一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系的选育方法
【专利摘要】本发明建立了牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，主要包括如下的步骤：迟钝爱德华氏菌感染牙鲆鱼苗及其抗病力测定方法、抗迟钝爱德华氏菌病群体筛选方法、抗迟钝爱德华氏菌病家系筛选方法以及抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记筛选方法等，筛选到抗病家系特异微卫星标记；建立了抗病家系后代抗病力和养殖成活率测试方法，创制了牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系。采用本发明技术生产的牙鲆苗种具有抗迟钝爱德华氏菌病能力强、养殖成活率高、死亡率低、生长速度较快的特点，基本解决了牙鲆苗种夏季因感染迟钝爱德华氏菌而爆发腹水病引起大量死亡的问题，适合在全国沿海地区牙鲆养殖场推广应用。
【专利说明】-种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系的选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖业的鱼类遗传育种【技术领域】，具体涉及一种牙鲆抗迟钝爱德 华氏菌病优良品系的选育方法。
【背景技术】
[0002] 牙鲆是中国、日本和韩国重要的海水养殖鱼类，也是人们喜爱的高蛋白水产品。目 前我国牙鲆的养殖产量大约是每年2万吨，产值为25-30亿元人民币。除满足国内市场的 需要外，牙鲆还是出口创汇的主要水产品之一。然而，随着牙鲆养殖业的快速发展，一些问 题相继出现，特别是病害频发、种质退化、苗种成活率低等，每年给牙鲆养殖业造成高达近 10亿元人民币的经济损失，从而极大限制了牙鲆养殖业的发展。
[0003] 危害牙鲆的主要病害是细菌性和病毒性疾病，尤以细菌性疾病造成的危害最大。 目前牙鲆养殖业中危害最大的细菌性疾病是由迟钝爱德华氏菌引起的腹水病（张晓君等， 2005 ;朱壮春等，2006)和由鳗弧菌引起的弧菌病（周丽等，1997)。特别是由迟钝爱德华氏 菌引起的腹水病危害尤为严重，导致苗种阶段死亡率高达70%以上。一些学者虽然针对鲆 鲽类腹水病的病原和病理开展过一些研究，但这些研究主要是针对自然发病的病鱼进行迟 钝爱德华氏菌的分离、鉴定及抗菌素类药物防治等（王印庚等，2007;秦雷等，2009)。尽管 采取抗菌素类药物等传统的防病措施对腹水病的治疗有一定效果，但仍无法从根本上解决 病害频发及其导致的重大经济损失等问题；并且抗菌素类药物容易在鱼体内积累、对消费 者的健康具有潜在危害、容易使病原菌产生抗药性以及严重污染养殖环境等问题，因此在 鱼类养殖业中的应用越来越受到限制；同时抗菌素的使用也不能满足人们日益增长的对无 药物残留绿色水产品的需求。因此，采用现代生物技术培育抗迟钝爱德华氏菌病能力强、 生长速度快的牙鲆新品种，已成为海洋渔业科技工作者必须解决的重大课题，也是解决牙 鲆病害问题的根本途径。在海水鱼类遗传育种研究方面，迄今主要在牙鲆、大菱鲆和大黄鱼 上开展了人工雌核发育、单性苗种培育及快速生长良种选育的研究工作（王新成等，1997 ; 王晓清等，2006 ;苏鹏志等，2008 ;陈松林等，2008)，同时，还开展了一些分子标记筛选和遗 传多样性评价、种质鉴定以及抗鳗弧菌病相关MHC基因标记筛选等方面的研究工作，如邹 曙明等（2000)采用RAH)技术对牙鲆和大菱鲆养殖群体遗传结构进行的检测分析；尤峰 等（2001)采用同工酶技术对山东近海牙鲆和养殖牙鲆的遗传多样性进行的分析；Liu等 (2005a，b)利用微卫星标记和AFLP技术评价牙鲆养殖群体和野生群体的遗传结构，表明 养殖群体的遗传多样性具有一定程度的下降；陈微等（2005)开展了牙鲆微卫星标记筛选 和遗传多样性的分子研究；张玉喜等（2006)分析了牙鲆抗鳗弧菌病群体和不抗病群体的 MHC基因多态性，初步筛选到抗鳗弧菌病相关的MHC基因型。尽管黄海水产研究所陈松林等 人已经对牙鲆抗鳗弧菌病群体和家系筛选开展过大量研究，筛选出抗鳗弧菌病群体和家系 (陈松林等，2008)，但这些群体和家系仅仅只是针对鳗弧菌这一单一病原具有一定抗性，因 而还满足不了牙鲆养殖产业中对抗病家系的迫切需求。因此，抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆家 系的选育就显得格外重要，也是牙鲆养殖业中急需攻克的重大课题。而有关牙鲆抗迟钝爱 德华氏菌病家系的构建及优良品系选育技术，迄今国内外尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是建立一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，弥补现有 技术的不足，为鱼类抗迟钝爱德华氏菌病优良品种培育提供技术方法，解决牙鲆养殖业中 缺乏抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法的问题，为鱼类养殖业提供抗病优良品系选育 的技术手段。
