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94%，非常特别优选至少95%、 97%、98%或99%同源性，并且编码与SEQIDN0:228、230、232 中所示多肽具有基本相同 特性的多肽。
[0285] 在一个实施方案中，两个核酸序列或多肽序列之间的"同源性"或"同一性"通 过每一情况中核酸序列/多肽序列整个序列长度上的同一性定义，同一性通过借助于设 置如下参数：空位加权：8 ;长度加权：2 ;平均匹配：2, 912 ;平均错配：-2, 003以程序算法 GAP(Wisconsin Package VersionlO.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA)进行的比对计算。
[0286] 在下文中，术语同一性也代替术语"同源的"或"同源性"同义地使用。
[0287] "突变"包括取代、添加、缺失、倒位或插入一个或更多个核苷酸残基，这也可通过 取代、插入或者缺失一个或更多个氨基酸带来靶标蛋白质对应氨基酸序列的改变。
[0288] 在一个实施方案中，本发明涉及选自下列的分离的核酸分子：
[0289] a)编码SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；
[0290] b)SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子；
[0291] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID N0:2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；
[0292] d)与包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的 核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0293] e)核酸分子，编码与（a)至（C)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分别具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或 其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽；
[0294] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0295] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且分别具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1 或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽产生；
[0296] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO :33和/或34中分别所示共有序列或分别选自 SEQIDN0:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一个或更多个 基序的多肤；
[0297] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :7、8 ;9、10 ;11、 12中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；
[0298] 和
[0299] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码分别具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助 蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0300] 以shaker通道和/或HyperkineticP亚基为例，在一个实施方案中，本发明涉及 选自下列的分离的核酸分子：
[0301] a)编码包含SEQ ID勵：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核 酸分子；
[0302] b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分 子；
[0303] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；
[0304] d)与包含SEQ ID勵：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷 酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0305] e)核酸分子，编码与（a)至（c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或 C亚型活性的多肽；
[0306] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0307] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且分别具有Shaker通道和/或HyperkineticP亚基， 优选H-kv β亚基A或C亚型活性的多肽产生；
[0308] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO : 102和/或103中分别所示共有序列或分别选 白 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽；
[0309] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ; 92、93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组 文库得到
[0310] 和
[0311] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码分别具有Shaker通道和/或HyperkineticP亚基，优选H-kvP亚基A或C亚 型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0312] 以G蛋白偶联受体为例，在一个实施方案中，本发明涉及选自下列的分离的核酸 分子：
[0313] a)编码 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174 中所不多肽的核酸分子；
[0314] b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所 不核酸分子；
[0315] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO :130、134、 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列的多肽；
[0316] d)与包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0317] e)核酸分子，编码与（a)至（C)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇 胺受体活性的多肽；
[0318] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0319] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇的oa2、0amb、0ct-@-2R 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受体活性的多肽产生；
[0320] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分别所示共有序列或分 别选自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226的一个或更多个基序的多肽；
[0321] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :131、132 ;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156、159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到
[0322] 和
[0323] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇的〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺 受体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0324] 以SK-通道为例，在一个实施方案中，本发明涉及选自下列的分离的核酸分子：
[0325] a)编码SEQ ID NO :230、232中所示多肽的核酸分子；
[0326] b)SEQ ID NO :229、231 中所示核酸分子；
[0327] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO :230、232的多 肽序列；
[0328] d)与包含SEQ ID NO :229、231所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至 少50%同一性的核酸分子；
[0329] e)核酸分子，编码与（a)至（C)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；
[0330] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0331] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；
[0332] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或选自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的多 肽；
[0333] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ;和237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到
[0334] 和
[0335] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0336] 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明分离的核酸分子的核酸构建体。
[0337] 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明核酸构建体或者分离的核酸分子的载 体。
[0338] 在一个实施方案中，本发明涉及通过转染/转化方式包含本发明的载体、核酸构 建体或者分离的核酸分子的转基因宿主细胞。
[0339] "分离的"多核苷酸或者核酸分子与存在于该核酸分子天然来源的其它多核苷酸 或者核酸分子分离。分离的核酸分子可以是数kb的染色体片段，或者优选地仅包含基因编 码区的分子。因此，分离的核酸分子可包含临近5'和3'的染色体区或者进一步临近染色体 区，但是优选地不包含如此的序列，即其天然位于在核酸分子所来源生物基因组或染色体 背景中核酸分子的侧翼（例如临近编码核酸分子5' -和3' -UTR区的序列）。在多种实施 方案中，在根据本发明的方法中使用的分离的核酸分子可以例如包含小于约5kb、4kb、3kb、 2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb的核苷酸序列，这些核苷酸序列天然位于核酸分子所来源细胞基 因组DNA中核酸分子的侧翼。
[0340] 在方法中使用的核酸分子或其部分可以使用分子生物学标准技术和本文提供的 序列信息分离。同样，例如在DNA或者氨基酸水平同源的序列或者同源、保守序列区可以借 助于比较算法鉴定。前者可以用作标准杂交技术（例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述的那些）下的杂交探针用于分离 在该方法中有用的更多的核酸序列。
[0341 ] 包含其活性待在本发明方法中降低的分子的整个序列或其部分的核酸分 子，可额外地通过聚合酶链式反应、基于被使用的该序列或其部分的寡核苷酸引物分 离。例如，包含完整序列或其部分的核酸分子可以通过聚合酶链式反应使用已经基于 该每一序列产生的寡核苷酸引物分离。例如，mRNA可以通过例如Chirgwin等（1979) Biochemistryl8:5294-5299的硫氰酸胍提取法从细胞分离，并且cDNA可通过逆转录酶 (例如Moloney MLV逆转录酶，可从Gibco/BRL，Bethesda，MD得到，或AMV逆转录酶，可从 Seikagaku America, Inc. , St. Petersburg, FL 得至丨J )产生。
[0342] 用于通过聚合酶链式反应扩增的合成的寡核苷酸引物可以基于本文所示序列产 生。此类引物可以用于从cDNA文库或者从基因组文库扩增核酸序列和鉴定在本发明方法 中有用的核酸分子。
