水稻OsSRFP1基因的抗冷性基因工程应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻OsSRFP1基因的抗冷性基因工程应用。cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示的E3泛素连接酶基因OsSRFP1的抗冷性基因工程应用，抑制所述的E3泛素连接酶基因OsSRFP1的表达，能够提高水稻的抗冷性，利于水稻抗逆性遗传改良。
【专利说明】水稻OsSRFPI基因的抗冷性基因工程应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水稻OsSRFPl基因的抗冷性基因工程应用，属于基因工程领域。 技术背景
[0002] 蛋白质的泛素化修饰在细胞生命活动过程中发挥了至关重要的作用，已经发现在 植物中参与了植物的生长发育以及生物胁迫与非生物胁迫的响应（Smalle et al.，2004; Vierstra，2009)。三种关键酶共同介导了蛋白质的泛素化过程，包括泛素活化酶E1，泛素结 合酶E2和泛素连接酶E3。E3泛素连接酶可使其对特定的蛋白质进行修饰，因此E3是在底 物蛋白的特异性选择修饰过程中作用最为关键（Mazzucotelli et al.，2006)。E3泛素连 接酶是一个种类繁多的蛋白大家族，水稻中存在数百个不同类型的E3泛素连接酶基因，在 水稻的生命过程中发挥了重要而广泛的调控功能。Song等（Song et al.，2007)克隆和鉴 定了一个控制水稻谷粒宽度及重量的主效QTL基因-GW2, GW2编码一个RING泛素连接酶， gw2突变体增加了细胞数量，导致形成较大的小穗外壳，加速了谷物奶状营养物填充率，形 成增大的谷粒宽度、重量及产量。GW2可能通过降解靶蛋白来负调控细胞分裂。相似的控制 水稻谷粒宽度及重量主效QTL基因 qSW5/GW5,可能在种子发育过程中通过调节细胞分裂参 与泛素-蛋白酶体降解途径（Shomura et al.，2008 ;Weng et al.，2008)。OsDSGl 为 RING 泛素连接酶，酵母双杂交检测证实OsDSGl与0sABI3互作，缺失OsDSGl的T-DNA突变体种 子延迟萌发，表明OsDSGl为ΑΒΑ在种子萌发的主要调节因子（Park et al.，2010)。OsBBIl 编码一个RING泛素连接酶，通过改变细胞壁的厚度和次生代谢物来调控对稻瘟病菌的抗 性（Li et al·，2011)。Park 等（Park et al·，2012)证实稻癌病菌通过 AvrPiz-t 抑制水稻 RING泛素连接酶APIP6介导的针对病原体的免疫防卫反应。蛋白互作检测表明AvrPiz-t 抑制APIP6的泛素连接酶活性，而APIP6能泛素化AvrPiz-t。在抗白叶枯病研究中，Wang 等（Wang et al.，2006)分离和鉴定了水稻抗白叶枯病基因 Xa21产物的互作蛋白XB3。XB3 编码一个450个氨基酸、含有RING锌指结构域的泛素连接酶，作为XA21的蛋白激酶底物。
[0003] 在响应非生物胁迫应答中，也发现了一些E3泛素连接酶调控植物的逆境响应。 OsDISl编码一个RING泛素连接酶，OsDISl表达受干旱上调，超表达OsDISl的转基因水稻 植株减少了干旱耐性，而RNA沉默OsDISl的转基因植株增加了干旱耐性。OsDISl可能通过 转录调节逆境相关基因及蛋白泛素化修饰负调控水稻干旱耐性。OsSDIRl为一个RING泛素 连接酶（Gao et al.，2011)，OsSDIRl表达受干旱和盐诱导，包含OsSDIRl的转基因水稻植 株比对照植株表现更强的干旱耐性。与此相似，包含超表达RING泛素连接酶基因 OsRDCPl 和OsCTRl的转基因水稻植株增加了干旱耐性（Bae et al.，2011;Lim et al.，2014)，而过 表达OsHCll的转基因植株增强了高温耐性（Lim et al.，2013)。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于公开水稻RING环型E3泛素连接酶基因 OsSRFPl基因的抗冷性 基因工程应用，抑制表达该基因可以提高植物的抗冷性，利于水稻抗逆性遗传改良。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0006] cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示的E3泛素连接酶基因 OsSRFPl的抗冷性基因工程 应用，其特征在于抑制所述的E3泛素连接酶基因 OsSRFPl的表达，能够提高水稻的抗冷性。