[0005] 本发明牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，包括有如下的步骤：
[0006] 1)抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体的筛选：采用自然选择途径或人工感染途径筛 选牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病的群体；
[0007] 2)抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆家系的选育：将培养成熟的牙鲆抗爱德华氏菌病群 体进行不同地理群体杂交来建立牙鲆家系，当不同牙鲆家系鱼苗生长至10-12厘米时，采 用迟钝爱德华氏菌对构建的家系鱼苗进行人工感染，筛选出抗迟钝爱德华氏菌病家系；
[0008] 3)牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记的筛选：通过牙鲆多态性微卫 星标记引物对筛选出的牙鲆抗病家系进行基因分型，筛选出牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系 的特异微卫星标记；
[0009] 4)牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病品系的选育：采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家 系进行交配，建立抗病家系的后代家系，采用特异的微卫星标记对建立的牙鲆家系进行鉴 定，筛选出牙鲆抗病家系的后代家系；然后对获得的后代家系再次进行抗迟钝爱德华氏菌 感染的筛选，将感染后存活率高的家系确定为抗迟钝爱德华氏菌病品系；
[0010] 5)通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：采用筛选到的牙鲆抗病 家系与其它家系进行交配，建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时， 每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜 色的家系鱼苗混合养殖，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，筛选出 抗迟钝爱德华氏菌病品系。
[0011] 6)将获得的抗迟钝爱德华氏菌病品系作为亲本来繁育抗迟钝爱德华氏菌的牙鲆 苗种。
[0012] 作为优选，上述步骤3)中的微卫星标记为scaffold774_63384,其核苷酸序列为 SEQ ID NO:1 ;
[0013] 用于检测微卫星标记scaffold774_63384的引物对，其序列信息如下：
[0014] F:GTGACCCTGAGTAGGATAAGCG(SEQ ID NO:2)
[0015] R:GTGTTTACGTGACAAGCACCAC(SEQ ID N0:3)〇
[0016] 上述微卫星标记，其一种基因型组成包含有187-189bp和175-177bp的2个等位 基因；另一种基因型包含有183-185bp和175-177bp的两个等位基因。
[0017] 步骤4)中对获得的后代家系再次进行抗迟钝爱德华氏菌感染的筛选，另一种方 法如下：通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：采用筛选到的牙鲆抗病家系 与其它家系进行交配，大量建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时， 每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜 色的家系鱼苗混合养殖在同一个水泥池中，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活 鱼的数量，计算不同家系的养殖成活率，将养殖成活率高的家系定义为抗病家系，据此筛选 出抗迟钝爱德华氏菌病品系。
【专利附图】
【附图说明】：
[0018] 图1 :牙鲆抗病家系的筛选，2007年建立的牙鲆家系鱼苗人工感染迟钝爱德华氏 菌后存活率的比较。横坐标是家系号，纵坐标是感染后成活率；
[0019] 图2 :牙鲆抗病家系特异微卫星标记的筛选及其在后代中的遗传