[0343] 此外，通过与根据本发明方法待减少的核酸分子所编码蛋白质，特别是SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29中所示核酸分子，在81^1?51'通道和/或!^6浊丨1^^(^ 亚基情况下，SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86,在G蛋白偶联受体情况下，SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且在 SK-通道情况 下，SEQ ID勵：227、229、231所编码的序列开展蛋白质序列比对，可以鉴定来自不同生物的 保守区，并且反过来从这些保守区可以衍生简并引物。
[0344] 保守区是在来自不同来源的数个同源物的一个特定位置中的氨基酸极少变异的 那些区。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比对。此外，通过与根据本发明方法 待减少的核酸分子所编码蛋白质，特别是由SEQ ID勵：2、6、10、14、18、22、26和/或30所 示多肽分子编码的序列，至于shaker通道和/或HyperkineticP亚基为SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85 和 / 或 87,至于 G 蛋白偶联受体为 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、 150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且至于 SK-通道为 SEQ ID NO :228、230、232 开展 蛋白质序列比对，可以鉴定来自多种生物的保守区，并且反过来从这些保守区可以衍生简 并引物。
[0345] 保守区是在来自不同来源的数个同源物的一个特定位置中的氨基酸极少变异的 那些区。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比对。在一个有利的实施方案中，在 本发明方法中，包含SEQ ID NO :33和/或34,至于shaker通道和/或Hyperkineticii亚 基为SEQ ID N0:102和/或103,至于G蛋白偶联受体为SEQ ID N0:177、178和/或179， 并且至于SK-通道为SEQ ID N0:239所示共有序列或者选自SEQ ID N0:35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亚基 为 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128,至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、 195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、 211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226，并且至于 SK-通道为 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的多肽或者由它们组成的多肽的活性被降低，并且在另一个实施方案 中，本发明涉及包含SEQ ID NO :33和/或34,至于shaker通道和/或Hyperkineticii亚 基为SEQ ID N0:102和/或103,至于G蛋白偶联受体为SEQ ID N0:177、178和/或179， 并且至于SK-通道为SEQ ID N0:239所示共有序列或者选自SEQ ID N0:35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或55、和/或56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亚基 为 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128,至于G蛋白偶联受体为SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、 195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、 211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226，并且至于 SK-通道为 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的多肽或者由它们组成的多肽，由此所指定的20或更少、优选15或 10、优选9、8、7或6、更优选5或4、甚至更优选3、甚至更优选2、甚至更优选1、最优选0个 氨基酸位置被任意氨基酸代替。在一个实施方案中，由字母指定的不大于15%、优选10%、 甚至更优选5%、4%、3%或2%、最优选1 %或0%的氨基酸位置被另一氨基酸代替。在一 个实施方案中，20或更少、优选15或10、优选9、8、7或6、更优选5或4、甚至更优选3、甚至 更优选2、甚至更优选1、最优选0个氨基酸被插入至共有序列或蛋白质基序中。
[0346] 共有序列衍生自如SEQ ID勵:2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于811&1?51'通道 和 / 或 Hyperkinetic β 亚基为 SEQ ID 勵73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于6蛋白偶 联受体为 SEQ ID Ν0130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且至 于SK-通道为SEQ ID N0228、230、232所示序列的多重比对。字母表示单字母氨基酸密码 子并且表明氨基酸在所有比对的蛋白质中是保守的。字母X代表在所有序列中不保守的氨 基酸。
[0347] 保守结构域从所有序列鉴定并且使用亚类标准PiOSite标记法描述，例如模式 Υ-χ (21，23) - [FW]意思是指，保守酪氨酸被来自苯丙氨酸或色氨酸的最小21和最大23个氨 基酸残基分隔开。
[0348] 保守模式使用软件工具MEME版本3. 5. 1或者手工鉴定。MEME由Timothy L Bailey 和 Charles Elkan, Dept, of Computer Science and Engeneering，University of California，San Diego, USA 开发并且由 Timothy L Bailey 和 Charles Elkan [Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994] 描述。独立程序的源代码可以从San Diego Supercomputer center(http: //meme. sdsc. edu)公开获得。
[0349] 为了用软件工具MEME鉴定所有序列中的共同基序，使用下列设置：-maxsiZe5000 00, -nmotifsl5, -evtO. 001，_maxw60,-距离 le_3, -minsites 用于分析的序列数。对于MEME 的输入序列是Fasta格式的非对齐的序列。其它参数在该软件版本中使用默认设置。
[0350] 对于保守结构域的Prosite模式使用软件工具Pratt版本2. 1或手工产生。 Pratt 由 Inge Jonassen, Dept, of Informatics, University of Bergen，Norway 开发 并由 Jonassen 等· [I.Jonassen，J. F. Collins and D.G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned protein sequences, Protein Science4 (1995)，pp. 1587-1595 ; 1. Jonassenj Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph，Submitted to CABIOS Febr. 1997]描述。对于独立程序的源代码（ANSI C)在例如 建立的生物信息中心像EBI (European Bioinformatics Institute)中公开得到。
[0351] 为了使用软件工具Pratt产生模式，使用下列设置：PL(max Pattern Length): 100,PN(max Nr of Pattern Symbols) ：100,PX(max Nr of consecutive x s) ：30,FN(max Nr of flexible spacers) ：5, FL(max Flexibility) ：30, FP(max Flex.Product) :10， ON(max number patterns) :50。对于Pratt的输入序列是如从软件工具MEME所鉴定的表 现出高相似性的蛋白质序列的不同区。不得不匹配所产生模式的序列的最低数量（CM，min Ni* of Seqs to Match)被设置成是所提供序列的至少80%。本文未提到的参数使用它们 的默认设置。
[0352] 保守结构域的Prosite模式可以用于搜寻匹配该模式的蛋白质序列。多个建立的 生物信息中心提供公开的英特网入口用于在数据库搜索中使用那些模式（例如PIR[蛋白 质信息资源，位于 Georgetown University Medical Center]或 ExPASy [Expert Protein Analysis System])。备选地，可利用独立软件，像程序Fuzzpro,它是EMBOSS软件包的部 分。例如，程序Fuzzpro不但允许搜索精确的模式-蛋白质匹配，而且还允许在开展的搜索 中设置不同的模糊。
[0353] 比对使用软件ClustalW(版本L 83)开展并描述于Thompson等.[Thompson， J. D. , Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W ：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Research, 22:4673-4680]。对立程序的源代码从 European Molecular Biology Laboratory ;Heidelberg，Germany 公开获得。分析使用 ClustalW vl. 83 默认参数（空位 开口罚分：1〇· 0 ;空位延长罚分：〇· 2 ;蛋白质矩阵：Gonnet ;pprotein/DNA endgap :_1 ;蛋 白质/DNA gapdist :4)开展。
[0354] 然后，如上述设计的简并引物可被PCR采用用于扩增编码具有上述活性的蛋白质 的新编码区片段。
[0355] 然后，这些片段可用作杂交探针用于分离完整的基因序列。备选地，缺失的5'和 3'序列可以通过RACE-PCR手段分离。根据本发明的核酸分子可以使用cDNA，备选地使用 基因组DNA作为模板和适宜寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术扩增。因此，扩增的核酸 分子可以被克隆入适宜的载体中并通过DNA序列分析的方式表征。对应于用于本发明方法 的核酸分子之一的寡核苷酸可以通过标准合成方法，例如使用自动DNA合成仪产生。
[0356] 有利地用于根据本发明方法的核酸分子可以基于它们与本文所公开核酸分子的 同源性，使用序列或其部分作为杂交探针并且按照严格杂交条件下的标准杂交技术分离。
[0357] 在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽：
[0358] a)编码SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；
[0359] b)SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子；
[0360] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID N0:2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；
[0361] d)与包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的 核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0362] e)核酸分子，编码与（a)至（C)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分别具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或 其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽；
[0363] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0364] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且分别具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1 或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽产生；
[0365] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO :33和/或34中分别所示共有序列或分别选自 SEQIDN0:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一个或更多个 基序的多肤；
[0366] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :7、8 ;9、10 ;11、 12中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到
[0367] 和
[0368] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码分别具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助 蛋白KChIP (钾通道相互作用蛋白）活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0369] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为例，在一个实施方案中，本发明涉及 由选自下列的核酸分子编码的多肽：
[0370] a)编码SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽的核酸分子；
[0371] b)SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86 所示核酸分子；
[0372] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO :73、75、77、79、 81、83、85和/或87的多肽序列；
[0373] d)与包含SEQ ID勵：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷 酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0374] e)核酸分子，编码与（a)至（C)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或 C亚型活性的多肽；
[0375] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0376] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且分别具有Shaker通道和/或HyperkineticP亚基， 优选H-kv β亚基A或C亚型活性的多肽产生；
[0377] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO : 102和/或103中分别所示共有序列或分别选 白 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽；
[0378] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ; 92、93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组 文库得到
[0379] 和
[0380] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针 包含（a)或（b)核酸分子的互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子 序列互补并编码分别具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或 C亚型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0381] 以G蛋白偶联受体为例，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子 编码的多肽：
[0382] a)编码 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174 中所不多肽的核酸分子；
[0383] b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所 不核酸分子；
[0384] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO :130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列；
[0385] d)与包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0386] e)核酸分子，编码与核酸分子（a)至（C)所编码多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一'I"生并且具有选自优选来自黑腹果蝇的〇a2、Oamb、Oct-β -2R和Oct-β -3R的酚乙醇胺 受体活性的多肽；
[0387] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0388] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-0_2R 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受体活性的多肽产生；
[0389] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分别所示共有序列或分 别选自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、 222、223、224、225 和 / 或 226的一个或更多个基序的多肽；
[0390] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :131、132 ;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156、159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到
[0391] 和
[0392] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇的〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺 受体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
[0393] 以SK-通道为例，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的 多肽：
[0394] a)编码SEQ ID NO :230、232中所示多肽的核酸分子；
[0395] b)SEQ ID NO :229、231 中所示核酸分子；
[0396] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO :230、232的多 肽序列；
[0397] d)与包含SEQ ID NO :229、231所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至 少50%同一性的核酸分子；
[0398] e)核酸分子，编码与（a)至（C)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；
[0399] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0400] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；
[0401] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或选自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的多 肽；
[0402] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ;和237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到
[0403] 和
[0404] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
[0405] 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明多肽的膜，由此膜不具有本发明多肽 的内源活性。
[0406] 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明多肽的宿主细胞，由此宿主的膜不显 示本发明多肽的内源活性。
[0407] 措辞"膜不具有本发明多肽的最初活性"意思是指，本发明的多肽不是天然存在膜 的部分，但是其被装配入根据本发明方法的膜中。
[0408] 在一个实施方案中，本发明方法包括编码分别具有下列活性的多肽的基因的表达
[0409] i)在宿主膜中的昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和 /或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白），或
[0410] ii)在宿主膜中的昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚 基A或C亚型，或
[0411] iii)在宿主膜中的选自优选来自黑腹果蝇的oa2、0amb、0ctm^P0ct-@-3R 的昆虫酚乙醇胺受体，或
[0412] iv)在宿主膜中的昆虫小电导Ca2+激活钾通道。
[0413] 在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。
[0414] 在一个实施方案中，宿主细胞是在其天然状态下具有低或者无兴趣的电活性的细 胞。与此相比，表达本发明多肽的宿主细胞显示选自2-20?5、3-20?5、4-15?5、5-12?5和 5-10pS间隔的电导。
[0415] 在一个实施方案中，宿主细胞选自CHO细胞、HEK293、COS、HeLa、NIH3T3、BAK21、 Jurkat、CV-1、!fepC-2-、爪蟾卵母细胞；Sf9、S2、Sf21、Hi5、Pcl2、U20S。
[0416] 为了产生包含具有下列活性的本发明多肽的本发明宿主细胞
[0417] i)离子通道和/或其辅助蛋白，编码多肽的核苷酸序列，或
[0418] ii)离子通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或C亚型，编码多 肽的核苷酸序列，或
[0419] iii)酚乙醇胺受体和优选额外的标记蛋白质，如GFP，和/或额外的"泛宿主 性" G-蛋白，编码多肽的至少一个核苷酸序列，或
[0420] iv)离子通道，编码多肽的核苷酸序列被引入其被重组产生的宿主细胞中。
[0421] 在一个实施方案中，宿主细胞是微生物，其中编码具有下列活性的多肽的核苷酸 序列被根据描述于例如 T. Maniatis，E. F. Fritsch 和 J. Sambrook，"Molecular Cloning :A Laboratory Manual"， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989) 的一般克隆技术引入以增殖所述核苷酸序列
[0422] i)本发明的钾离子通道和/或其辅助蛋白，或
[0423] ii)本发明的钾离子通道和/或HyperkineticP亚基，优选H-kvP亚基A或C亚 型，或
[0424] iii)本发明的酚乙醇胺受体和优选额外标记蛋白质，如GFP，和/或额外的"泛宿 主性"G-蛋白，或
[0425] iv)本发明的通道。
[0426] 上述核酸分子可以与更多的基因一起被克隆入根据本发明的核酸构建体或者载 体中，或者不同的基因通过将数个核酸构建体或载体（包括质粒）转化入宿主细胞中而引 入。
[0427] 因此，本发明还涉及包含功能性连接至一个或更多个调节元件或信号的用于本发 明方法中的一个或多个核酸分子或其片段的核酸构建体，优选表达构建体。此外，本发明 还涉及用于产生同源重组事件的包含用于本发明方法的核酸分子或其部分的核酸构建体。
[0428] 核酸构建体还可以包含待引入宿主细胞内的更多的基因。
[0429] 如本文所述，调节序列或因子可对优选引入的构建体的表达具有正作用，因此增 加构建体的表达。因此，通过使用强转录信号例如启动子和/或增强子可有利地在转录水 平发生调节元件的增强。此外，然而，转录的增强也可通过例如增加 RNA稳定性实现。
[0430] 因此，本发明的核酸构建体可以用作表达盒并且因此可以用于直接引入至宿主细 胞中，或者它们可以被引入至载体中。因此，在一个实施方案中，核酸构建体是包含微生物 启动子或微生物终止子或者两者的表达盒。在另一实施方案中，表达盒包含真核启动子或 者真核终止子或者两者。
[0431] 如果预期以数个构建体或者载体转化宿主细胞，则上述转化的标记必须去除或者 在后续转化中采用另外的标记。可以通过本领域技术人员的方法如现有技术中所述将标记 从宿主细胞中去除。
[0432] 在一个实施方案中，用于根据本发明方法的核酸序列可有利的有效连接至一个或 更多个调节信号以便增加基因表达。
[0433] 这些调节序列旨在使核酸分子，例如用于本发明方法的基因或基因片段或基因产 物或核酸的特异表达成为可能。取决于宿主生物，例如真核细胞或微生物，这将意味着例如 基因或基因构建体仅在诱导后表达和/或过表达，或其组成型表达和/或过表达。这些调 节序列为例如诱导子或阻抑物结合并因此调节核酸表达的序列。此外，基因构建体还可有 利的包含一个或更多个与启动子有效连接的称作增强子序列的序列，并且它们使核酸序列 增强表达。同样，可以在DNA序列3'端插入另外有利的序列，例如其他的调节元件或终止 子。
[0434] 术语"增加的表达"或"过表达"，如本文所使用，意思是指原始野生型表达水平之 外的任何形式的表达。
[0435] 用于增加基因或基因产物表达的方法在本领域中广泛记录并且包括例如由适当 启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。充当启动子或增强子元件的分离 的核酸可以引入至非异源形式多核苷酸的适当位置中（通常是上游），以致于上调编码目 的多肽的核酸的表达。
[0436] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为例，在本发明的一个实施方案中使 用Kozak序列。