[0020] A:牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记的筛选：采用微卫星标记 scaffold774_63384鉴定不同家系电泳图；图中有5个家系，每个家系8个个体，依次排列 为40个泳道，其中17-24泳道为抗病家系R)768。由图可见该标记在R)768家系个体中均 可扩增出两条DNA条带，其中较小的条带（175-177bp)为该家系不同个体所共有，较大的条 带（187-189bp或183-185bp)在不同的个体中存在两种形式，每个个体的两条DNA条带组 合起来，与其他家系存在明显不同，可用于区分H)768家系与其他牙鲆家系。
[0021] B:牙鲆抗病家系特异微卫星标记在子代中的遗传
[0022] 标记scaffold774_63384在R)768家系个体及其后代家系F1323中的DNA电泳图， M为Marker，1和2为R)768家系中的2个个体，代表2种不同的基因型：AC和BC基因型； 3-9为0768家系的后代F1323家系个体，可见基因型为BC、CC，因此可以推断，建立F1323 家系所用父母本，其中之一为H)768家系个体，在该位点基因型BC，而来自于其他家系的另 一个体基因型为CC，因而子代中有BC、CC两种基因型，每个子代个体的其中一条DNA条带 遗传自F0768家系的鱼（A、B、C三种条带大小分别为187-189bp、183-185bp和175-177bp)
[0023] 图3 :牙鲆抗病家系后代鱼苗人工感染迟钝爱德华氏菌后成活率比较
[0024] 横坐标是家系号，纵坐标是感染后成活率。抗病家系R)768的后代家系F1333、 F1323和F1337在迟钝爱德华氏菌感染后的存活率显著高于其他家系，表现出抗迟钝爱德 华氏菌的能力。
[0025] 图4 :牙鲆抗病家系后代鱼苗在同一水泥池中养殖335-360天后的成活率比较
[0026] 横坐标是家系号，纵坐标是养殖成活率。2012年建立的53个家系鱼苗的养殖存活 率差异显著，其中2007年建立的抗病家系R)768的后代家系F1228和F1263的养殖存活率 分别为82. 8%和74. 4%，明显优于其他家系。
[0027] 图5 :不同家系对迟钝爱德华氏菌感染的反应
[0028] 易感家系在注射迟钝爱德华氏菌后第3天开始出现死亡，第5?6天进入死亡高 峰期，第8天即达到稳定状态；抗病家系在注射后第5天开始出现死亡，第6?8天进入死 亡高峰期，第10天达到稳定状态。易感家系人工感染后，发病早，死亡迅速，发病周期短，死 亡率高。抗病家系表现为发病晚，死亡慢，发病周期较长。两者患病个体症状无差异，抗病 家系的最终存活率明显比易感家系高。
【具体实施方式】
[0029] 本发明通过长期的研究建立了牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，主要 包括如下的步骤：迟钝爱德华氏菌感染牙鲆鱼苗及其抗病力测定方法、抗迟钝爱德华氏菌 病群体筛选方法、抗迟钝爱德华氏菌病家系筛选方法以及抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微 卫星标记筛选方法等，筛选到抗病家系特异微卫星标记；建立了抗病家系后代抗病力和养 殖成活率测试方法，创制了牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系。
[0030] 对于本发明中所用到的术语，解释如下：
[0031] 1、群体：主要指不同地理群体和抗病群体，不同地理群体指中国黄渤海野生群体、 日本牙鲆群体、韩国牙鲆群体等；抗病群体指在迟钝爱德华氏菌病发病后自然存活的牙鲆 鱼苗以及通过人工感染迟钝爱德华氏菌后存活的鱼苗。
[0032] 2、家系：是由1尾雄鱼的精子和1尾雌鱼的卵子授精而获得的鱼苗。
[0033] 3、品系：指经过2代选育后、性状稳定的豕系。
[0034] 下面结合附图，对发明的方法进行详细叙述。
[0035] 1.抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体的筛选：采用自然选择途径或人工感染途径筛 选牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病的群体。具体事例如下：
[0036] 1)迟钝爱德华氏菌的培养及其对牙鲆鱼苗的感染方法：首先用划线法将迟钝爱 德华氏菌接种在TSA培养基平板上，28°C培养24h，挑取单菌落接种于灭菌的TSB液体培养 基中，接种后的培养基放置于震荡培养箱中，在28°C，200r/min的条件下培养约24h，测定 0D600值，培养至菌液浓度达到I. OOD时，即对数生长中期，取出菌液，4°C保存备用。
[0037] 当牙鲆鱼苗生长至10-12厘米时，进行人工感染实验，实验前一天停止投喂饲料， 从每个家系中各随机选取7尾牙鲆个体，平均放到7个浓度梯度的鱼缸中，每个浓度梯度共 32尾。用灭菌的PBS溶液把原菌液稀释到1.00D，测得菌液浓度为4. 33X 109CFU/mL。将 菌液分别按照不稀释、稀释50倍、100倍、500倍、1000倍和10000倍建立6个浓度梯度，另 加一个对照组为灭菌PBS溶液，共7组进行感染，各组分别编号为Al、A2、A3、A4、A5、A6和 A7。按照病原菌感染牙鲆鱼苗的常规腹腔接种法进行迟钝爱德华氏菌的感染。菌液剂量为 0. 2mL/10g体重。感染后观察鱼苗患病情况,记录鱼苗开始死亡时间和死亡鱼苗数量,统计 鱼苗存活率。根据每个浓度梯度的死亡率，结合实际情况，计算出迟钝爱德华氏菌对牙鲆的 半致死浓度 LD50 为 3. 69X 105CFU/mL。