[0437] 编码根据本发明蛋白质的核酸分子和编码另外的多肽的核酸分子可以存在于一 个核酸构建体或载体中或者存在于数个核酸构建体或载体中。在一个实施方案中，仅用于 本发明方法的核酸分子或其编码基因的一个拷贝存在于核酸构建体或载体中。数个载体或 核酸构建体或载体可以在宿主生物中一起表达。根据本发明的核酸分子或核酸构建体可以 插入在载体中并以自由形式存在于细胞中。如果优选稳定转化，则使用超过数个世代稳定 复制或者它们或它们的部分被插入至基因组中的载体。以哺乳动物细胞为例，可以发生向 细胞核基因组中的整合。为了向宿主基因组中插入一个以上的构建体，待表达的构建体将 一起存在于一个载体中，例如在携带多个构建体的上述载体中。
[0438] 通常，用于构建体表达率的调节序列位于与待调节核酸分子序列相对而言的上游 (5'）、当中和/或下游（3'）。它们特别是控制转录和/或翻译和/或转录稳定性。表达水 平依赖于更多细胞调节系统，例如细胞的蛋白质生物合成和降解系统的结合。
[0439] 调节序列包括转录和翻译调节序列或信号，例如尤其与转录或翻译起始调节有关 的位于上游（5'）的序列，如启动子或起始密码子，和尤其与转录或翻译终止和转录物稳定 性有关的位于下游（3'）的序列，如多腺苷化信号或终止密码子。
[0440] 特别有利的启动子是组成型启动子、组织或区室特异启动子和可诱导启动子。通 常，"启动子"在本文上下文中被理解为意思是指核酸分子中的介导核酸分子的编码序列片 段表达的调节序列。原则上，可以使用天然启动子和它们的调节序列。用于哺乳动物细胞 的一些启动子是例如CMV、SV40、ΤΚ、β -肌动蛋白。
[0441] 核酸构建体有利地如此构建，以致于启动子之后是用于插入待表达核酸的适宜切 割位点，有利地在多接头中，如果合适，之后是位于多接头后面的终止子。如果合适，该次序 被重复数次以致于数个基因被组合在一个构建体中，并且因此可以被引入至转基因植物中 以便被表达。序列被重复如直至三次。为了表达，核酸序列通过适宜的切割位点插入在例 如启动子后面的多接头中。对于每一核酸序列，有利的是具有其自身的启动子，并且，如果 合适，具有其自身的终止子，如上面所提到。然而，还可以在启动子后面并且如果合适在终 止子之前插入数个核酸序列，特别是当在宿主或靶细胞中多顺反子转录可能时。在该上下 文中，插入位点或者插入至核酸构建体中的核酸分子序列不是决定性的，也就是说核酸分 子可以插入至盒的第一个或最后一个位置而对表达没有实质性的影响。然而，还可以在构 建体中仅使用一个启动子类型。
[0442] 本发明的一个实施方案还涉及产生载体的方法，包括将本文表征的核酸分子、根 据本发明的核酸分子或根据本发明的表达盒插入至载体中。载体可以例如引入至细胞，如 微生物或哺乳动物细胞中，如本文对于核酸构建体或下面转化或转染所述或实施例所示。 宿主或靶细胞可以瞬时或稳定转化，然而，优选稳定转化。
[0443] 根据本发明的载体优选是适宜在细胞中、优选哺乳动物细胞中表达根据本发明多 肽的载体。因此，方法还包括用于将调节信号，特别是介导在生物如微生物或哺乳动物细胞 中表达的信号整合入载体的一个或更多个步骤。
[0444] 因此，本发明还涉及包含本文所表征核酸分子作为适于根据本发明核酸分子的植 物表达的核酸构建体部分的载体。
[0445] 用于本发明方法的有利的载体，如本发明的载体包含编码用于本发明方法的核酸 分子的核酸分子，或适用于在细胞中表达的包含如上所述适用于本发明方法的核酸分子的 核酸构建体，或者单独或者与更多的基因如标记或者选择基因一起。
[0446] 因此，有利的用于本发明方法的重组表达载体包含用于本发明方法的核酸分子或 者根据本发明的核酸构建体，其为这样的形式，即适于在宿主细胞中表达包含SEQ ID Ν02、 6、10、14、18、22、26和/或30，至于shaker通道和/或Hyperkineticβ亚基为SEQIDN073、 75、77、79、81、83、85 和 / 或 87,至于 G 蛋白偶联受体为 SEQ ID N0130、134、138、142、146、 150、154、158、162、166、170 和 / 或 174,并且至于 SK-通道为 SEQ ID N0228、230、232 中所 示多核苷酸的核酸分子或其同源物和/或同时表达与根据本发明的核酸分子伴随的或本 文所述的另外的基因。因此，重组表达载体包含与待表达核酸序列有效连接的、基于待用于 表达的宿主细胞选择的一个或更多个调节信号。
[0447] 根据本发明，术语"载体"指能够运输与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型 的载体是"质粒"，其意思是指可以向其中连接另外的DNA片段的环形双链DNA环。更多类 型的载体是病毒载体，其可以将额外的DNA片段连接入病毒基因组中。某些载体能够在它 们所导入的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起始点的细菌载体）。其它优选的载 体当它们被引入至宿主细胞中时有利地全部或部分整合入宿主细胞的基因组中，并因此与 宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够控制与它们有效连接的基因的表达。在本文上 下文中，这些载体被称为"表达载体"。如上面所提到，它们能够自主复制或者可以部分或全 部整合入宿主基因组中。适用于DNA重组技术的表达载体通常采用质粒形式。在本说明书 中，"质粒"和"载体"可互换使用，因为质粒是最频繁使用形式的载体。然而，本发明还旨在 包括发挥相似功能的其它形式的表达载体，例如病毒载体。此外，术语载体还包括技术人员 已知的其他载体，例如噬菌体、病毒例如SV40、CMV、TMV、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘 粒和线性或环状DNA。
[0448] 在重组表达载体中，"有效连接"意思是指目的核酸分子以基因表达成为可能的 方式连接至调节信号：它们彼此如此连接以致于两个序列实现对于序列所指定的预期功能 (例如在体外转录/翻译系统中，或在宿主细胞中，如果载体被引入宿主细胞中的话）。
[0449] 术语"调节序列"旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件（例如多腺苷化 信号）。这些调节序列描述于例如 Goeddel :Gene Expression Technology :Methods in Enzymologyl85，Academic Press，San Diego，CA(1990)，或参见：Gruber 和 Crosby，in : Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida,Ed. :Glick和Thompson,第7章，89-108中，包括它们当中所引用的文献。调节序 列包括控制核苷酸序列在许多类型宿主细胞中组成型表达的那些，和控制核苷酸序列仅在 特定细胞中和在特定条件下直接表达的那些。技术人员知道，表达载体的设计将取决于多 种因素如待转化宿主细胞的选择、蛋白质量减少的程度等等。对调节序列的优选选择描述 于上面，例如启动子、终止子、增强子等等。术语调节序列被认为包含在术语调节信号之内。 数个有利的调节序列，尤其是启动子和终止子在上面描述。通常，作为适宜表达的有利核酸 构建体描述的调节序列也适用于载体。
[0450] 备选地，核酸序列可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于 在所培养的昆虫细胞（例如Sf9细胞）中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列 (Smith 等（1983)Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)和 pVL 系列（Lucklow 和 Summers(1989) Virologyl70:31-39)。上面提到的载体仅是可能的适宜载体的小的概述。更多的质粒 是技术人员已知的并且描述于例如Cloning Vectors(Ed.Pouwels，P.H.等，Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN0444904018)。用于原核细胞和真核细胞的更多 的适宜表达系统见 Sambrook，J.，Fritsch，E. F.和 Maniatis，T.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989 中的第 16 和 17 章。
[0451] 因此，本发明的一个实施方案涉及包含用于根据本发明方法中的核酸分子或用于 本发明方法中的核酸构建体，例如本发明的核酸分子或核酸构建体的载体。所述载体可用 于转染或转化宿主细胞以便提供根据本发明多肽的表达。有利地，所述核酸分子与用于在 原核或真核宿主中或者在原核和真核宿主中表达的调节序列有效连接。此外，适宜同源重 组的载体也处于本发明范围之内。
[0452] 因此，本发明的一个实施方案涉及已经用适宜本发明方法的载体，特别是用根据 本发明的载体或根据本发明的核酸分子或根据本发明的核酸构建体稳定或瞬时转化的宿 主细胞，由此宿主的膜不内源显示本发明多肽的活性。
[0453] 本发明的更多实施方案还涉及产生转基因宿主细胞，例如真核或原核宿主或宿主 细胞，优选转基因哺乳动物细胞的方法，包括向宿主细胞中引入根据本发明的核酸构建体、 根据本发明的载体或根据本发明的核酸分子，由此宿主的膜不内源显示本发明多肽的活 性。
[0454] 载体DNA可以通过常规转化或转染技术引入至原核或真核细胞中。术语"转 化"和"转染"包括接合和转导，并且如在本文上下文中所使用，旨在包括用于将外来核 酸分子（例如DNA)引入宿主细胞内的多种多样的现有技术方法，包括磷酸钙共沉淀或 氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、PEG-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学 介导的转移、电穿孔或粒子轰击。用于宿主细胞包括植物细胞转化或转染的适宜方法可 以在 Sambrook 等(Molecular Cloning ：A Laboratory Manual.,2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989)和其它实验室手册如Methods in Molecular Biology，1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols，Ed. :Gartland and Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey 中找到。
[0455] 为了选择核酸分子、载体或核酸构建体向宿主生物内的成功转移，有利的是使用 已经在上面详细描述的标记基因。对于核酸向植物细胞内的稳定或瞬时整合，已知仅少数 细胞摄入外来DNA并且如果预期的话，将其整合入其基因组中，这取决于所使用的表达载 体和所使用的转染技术。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码可选择标记的基因（如 上所述，例如对抗生素的抗性）与目的基因一起引入到宿主细胞内。优选的可选择标记是 例如编码参与抗性的基因的标记，优选抗生素抗性基因或者如糖或氨基酸生物合成途径 中的基因，例如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。编码基因如萤光素酶、gfp或其他荧光基因 的标记同样适用。这些标记和上述标记可以用于突变体中，在所述突变体中这些基因不具 有功能，因为它们已经通过常规方法被缺失。此外，编码可选择标记的核酸分子可以与编码 本方法所用核苷酸分子在同一载体上引入至宿主细胞中，或者在分开的载体上引入至宿主 细胞中。已经以所引入核酸分子稳定转染的细胞可以通过例如选择来鉴定（例如，已经整 合入可选择标记的细胞存活而其它细胞死亡）。
[0456] "报告基因"编码容易定量的蛋白质，如上述标记基因一样。转化效率或表达位 点或时限可通过这些基因经生长测定、荧光测定、化学发光测定、生物发光测定或抗性测 定或光度测量（内在颜色）或酶活性评价。在该上下文中，极其特别优选的是报告蛋白 质（Schenborn E，Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999 ; 13(1) :29-44)例如"绿色突光蛋 白"（GFP)(Gerdes HH 和 Kaether C，FEBS Lett. 1996 ;389(1):44-47 ;Chui WL 等，Curr Biol 1996,6:325-330 ;Leffel SM 等，Biotechniques· 23 (5): 912-8,1997)、氯霉素乙酰转 移酶、萤光素酶（Giacomin，Plant Scil996,116:59-72 ;Scikantha，J Bactl996,178:121 ; Millar等，Plant Mol Biol R印199210:324-414)和一般的萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶 或 β-葡糖醛酸糖苷酶（Jefferson等，EMBO J. 1987,6, 3901-3907)或 Ura3基因。
[0457] "选择标记"赋予对抗生素或其他毒性化合物的抗性：在该上下文中可以提到 的实例是新霉素磷酸转移酶基因，其赋予对氨基葡糖苷抗生素新霉素（G418)、卡那霉 素、巴龙霉素的抗性（Deshayes A等，EMBO J. 4(1985)2731-2737)，编码突变的二氢蝶 酸合酶的 sul 基因 （Guerineau F 等，Plant Mol Biol. 1990; 15(1): 127-136)，潮霉素 B磷酸转移酶基因 （Gen Bank登录号：K01193)和she ble抗性基因，其赋予对博来霉 素抗生素如zeocin的抗性。选择标记基因的更多实例是赋予对2-脱氧葡萄糖-6-磷 酸（W098/45456)或膦丝菌素等等抗性的基因，或赋予对抗代谢物抗性的那些基因，例 如 dhfr 基因（Reiss，Plant Physiol. (Life Sci. Adv. ) 13(1994) 142-149)。其他适宜 的基因实例是 trpB 或 hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci U S A. 85(1988)8047-8051)。另一适宜基因是甘露糖磷酸异构酶基因（W094/20627)，ODC(鸟氨 酸脱羧酶）基因（McConlogue，1987in :Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory，Ed.)或土曲霉脱氨酶（Tamura K等，Biosci Biotechnol Biochem. 59(1995)2336-2338)。
[0458] 在一个实施方案中，本发明的载体或核酸构建体包括编码亲和标记的核酸序列。 "亲和标记":指肽或多肽，其编码核酸序列可使用惯常克隆技术直接或通过连接体方式与 编码本发明多肽的核酸序列融合。亲和标记用于通过亲和层析从总细胞提取物中分离、浓 缩和/或特异纯化重组靶蛋白质。上述连接体可有利的包含蛋白酶切割位点（例如凝血酶 或因子Xa的切割位点），由此当需要时可从靶蛋白质上将亲和标记切割下来。常用的亲和 标记的实例为来自Quiagen的"His标记"、Hilden、"Strep标记"、"Myc标记"(Invitrogen， Carlsberg)、来自New England Biolabs的由壳多糖-结合结构域和内含肽组成的标记、来 自New England Biolabs的麦芽糖结合蛋白质（pMal)和来自Novagen的称作CBD的标记。 在该上下文中，亲和标记可以连接至编码靶蛋白质的编码核酸序列的5'或3'端。
[0459] 本发明的核酸分子可以用于产生杂交探针，通过杂交探针可以分离根据本发明的 核酸序列的功能等同物。这些探针的产生和实验步骤是已知的。例如，这涉及通过PCR特 异性产生放射性或非放射性探针和适宜标记的寡核苷酸的使用和之后的杂交实验。对于此 目的所需要的技术在例如 T. Maniatis，E. F. Fritsch 和 J. Sambrook，Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989) 中提到。此外，所讨论的探针可以通过标准技术（Lit. SDM或随机诱变）以如此方式修饰， 以致于它们能够用于更多目的，例如用作与mRNA和相应编码序列特异性杂交的探针以便 分析其它生物中的相应序列。探针可以用于例如筛选所述昆虫的基因组文库或cDNA文库 或者在电子数据库中计算机搜索类似序列。
[0460] "遗传控制序列":术语"遗传控制序列"被认为与术语"调节序列"等同，并且描述 对根据本发明的核酸在原核或真核生物中的转录并且如果合适对翻译具有影响的序列。实 例是启动子、终止子或称作"增强子"的序列。除了这些控制序列外或者代替这些序列，这些 序列的天然调节可仍存在于实际结构基因之前，并且如果合适，会以如此方式进行遗传修 饰以致于关闭天然调节并且靶标基因的表达已经被修饰，也就是说增加了或者减少了。控 制序列的选择取决于宿主生物或起始生物。此外，遗传控制序列还包括基因的5' -非翻译 区、内含子或非编码3'区。此外，控制序列理解为意思是指允许向宿主生物基因组中进行 同源重组或插入的那些或者允许从基因组去除的那些。
[0461] "敲除转化体"指在其中特定基因已经通过转化手段以定向方式被分别失活，特定 基因的活性已经被降低、下调、减少或缺失的个体转基因生物。
[0462] "天然遗传环境"指原来生物中的天然染色体基因座。以基因组文库为例，核酸序 列的天然遗传环境优选地至少部分保留。该环境至少在核酸序列5'或3'侧面，并且具有 至少50bp、优选至少100bp、特别优选至少500bp、非常特别优选至少IOOObp和最优选至少 5000bp的序列长度。
[0463] "反应时间"指开展活性测定直至得到关于活性的重要发现所需要的时间；它取决 于在测定法中所采用蛋白质的比活性和所使用方法以及所用设备的灵敏度。技术人员熟悉 反应时间的确定。以基于光度鉴定杀真菌活性化合物的方法为例，反应时间通常在>0和 360分钟之间。
[0464] "重组DNA"描述可通过重组DNA技术产生的DNA序列的组合。
[0465] "重组DNA技术":是用于融合DNA序列的通常已知的技术（例如描述于Sambrook 等，1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press 中）。
[0466] "复制起点"保证了根据本发明的表达盒或载体在微生物和酵母中的繁殖，例 如大肠杆菌（E. coli)中的 pBR322ori、ColEl 或 P15A ori (Sambrook 等· ：Molecular Cloning. A Laboratory Manual,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989)和酵母中的 ARSlori (Nucleic Acids Research，2000,28(10): 2060-2068)。
[0467] "靶标/靶标蛋白质":具有下列活性的本发明的多肽、蛋白质
[0468] i)钾离子通道和/或其辅助蛋白，或
[0469] ii)钾离子通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或C亚型，或
[0470] iii)具有酚乙醇胺受体活性的蛋白质，或
[0471] iv)钾离子通道。
[0472] 所有的靶标或作用位点共有特征，即靶标蛋白质功能的存在是昆虫存活所必须 的。
[0473] "转化"描述向原核或真核细胞内引入异源性DNA的过程。所转化细胞不仅描述了 转化过程本身的产物，还描述了通过转过过程所产生转基因生物的所有转基因后代。
[0474] "转基因的":指包含根据本发明的核酸序列的核酸序列、表达盒或载体或者以根 据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，术语转基因描述已经通过遗传工程方法 产生的所有那些构建体，其中靶标蛋白质的核酸序列，或者有效连接至靶标蛋白质的核酸 序列的遗传控制序列，或者上述可能性的组合不在它们的天然遗传环境中或者已经通过重 组方法修饰。在该上下文中，修饰可以通过例如将所述核酸序列的一个或更多个核苷酸残 基突变实现。
[0475] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的多肽、膜或宿主细胞用作杀虫靶标的用 途。
[0476] 编码黑腹果蝇昆虫电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样） 和/或其辅助蛋白KChIP (钾通道相互作用蛋白）的基因的缺失，或电压门控性钾通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活 性的抑制对黑腹果蝇而言是致死性的。
[0477] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽：
[0478] a)编码SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；
[0479] b)SEQ ID N0:l、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子；
[0480] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID N0:2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；
[0481] d)与包含SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26和/或30所示核酸分子的多核苷酸 的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0482] e)核酸分子，编码与（a)至（C)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分别具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或 其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽；
[0483] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0484] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且分别具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1 或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽产生；
[0485] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO :33和/或34中分别所示共有序列或分别选自 SEQIDN0:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和/或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一个或更多个 基序的多肤；
[0486] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :7、8 ;9、10 ;11、 12中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；
[0487] 和
[0488] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，探针包含 (a)或（b)的核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列互 补并编码分别具有电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助 蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白）活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt,
[0489] 或其同源物用作杀虫靶标的用途。
[0490] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为例，黑腹果蝇中编码昆虫Shaker通 道和/或HyperkineticP亚基，优选H-kvP亚基A或C亚型的基因的缺失，或Shaker通 道和/或Hyperkinetic β亚基，优选H-kvi3亚基A或C亚型活性的抑制对黑腹果蝇而言 是致命性的。
[0491] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽：
[0492] a)编码包含SEQ ID勵：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核 酸分子；
[0493] b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分 子；
[0494] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；
[0495] d)与包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示核酸分子的多核苷 酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0496] e)核酸分子，编码与（a)至（C)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或 C亚型活性的多肽；
[0497] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0498] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且分别具有Shaker通道和/或HyperkineticP亚基， 优选H-kv β亚基A或C亚型活性的多肽产生；
[0499] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO : 102和/或103中分别所示共有序列或分别选 白 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多 肽；
[0500] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ; 92、93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组 文库得到；
[0501] 和
[0502] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，探针包含 (a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列互补 并编码分别具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或C亚型活 性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,
[0503] 或其同源物用作杀虫靶标的用途。
[0504] 以G蛋白偶联受体为例，黑腹果蝇或其他昆虫中编码选自优选来自黑腹果蝇的 oa2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的昆虫酚乙醇胺受体的基因的缺失，或选自优选来自黑 腹果蝇〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺受体活性的抑制对黑腹果蝇或其它 昆虫而言是致命性的。