[0038] 人工感染前，将培养好的菌液以8000r/min的转速离心15min，每次离心后倒掉上 清液，并用IX PBS吹洗，连续3次，最后测定0D600的菌液值，将菌液用IX PBS稀释到上步 所得半致死浓度，进行感染。
[0039] 在确定了迟钝爱德华氏菌对牙鲆半致死浓度后，从每个家系中随机抽取75尾个 体，按照〇. 2mL/10g体重的剂量腹腔接种感染半致死浓度的菌液，并设置1次重复实验。实 验时水温控制在（19±1)°C，每个家系实验用鱼独立养殖，保持正常的流水和通气。病原菌 感染后每2h观察一次，记录每个家系实验鱼的体色变化、活动力大小、摄食强弱、有无发病 症状和死亡时间等信息，及时捞出死鱼，测量其全长（从吻端到尾鳍末端）、体重，并剪取鳍 条保存，在感染结束时，记录每个家系存活鱼的数目，测量每个个体全长和体重，并剪取少 量鳍条保存。
[0040] 2)抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体的筛选
[0041] 通过2种途径筛选抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体。第一种途径是从牙鲆养殖场发 病的牙鲆鱼苗中选育抗爱德华氏菌病牙鲆群体的方法。每年8-10月份山东等沿海地区水 温较高，病原菌较多，牙鲆鱼苗极易出现各种疾病，特别是迟钝爱德华氏菌等细菌性疾病极 易感染鱼苗引起腹水病，常常导致养殖的牙鲆鱼苗大量死亡，但在一个池塘中总有些抗病 力比较强的鱼苗存活下来。因此，通过调查山东沿海地区多个牙鲆养殖场的牙鲆鱼苗患病 情况，在确认某个养殖池塘的牙鲆鱼苗是因迟钝爱德华氏菌感染后幸存下来的，就将这些 存活下来的鱼苗收集起来，一般应选择那些85-95%以上的鱼苗死亡、而只有约5-15%的 鱼苗存活下来的池塘收集幸存鱼苗进行培养。将这些幸存的抗病鱼苗培育成亲鱼，达到性 成熟，作为牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病群体。抗病群体一般应由至少100尾以上抗病个体组 成。抗病牙鲆群体的养殖和繁殖按照常规方法进行。
[0042] 第二种途径是通过人工感染的途径制备抗病牙鲆群体，按照1中所述方法对全长 9-12厘米的牙鲆普通鱼苗进行迟钝爱德华氏菌感染，从中筛选出抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆 群体。
[0043] 2.抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆家系的选育
[0044] 将培养成熟的牙鲆抗爱德华氏菌病群体与牙鲆不同地理群体进行杂交，建立牙鲆 家系，当不同牙鲆家系鱼苗生长至10-12厘米时，采用迟钝爱德华氏菌对构建的家系鱼苗 进行人工感染，比较不同家系鱼苗感染后的成活率，筛选出抗迟钝爱德华氏菌病家系。
[0045] 本发明中，将培养成熟的牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病群体与不同地理群体（日本群 体和黄渤海野生群体等）进行杂交。将1尾雌鱼的50-100毫升卵和1尾雄鱼的约0. 1-0. 5 毫升精液授精后放在一个30-40立方米的小网箱中孵化，大约36小时候后，收集孵化出膜 前的胚胎放在1个3立方米的圆形水缸内进行育苗，共建立了 40个家系。牙鲆家系的培育 和日常管理按照常规方法进行。
[0046] 当不同家系鱼苗生长至10-12厘米时，采用迟钝爱德华氏菌等病原菌对各个家系 鱼苗进行人工感染。比较不同家系鱼苗感染后的成活率，将感染实验中成活率居前2-4名 的家系的成活率作为确定抗病家系的数值，比如本发明中有3个家系的成活率在70%以 上，所以选择成活率在70%以上的家系为抗病家系，而将成活率在30% -70%的家系确定 为比较抗病家系，成活率为30%以下的定为不抗病家系。
[0047] 从建立的牙鲆家系中选取25个家系进行感染，发现不同家系感染后的存活率显 著不同。筛选出感染后成活率在70%以上的家系4个，将其确定为抗病家系，其中存活率最 高的家系其存活率为86. 7% (0768号家系），其次家系感染后存活率为83% (0779家系）， 这2个抗病家系的存活率显著高于所有家系感染后的平均存活率50.4% (p〈0. 05);筛选出 比较抗病的家系12个，其感染后存活率为30-70% ;筛选出不抗病家系9个，其中0729和 0747号家系的感染后存活率均为0,为最不抗病家系（表1和图1)。
[0048] 表1 :不同牙鲆家系病原菌感染后的存活率