[0505] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽：
[0506] a)编码 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174 中所不多肽的核酸分子；
[0507] b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所 不核酸分子；
[0508] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID NO :130、134、 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列的多肽；
[0509] d)与包含 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；
[0510] e)核酸分子，编码与（a)至（c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇 胺受体活性的多肽；
[0511] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0512] g)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a)至（e)之一的核酸分子所编码并且具有选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-0_2R 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受体活性的多肽产生；
[0513] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分别所示共有序列或分 别选自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226的一个或更多个基序的多肽；
[0514] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :131、132 ;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156、159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；
[0515] 和
[0516] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序列 互补并编码具有选自优选来自黑腹果蝇〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺受 体活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt,
[0517] 或其同源物用作杀虫靶标的用途。
[0518] 以SK-通道为例，黑腹果蝇中编码昆虫小电导Ca2+激活钾通道基因的缺失，或昆 虫小电导Ca2+激活钾通道活性的抑制对黑腹果蝇而言是致命性的。
[0519] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及由选自下列的核酸分子编码的多肽：
[0520] a)编码SEQ ID NO :228、230、232中所示多肽的核酸分子；
[0521] b) SEQ ID NO : 227、229、231 中所示核酸分子；
[0522] c)核酸分子，其因遗传密码子的简并性可以衍生自根据SEQ ID NO :228、230、232 的多肽序列；
[0523] d)与包含SEQ ID NO :228、230、232所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具 有至少50 %同一'丨生的核酸分子；
[0524] e)核酸分子，其编码与（a)至（c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽；
[0525] f)在严格杂交条件下与（a)至（C)的核酸分子杂交的核酸分子；
[0526] g)核酸分子，其编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针 对（a)至（e)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生；
[0527] h)核酸分子，编码包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或选自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的多 肽；
[0528] i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ;和237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到；
[0529] 和
[0530] j)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包 含（a)或（b)核酸分子的互补序列或具有其片段，具有与（a)至（e)中所表征核酸分子序 列互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt，
[0531] 或其同源物用作杀虫靶标的用途。
[0532] 本发明此外涉及包含下列的核酸构建体或表达盒
[0533] a)与包含下列的核酸序列有效连接的遗传控制序列
[0534] i)具有 SEQ ID N01、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29,至于 shaker 通道和 / 或 HyperkineticP 亚基为 SEQ ID N072,74, 76, 78,80,82,84和 / 或86,至于G 蛋白偶联受体 为 SEQ ID N0129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173,并且至于 SK-通 道为SEQ ID N0227、229、231中所示核酸序列的核酸序列；或
[0535] ii)基于遗传密码子简并性，可以通过回译从SEQ ID N02、6、10、14、18、22、26和 / 或 30,至于 shaker 通道和 / 或 HyperkineticP 亚基为 SEQ ID N073、75、77、79、81、83、 85 和 / 或 87,至于 G 蛋白偶联受体为 SEQ ID N0130、134、138、142、146、150、154、158、162、 166、170和/或174，并且至于SK-通道为SEQIDN0228、230、232 所示氨基酸序列衍生的 核酸序列；或
[0536] iii)核酸序列 SEQ ID N01、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29,至于 shaker 通道和 / 或 HyperkineticP 亚基为 SEQ ID N072,74,76,78,80,82,84 和 / 或86,至于G 蛋白偶联受体 为 SEQ ID N0129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和/ 或 173,并且至于 SK-通 道为SEQ ID N0227、229、231的功能等同物；
[0537] 和
[0538] b)额外的功能元件；或
[0539] c)a)和b)的组合
[0540] 并且涉及包含下列的核酸构建体或表达盒
[0541] a)与根据本发明的核酸序列有效连接的遗传控制序列；
[0542] b)额外的功能元件；或
[0543] c)a)和b)的组合
[0544] 在"体外"或"体内"测定系统中的用途。
[0545] 本发明此外涉及核酸构建体或表达盒的上述实施方案用于在体外或体内测定系 统中表达本发明多肽的用途。
[0546] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的多肽、膜或宿主细胞用于鉴定具有杀虫 活性的化合物的用途。
[0547] 本发明此外涉及本发明的多肽在用于鉴定杀虫化合物的方法中的用途。
[0548] 根据本发明方法的优选实施方案包括下列步骤：
[0549] i.将本发明的多肽在允许一种或更多种测试化合物与本发明多肽结合的条件下 与一种或更多种测试化合物接触，
[0550] ii.检测测试化合物是否结合在i)中所述本发明的多肽；或
[0551] iii.检测测试化合物是否减少或抑制或封闭在i)中所述本发明多肽的活性；或
[0552] iv.检测测试化合物是否减少或抑制或封闭具有下列活性的多肽的转录、翻译或 表达
[0553] 1.在i)中所述电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其 辅助蛋白KChIP(钾通道相互作用蛋白），或
[0554] 2.在i)中所述Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选H_kv β亚基A或 C亚型，或
[0555] 3.在i)中所述选自优选来自黑腹果蝇oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的酚 乙醇胺受体，或
[0556] 4.在i)中所述昆虫小电导Ca2+激活钾通道。
[0557] 按照上述方法步骤ii或iii对本发明多肽活性的检测，可以使用多种体外和体内 测定法评价，例如测量电流、测量膜电位、测量离子流如钾或铷、测量钾浓度、测量第二信使 和转录水平、使用钾依赖性酵母生长测定法和使用如电压敏感染料、放射性示踪剂和膜片 钳电生理学。
[0558] 以G蛋白偶联受体为例，按照上述方法步骤ii或iii对本发明多肽活性的检测， 可以使用多种体外和体内测定法评价，例如测量电流、测量膜电位、测量离子流如钙、优选 测量钙浓度、测量第二信使和转录水平、使用钾依赖性酵母生长测定法和使用如钙浓度敏 感染料或放射性示踪剂。
[0559] 按照上述方法步骤ii或iii的检测可使用鉴定蛋白质和配体之间相互作用的 技术实现。在该上下文中，测试化合物或者多肽可包含可检测标记例如荧光标记、放射性 同位素、化学发光标记或膜或电位标记。标记的实例选自来自Molecular Devices的 蓝色膜电位染料、ANEP (氨基萘基乙烯基吡啶省）染料像di-4-ANEPPS、di-8-ANEPPS、 di-2-ANEPEQ+、di-8-ANEPPQ、di-12-ANEPPQ;RH 染料（最初由 Rina Hildesheim 合 成），包括来自Molecular Probes的一系列的二烷基氨基苯基多烯基吡啶，铺染料像 RH414(T-llll)、RH795(R-649)和 RH237(S-1109)。RH421(S-1108)或来自 Molecular Probes的基于羰花青和氧杂菁的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 中所述。
[0560] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为例，在本发明的一个实施方案中， 检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID NO: 72,74,76,78,80,82,84 和 / 或 86 的昆虫 Shaker 通道和 / 或 HyperkineticP 亚基，优 选H-kv β亚基A或C亚型稳定转染的CHO细胞经受加载至少一种上述染料，优选来自 Molecular Devices的蓝色膜电位染料，达0. 1-3小时、优选0. 5-1小时、优选0. 45小时，
[0561] 通过以l-120mM、优选10-60mM、更优选50mM KCl的EC50值浓度增加 KCl的细胞 外水平活化Shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基，优选Η-kv β亚基A或C亚型，
[0562] 优选以ΙμΜ-lOOmM、10-10000 μΜ、优选100-1000 μΜ的浓度加入怀疑具有抑制 通道活性能力的化合物，
[0563] 测量发光、突光，
[0564] 与对照比较染料的发光/荧光数据
[0565] 和确定所测试化合物是否具有抑制通道活性的能力。
[0566] 以G蛋白偶联受体为例，按照上述方法步骤ii或iii的检测可使用鉴定蛋白质和 配体之间相互作用的技术实现。在该上下文中，测试化合物或者多肽可包含可检测标记例 如荧光标记、放射性同位素、化学发光标记或膜或电位标记。标记的实例可以选自钙浓度 敏感性染料，例如 Fluo_4Calcium Crimson?、Calcium Green?、Calcium Orange?、Calcium Yellow?、Fura Red?、0regonGreen?、Rhod-3、X-rhod-5F、Fura-2、bis-fura-2、flu〇-5F、 flu〇-5N> fura dextran、fura_4F、fura_5F、fura_6F、fura-FF、fura-FF、quin-2、rhod dextran、rhod-2、rhod_5N 或 rhod-FF 或来自 Molecular Probes 的基于撰花青和氧杂菁 的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular Probes'Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 中所述。
[0567] 以SK-通道为例，在本发明的一个实施方案中检测测试化合物是否减少、抑制或 封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID N0:227、229、231的昆虫小电导Ca2+ 激活钾通道稳定转染的CHO细胞经受
[0568] 加载至少一种上述染料，优选来自Molecular Devices的蓝色膜电位染料，达2-6 小时、优选_5小时、优选4小时，
[0569] 以100-500nM、更优选200nM的EC50值浓度的离子载体，优选离子霉素活化小电导 Ca2+激活钾通道，意思是指以1-5 μ M的浓度温育细胞，
[0570] 以5-50 μ Μ、5-20 μ Μ、优选10 μ M的浓度加入怀疑具有抑制通道活性能力的化合 物
[0571] 测量发光、突光
[0572] 与对照比较染料的发光/荧光数据
[0573] 和确定所测试化合物是否具有抑制通道活性的能力。
[0574] 在本发明的一个实施方案中检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活 性的方法包括以优选选自SEQ ID NO : 1、5、9、13、17、21、25和/或29的昆虫电压门控性钾通 道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP (钾通道相互作用蛋白） 稳定转染的CHO细胞经受，
[0575] 加载至少一种上述染料，优选来自Molecular Devices的蓝色膜电位染料，达 0. 5-3小时、优选1. 5小时、优选2-2. 5小时，
[0576] 通过以10-120mM、优选10-60mM、更优选30mM EC50值的KCl浓度增加 KCl的细 胞外水平活化电压门控性钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋白 KChIP (钾通道相互作用蛋白），
[0577] 以1-200 μ Μ、5-100 μ M、优选25-30 μ M的浓度加入怀疑具有抑制通道活性能力的 化合物，
[0578] 测量发光、突光
[0579] 与对照比较染料的发光/荧光数据
[0580] 和确定所测试化合物是否具有抑制通道活性的能力。
[0581] 怀疑具有抑制本发明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。
[0582] 备选地，按照上述方法步骤ii或iii的检测可使用膜片钳技术实现。
[0583] 可使用基本技术的一些变型选自内部-外、外部-外、细胞连接的、双切割膜片、全 细胞膜片和穿孔膜片技术。
[0584] 随后的测定取决于标记并且是技术人员已知的。
[0585] 在本发明的一个实施方案中，检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽 活性的方法包括以优选选自SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30的昆虫电压门控性 钾通道Shal (Shaker同族物1或Shaker样）和/或其辅助蛋白KChIP (钾通道相互作用蛋 白）稳定转染的CHO细胞在室温（22-25°C )下经受全细胞结构的膜片钳技术，使用当充满 吸管溶液时具有2-3M0hm电阻的硼硅玻璃毛细管并且在槽溶液中测量，优选补偿槽和吸管 溶液之间的液体接头电位，在全细胞钳下测量膜电流，以2kHz取样并以IkHz过滤，将细胞 保持在-70mV下并以每2秒IOmV的增量应用从-100至+130mV的一系列400ms测试电 压脉冲，测量波幅，如测量电流-电压相互关系一样，并且定义为在给定去极化电位下的最 大外向电流。
[0586] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为例，在本发明的一个实施方案中， 检测测试化合物是否减少、抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID NO: 73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87 的昆虫 Shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亚基，优选 H-kvi3亚基A或C亚型稳定转染的CHO细胞在室温（22-25°C)下经受全细胞结构的膜片钳 技术。本发明的全细胞电压钳方法包括使用EPClO数字控制的放大器与PATCHMASTER软件 (HEKA Electronics, Lambrect，Germany)组合进行数据采集和进一步的分析。EPClO通过 前脉冲手段提供电容和泄漏电流的自动扣除。数据以66. 7KHz过滤（-3dB，8-pole Bessel 低通滤波器）并以每个点5μ s数字化。膜片吸管的输入电阻是2.0-4. 0ΜΩ并且细胞的电 容是15·3±2· lpF(n = 45);残留系列电阻（在直到80%补偿之后）是4·2±0·4ΜΩ。常规 应用对液体接头电位的修正。膜电位固定在-IOOmV并且电流通过从-60mV至+IOOmV(或 +60mV)的50ms去极化脉冲（0. IHz)引出。
[0587] 怀疑具有抑制本发明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。
[0588] 在一个实施方案中，剩余电容和泄漏电流的扣除使用pClamp的在线P/4方案开 展。
[0589] 以G蛋白偶联受体为例，在本发明的一个实施方案中，检测测试化合物是否减少、 抑制或封闭本发明多肽活性的方法包括使稳定表达G- α -16泛宿主性G蛋白质和稳定或瞬 时表达优选选自 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173 的选自优选来自黑腹果蝇〇a2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺受体的CHO细胞 进行
[0590] 加载至少一种上述染料，优选Fluo-4,达0. 1-3小时、优选0. 5-2小时、优选1小 时，
[0591] 置于FLIPR中并使用两次添加方案运行，由此测试化合物，怀疑具有封闭或活化 酚乙醇胺受体能力的化合物在第一次添加中加入并温育3分钟，
[0592] 然后激活剂酚乙醇胺在第二次添加中以EC80浓度引入并且读取荧光2分钟。对 于两次添加均运行对照。在第一次添加中高于基线的荧光增加将表明是可能的激活剂并且 在第二次添加中反应降低或者没有增加可表明是可能的抑制剂。
[0593] 随后的检测依赖于标记并且是技术人员已知的。
[0594] 以SK-通道为例，在本发明的一个实施方案中，检测测试化合物是否减少、抑制或 封闭本发明多肽活性的方法包括以优选选自SEQ ID N0:228、230、232的昆虫小电导Ca2+ 激活钾通道稳定转染的CHO细胞在室温（22-25°C)下经受全细胞结构的膜片钳技术，使用 当充满电极溶液时具有2-3M0hm抗性的硼硅玻璃毛细管并且在槽溶液中测量，优选补偿槽 和电极溶液之间的液体接头电位，在全细胞钳下测量膜电流，以2kHz取样并以IkHz过滤， 将细胞保持在-70mV下并以每2秒IOmV的增量应用从-100至+130mV的一系列400ms 测试电压脉冲，测量波幅，如测量电流-电压相互关系，并且定义为在给定去极化电位下的 最大外向电流。
[0595] 在根据本发明的方法中，还可以采用多个测试化合物。如果一组测试化合物影响 靶标，则可直接分离各个测试化合物或者可以将测试化合物组分成许多亚组，例如当其由 数个不同成分组成时，以便减少根据本发明的方法中的不同测试化合物的数量。然后，根据 本发明的方法以各个测试化合物重复或者相关亚组的测试化合物重复。取决于样品的复杂 性，上述步骤可以重复开展，优选地直到依照根据本发明方法鉴定的亚组仅包含小数量的 测试化合物或者实际上仅一种测试化合物。
[0596] 根据本发明的方法可有利的作为HTS步骤开展。
[0597] HTS使得同时测试大量不同化合物成为可能。
[0598] 1?通量筛选的质量由两种因素确定，即测定窗口的相对大小和该测定窗口在从对 照实验到对照实验间的稳定性（即?20个测定筛选板对照中的测定信号稳定性）。这表示 为筛选的z'因子并且等式为：
[0599] Z，= 1- ((3 〇 max+3 σ min) / (I μ - μ minI))。
[0600] 以SK-通道外例，高通量筛选的质量由两种因素确定，即测定窗口的相对大小，在 该例中来自完全活化通道的信号减去来自非活化通道的信号（通常表示成任意单位）。第 二个因素是该测定窗口在从对照实验到对照实验间的稳定性（即?20个测定筛选板对照 中的测定信号稳定性）。这表示为筛选的z'因子并且等式为：
[0601] Z，= 1_[3*( 0 max+σ min)/Abs (Ave (MAX)-Ave (MIN))]。
[0602] 所计算的Z' >0. 5被认为是极佳的测定。
[0603] 以shaker通道和/或Hyperkinetic β亚基为例，备选地为了计算Z'因子使用下 列公式：
[0604] 3* (ST. DEV 激动剂 +ST. DEV Tyrode
[0605] Ζ，=1_(------------------------------------------------------------- _)
[0606] MEAN 激动剂-MEAN Tyrode
[0607] 在该上下文中，也适用于与本发明相结合的高通量筛选方法（HTS)的优选实施方 案必须提到，尤其是：
[0608] 1.依照优选的实施方案，根据本发明方法的步骤ii的检测（并且以SK-通道 为例，变体3)包括下列步骤：荧光共振能量转移（FRET)基于适宜条件下两个空间邻近的 荧光分子之间的无辐射的能量转移。前提是供体分子的发射光谱与受体分子的激发光谱 重叠。使用荧光标记的UGP和测试化合物，通过FRET手段可以测量结合（Cyt 〇metry34， 1998，pp. 159-179)。备选地，根据本发明的方法也可采用在1下面描述的"置换测定"形式。 FRET技术的特别适合的实施方案是可以从Packard BioScience得到的"均一时间解析突 光"（HTRF)。以该方式鉴定的化合物可适宜用作抑制剂。
[0609] 2.依照优选的实施方案，根据本发明方法的步骤ii的检测（并且以SK-通道为 例，变体3)包括下列步骤：表面等离振子共振的测量基于当化学化合物结合至已固定至 表面的蛋白质时在所述表面上的折光指数。由于折光指数的变化与几乎所有蛋白质和多 肽在表面上质量浓度的确定变化相同，所以该方法原则上可应用于任何蛋白质（Lindberg 等.Sensor Actuators4(1983)299_304;Malmquist Nature361(1993) 186_187)。测量可以 使用例如从Biacore(Freiburg)可得到的基于表面等离振子共振的自动分析仪以当前每 天高达384个样品的通量开展。根据本发明的方法可以设计成直接测量测试化合物与UGP 的结合。备选地，根据本发明的方法也可采用在1下面描述的"置换测定"形式。以该方式 鉴定的化合物可适宜用作抑制剂。
[0610] 3.依照优选的实施方案，根据本发明方法的步骤ii的检测包括来自Molecular Devices的FLIPR膜电位测定试剂盒的使用，如在实施例中所公开。该方法基于电压敏感性 染料在FLIPR荧光测量成像平板读取仪系统上的应用，显示与手工膜片钳数据良好相关。
[0611] 4.依照优选的实施方案，根据本发明方法的步骤ii的检测包括BIOMOL化合物筛 选或BioFocus化合物筛选的应用，使用两次流体添加方法以允许在单次实验中检测激活 剂和拮抗剂，或随后的BIOMOL和BioFocus验证筛选，如在实施例中所公开。
[0612] 以shaker通道和/或HyperkineticP亚基为例，本发明方法提供对黑腹果蝇 Shaker通道的基于功能细胞的测定法，优选在CH0-K1细胞中通过稳定纯克隆的选择和用 膜电位敏感性染料在FLIPR上，优选FLIPR384和/或FLIPRTETRA或者两个实验上和电生 理学技术进行功能表征而开发。
[0613] 所产生的测定法完全符合HTS需要，显示出极高的信号质量和再现性。
[0614] 为了高通量筛选的目的，下列参数应该提到：
[0615] ?激活剂KCl浓度：在活化缓冲液中50mM(?EC80)
[0616] ?参照 Z' ：0.60
[0617] ?对于单一测定板的最低可接受Z' ：0. 45
[0618] ?对于命中的％抑制阈值：40%
[0619] 通过上述方法鉴定的所有物质可以随后在根据本发明方法的另一实施方案中检 查它们的杀虫作用。
[0620] 此外，通过使用通过X射线结构分析阐明本发明多肽的三维结构的分子建模，存 在检测用于杀虫活性成分的更多候选物的可能性。对于X射线结构分析所必需的蛋白质晶 体的制备、和相关测量和这些测量的随后评价、蛋白质中结合位点的检测和潜在抑制剂结 构的预测是技术人员已知的。原则上，通过分子建模也可以对通过上述方法鉴定的活性化 合物进行优化。
[0621] 在一个实施方案中，与测试化合物温育的本发明多肽的活性与野生型细胞对照的 活性或者在步骤iii中不与测试化合物温育的本发明多肽的活性相比较。
[0622] 在该上下文中，在步骤（iii)中选择化合物，其导致实现本发明多肽活性显著降 低，至少10%减少，有利的至少20%、25%、29%、优选至少30%、特别优选至少50%和非 常特别优选至少 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%减少（抑制）。
[0623] 本发明此外涉及通过根据本发明方法鉴定的化合物。这些化合物在下文被称为 "选择的化合物"。它们具有小于l〇〇〇g/mol、有利的小于500g/mol、优选的小于400g/mol、 特别优选小于300g/mol的分子量。杀虫活性化合物具有小于1 μ Μ、优选小于1 μ Μ、特别优 选小于0. 1 μ Μ、非常特别优选小于0. Ol μ M的Ki值。
[0624] 通过上述方法鉴定和/或在实施例中所示的物质描述于表I中：
[0625]
【权利要求】