[0049]
【权利要求】
1. 一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系选育方法，其特征在于，所述的方法包括有 如下的步骤： 1) 抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆群体的筛选：采用自然选择途径或人工感染途径筛选牙 鲆抗迟钝爱德华氏菌病的群体； 2) 抗迟钝爱德华氏菌病牙鲆家系的选育：将培养成熟的牙鲆抗爱德华氏菌病群体进 行不同地理群体杂交来建立牙鲆家系，当不同牙鲆家系鱼苗生长至10-12厘米时，采用迟 钝爱德华氏菌对构建的家系鱼苗进行人工感染，筛选出抗迟钝爱德华氏菌病家系； 3) 牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记的筛选：通过牙鲆多态性微卫星标 记引物对筛选出的牙鲆抗病家系进行基因分型，筛选出牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病家系的特 异微卫星标记； 4) 牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病品系的选育：采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进 行交配，建立抗病家系的后代家系，采用特异的微卫星标记对建立的牙鲆家系进行鉴定，筛 选出牙鲆抗病家系的后代家系；然后对获得的后代家系再次进行抗迟钝爱德华氏菌感染的 筛选，将感染后存活率高的家系确定为抗迟钝爱德华氏菌病品系； 5) 通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：采用筛选到的牙鲆抗病家系 与其它家系进行交配，建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时，每个 家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的 家系鱼苗混合养殖，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，筛选出抗迟 钝爱德华氏菌病品系； 6) 将获得的抗迟钝爱德华氏菌病品系作为亲本来繁育抗迟钝爱德华氏菌的牙鲆苗种。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的微卫星标记为 scaffold774_63384,其核苷酸序列为 SEQ ID NO:l。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微卫星标记的检测引物的序列为SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微卫星标记的一种基因型组成包含 有187-189bp和175-177bp的两个等位基因。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微卫星标记的一种基因型包含有 183-185bp和175-177bp的两个等位基因。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中筛选出牙鲆抗病家系的后 代家系，是用人工感染迟钝爱德华氏菌方式筛选的。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中对获得的后代家系再次进 行抗迟钝爱德华氏菌感染的筛选，其筛选方法如下：通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选 抗病优良品系：采用筛选到的牙鲆抗病家系与其它家系进行交配，大量建立抗病家系的后 代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时，每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每 个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的家系鱼苗混合养殖在同一个水泥池中，混 合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，计算不同家系的养殖成活率，将养 殖成活率高的家系定义为抗病家系，据此筛选出抗迟钝爱德华氏菌病品系。
【文档编号】A01K61/00GK104304096SQ201410422481
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】陈松林, 张英平, 刘洋, 孙何军, 田永胜, 王磊, 范彩霞, 高峰涛, 沙珍霞, 王娜 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所