1. 鉴定杀虫活性化合物的方法，所述杀虫活性化合物降低： -G -蛋白偶联受体（GPCR)的活性，所述G-蛋白偶联受体具有选自优选来自黑腹果 蝇、桃姆、赤拟谷盗的〇a2、Oamb、Oct-0 -2R和Oct-0 -3R的酚乙醇胺受体的活性，或 一昆虫Shaker通道和/或HyperkineticP亚基，优选H_kv0亚基A或C亚型的活性 或 一昆虫小电导Ca2+激活钾通道的活性， 所述方法包括： a_l)在膜中装配具有G-蛋白偶联受体（GPCR)活性的多肽，所述G-蛋白偶联受体 具有最初不存在于所述膜中的、具有选自优选来自黑腹果蝇、桃蚜、赤拟谷盗的〇a2、Oamb、 Oct- P -2R和Oct- P -3R的酚乙醇胺受体活性， a_2)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、分别具有昆虫Shaker通道和/或 HyperkineticP亚基，优选H-kvP亚基A或C亚型活性的多肽， a_3)在膜中装配最初不存在于所述膜中的、具有昆虫小电导Ca2+激活钾通道活性的 多肽， b) 在一侧膜上应用怀疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化 合物， c) 检测所述多肽的活性，和 d) 鉴定在（b)中应用的降低所述多肽活性的化合物。
2. 根据权利要求1的方法，其中编码 一G-蛋白偶联受体（GPCR)，所述G-蛋白偶联受体（GPCR)具有选自优选来自黑腹果 蝇、桃姆、赤拟谷盗的〇a2、Oamb、Oct- 0 -2R和Oct- 0 -3R的酚乙醇胺受体活性， 一昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亚基，优选H_kv 0亚基A或C亚型或 一昆虫小电导Ca2+激活钾通道 的基因表达于宿主细胞的膜中。
3. 权利要求1或2中任意一项的方法，其中膜包含由选自下列的核酸分子编码的至少 一种多肽： a_l)编码 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174中 所不多肽的核酸分子； b-l)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示 核酸分子； c-1)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自根据SEQ ID N0:130、134、138、142、 146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列； (1-1)与包含3￡0 1〇勵：129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173 所不核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子； e_l)核酸分子，其编码与（a-1)至（c-1)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至 少50%同一性并且具有G-蛋白偶联受体（GPCR)的活性的多肽，所述G-蛋白偶联受体具 有选自优选来自黑腹果蝇、桃姆、赤拟谷盗的〇a2、Oamb、Oct-0 -2R和Oct-0 -3R的酚乙醇 胺受体的活性； f-1)在严格杂交条件下与（a_l)至（c-1)的核酸分子杂交的核酸分子； g-1)核酸分子，其编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a-1)至（e-1)之一的核酸分子所编码并且具有G-蛋白偶联受体（GPCR)的活性的多肽 产生，所述G-蛋白偶联受体具有选自优选来自黑腹果蝇、桃蚜、赤拟谷盗的oa2、0amb、 Oct- P -2R和Oct- P -3R的酚乙醇胺受体的活性； h_l)核酸分子，其编码包含SEQ ID NO : 177、178和/或179中分别所示共有序列或分 别选自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226的一个或更多个基序的多肽； i_l)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID N0:131、132;135、 136 ;139、140 ;143、144 ;147、148 ;151、152 ;155、156 ;159、160 ;163、164 ;167、168 ;171、172 和/或175、176中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到； 和 j-1)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含 (a-1)或（b-1)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a-1)至（e-1)中所表征核酸分子 序列互补并编码具有G-蛋白偶联受体（GPCR)的活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选 20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述G -蛋白偶联受体具有选自优选来自黑腹果 蝇、桃姆、赤拟谷盗的〇a2、Oamb、Oct-0 -2R和Oct-0 -3R的酚乙醇胺受体活性，或 a-2)编码包含SEQ ID勵：73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核酸 分子； b_2)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的核酸分子； c-2)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自包含根据SEQ ID N0:73、75、77、79、 81、83、85和/或87的多肽序列的多肽； d_2)与包含SEQ ID勵：72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷酸 的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子； e_2)核酸分子，其编码与（a-2)至（c-2)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至 少50%同一性并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亚基，优选H_kv 0亚基A 或C亚型活性的多肽； f-2)在严格杂交条件下与（a_2)至（c-2)的核酸分子杂交的核酸分子； g_2)核酸分子，其编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a-2)至（e-2)之一的核酸分子所编码并且分别具有Shaker通道和/或Hyperkinetic 3 亚基，优选H-kv P亚基A或C亚型活性的多肽产生； h_2)核酸分子，其编码包含SEQ ID NO : 102和/或103中分别所示共有序列或分别选 白 SEQ ID N0:104、105、106、107、108、109、110、lll、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一个或更多个基序的多肽； i_2)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID NO :88、89 ;90、91 ;92、 93 ;94、95 ;96、97 ;98、99和/或IOOUOl中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库 得到； 和 j-2)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含 (a-2)或（b-2)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a-2)至（e-2)中所表征核酸分子 序列互补并编码分别具有Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亚基，优选H_kv 0亚基A或 〇亚型活性的多肽的核酸分子的至少15]11:、优选2〇111:、3〇111:、5〇111:、10〇111:、20〇111:或50〇111:，或 a-3)编码SEQ ID NO :228、230、232中所示多肽的核酸分子； b-3)SEQ ID NO :227、229、231 中所示核酸分子； c-3)核酸分子，其因遗传密码的简并性可以衍生自根据SEQ ID N0:228、230、232的多 肽序列； d-3)与包含SEQ ID N0:227、229、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有 至少50 %同一'丨生的核酸分子； e_3)核酸分子，编码与（a-3)至（c-3)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽； f-3)在严格杂交条件下与（a_3)至（c-3)的核酸分子杂交的核酸分子； g_3)核酸分子，编码可以借助于单克隆或者多克隆抗体分离的多肽，所述抗体针对 (a-3)至（e-3)之一的核酸分子所编码并且具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽产生； h_3)核酸分子，编码包含SEQ ID N0:239中所述共有序列或选自SEQ ID N0:240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一个或更多个基序的多肽； i_3)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用SEQ ID N0:233、234;235、 236 ;237、238中分别所示的引物扩增cDNA文库或者基因组文库得到； 和 j-3)通过在严格杂交条件下用探针筛选适当核酸文库得到的核酸分子，所述探针包含 (a-3)或（b-3)核酸分子互补序列或具有其片段，具有与（a-3)至（e-3)中所表征核酸分 子序列互补并编码具有小电导Ca2+激活钾通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、优选 20nt、30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。
4. 权利要求1的方法，其中所述多肽的活性通过荧光测定法测定。
5. 权利要求2的方法，其中所述多肽的活性使用钙浓度敏感染料测定。
6. 权利要求2的方法，其中编码具有所述多肽活性的多肽的基因在哺乳动物细胞中表 达。
7. 权利要求2的方法，其中编码具有所述多肽活性的多肽的基因在选自CHO细胞、 HEK293的哺乳动物细胞中表达。
8. 权利要求1的方法，包括： a) 向昆虫害虫、昆虫害虫群体或所在场所应用，其中所述昆虫害虫以昆虫控制量的根 据权利要求Id)项鉴定的化合物控制，和 b) 检测所处理昆虫害虫或昆虫害虫群体或所述场所上的昆虫害虫群体和未处理昆虫、 昆虫群体或场所的生长或生存力和 c) 选择在应用步骤e)的化合物后降低所处理昆虫害虫或昆虫害虫群体或所述场作上 昆虫害虫群体生长或生存力的化合物。
9. 用于鉴定降低 -G -蛋白偶联受体（GPCR)的活性，所述G-蛋白偶联受体具有选自优选来自黑腹果 蝇、桃姆、赤拟谷盗的〇a2、Oamb、Oct-0-2R和Oct-0-3R的酚乙醇胺受体的活性，或 一昆虫Shaker通道和/或HyperkineticP亚基，优选H_kv0亚基A或C亚型的活性 或 一昆虫小电导Ca2+激活钾通道的活性的杀虫活性化合物的测定系统，包含宿主生物、 组织、细胞或其细胞消化物或膜，其已经包埋入、装配入、插入或整合入选自如权利要求3a) 至3j)项中所述核酸分子的核酸分子并且基于该核酸分子的表达，具有 -G -蛋白偶联受体（GPCR)，所述G -蛋白偶联受体具有选自优选来自黑腹果蝇、桃蚜、 赤拟谷盗的〇a2、Oamb、Oct- P -2R和Oct- P -3R的酚乙醇胺受体的活性，或 一昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亚基，优选H_kv 0亚基A或C亚型或 一昆虫小电导Ca2+激活钾通道的生物学活性的多肽。
10. 权利要求9的测定系统，其中宿主生物是表达选自权利要求3a)至3j)项中所述核 酸分子的核酸分子的稳定转染的哺乳动物细胞。
11. 权利要求10的测定系统，其中哺乳动物细胞选自：CHO细胞、HEK293、COS、HeLa、 NIH3T3、BAK21、Jurkat、CV-I、IfepC-2-、爪蟾卵母细胞、Sf9、S2、Sf 21、Hi5、Pc 12、U20S。
12. 杀死昆虫害虫或者抑制昆虫害虫生长或生存力的方法，包括向昆虫害虫应用根据 权利要求1的方法鉴定的化合物。
13. 核酸分子，其选自权利要求3a)到3j)中描述的核酸分子。
14. 包含根据权利要求13的核酸分子的核酸构建体。
15. 包含根据权利要求14的核酸构建体或根据权利要求13的核酸分子的载体。
16. 包含根据权利要求15的载体、根据权利要求14的核酸构建体或根据权利要求13 的核酸分子的转基因细胞。
17. 根据权利要求13的核酸分子编码的多肽。
18. 具有 -G -蛋白偶联受体（GPCR)，所述G -蛋白偶联受体具有选自优选来自黑腹果蝇、桃蚜、 赤拟谷盗的〇a2、Oamb、Oct- P -2R和Oct- P -3R的酚乙醇胺受体的活性，或 一昆虫Shaker通道和/或Hyperkinetic 0亚基，优选H_kv 0亚基A或C亚型或 一昆虫小电导Ca2+激活钾通道 的活性的多肽用作杀虫靶标的用途。
19. 由选自权利要求3a)至3j)项所述核酸分子的核酸分子编码的多肽用作杀虫靶标 的用途。
20. 米安色林和/或赛庚啶用作杀虫活性成分的用途。
【文档编号】A01N43/40GK104316693SQ201410319978
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2009年11月5日 优先权日:2008年11月6日
【发明者】P·贝尔纳斯科尼, J·多施, L·斯塔姆, S·齐特科, N·B·兰克尔, M·格里斯沃尔德, F-J·布劳恩, G·鲁, R·D·柯克敦, B·韦德尔, J·迪克豪特, S·格罗斯, A·霍夫海因, J·青克, F·马隆, D·豪茨, R·坎德萨米, D·伦敦, T·M·格加纳斯 申请人:巴斯夫欧洲公司