[0007] 本发明所述的应用，优选将针对E3泛素连接酶基因 OsSRFPl的RNAi载体导入水 稻，能够提高水稻的抗冷性。
[0008] 所述的针对E3泛素连接酶基因 OsSRFPl的RNAi载体通过以下方法构 建：选取了 OsSRFPl基因中位于SEQ ID NO. 1的第518到730位，长度为213bp 的特异核苷酸序列作为干涉载体插入区段，以质粒pMD18T-〇sSRFPl的DNA为 摸板利用引物 RNAi-ZFIPlFl:GGATCCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID N0.8)、 RNAi-ZFIPIRl:GGTACCAGCAGGGAGCACCGGGGCA(SEQ ID Ν0·9)通过 BamH I 和Κρη I酶切位点将该序列反向插入PTCK303植物干涉表达载体，同时利用引 物 RNAi-ZFIPlF2:GAGCTCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID N0.10)、RNAi-ZFIPlR2: ACTAGTAGCAGGGAGCACCGGGGCA(SEQ ID NO. 11)以质粒 pMD18T-〇sSRFPl 的 DNA 为摸板通过 Sac I和Spe I酶切位点将该序列正向插入pTCK303植物干涉表达载体，从而获得该基因 的干涉表达载体。
[0009] 有益效果
[0010] 1、本发明公开了一种抑制表达水稻OsSRFPl基因的抗冷性基因工程应用。该基因 来自水稻（Oryza sativa L.)，抑制表达该基因可以提高水稻的抗冷性，利于水稻抗逆性遗 传改良。
[0011] 2、本发明人提供的OsSRFPl基因功能是参与植物的抗冷应答反应，定量反转录聚 合酶链式反应（Real-time RT-PCR)分析表明OsSRFPl基因在高盐（100mM NaCl)、冷（4°C )、 氧化胁迫（100mM H202)和脱落酸（ΑΒΑ)诱导条件下表达增强。
[0012] 3、利用本发明OsSRFPl基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种 启动子例如花椰菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子、Actin启动子或其它 启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了降低 OsSRFPl基因的表达量，可以采用RNA干涉、microRNA定向调控或者TALEN技术、CRISPR技 术降低或者阻断OsSRFPl基因的表达，从而达到提高水稻抗逆性的功能。为了简化转化细 胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，对除草剂具有抗性的酶，也可利用颜 色变化（例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光（例如荧光素酶）来识别的化合物的酶类， 也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法 可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图lpCAMBIA1304-0sSRFPl转基因载体的构建
[0014] A.载体pCAMBIA1304示意图；B. 1:通过Nco I和BstP I双酶切重组质粒 pCAMBIA1304-0sSRFPl 的琼脂糖电泳图，M:DNA marker DL2000 plus.
[0015] 图2重组质粒pTCK303-0sSRFPl的构建
[0016] A.载体pTCK303-0sSRFPl示意图；B.重组质粒pTCK303-0sSRFPl双酶切的琼脂 糖电泳图，1:通过BamH I和Κρη I双酶切重组质粒pTCK303-0sSRFPl的琼脂糖电泳图， 2:通过Sac I和Spe I双酶切重组质粒pTCK303-0sSRFPl的琼脂糖电泳图，M:DNA marker DL2000 plus.
[0017] 图30sSRFPl过量及干涉抑制表达转基因水稻植株的鉴定
[0018] (A) qRT-PCR 鉴定 OsSRFPl 过表达转基因株系。（B) qRT-PCR 鉴定 OsSRFPl-RNAi 干 涉抑制转基因株系。横轴是株系名，纵轴是表达量。
[0019] 图4、抑制表达水稻OsSRFPl基因提高转基因水稻的耐冷性。
[0020] (A)4叶期阳性OsSRFPl过表达、RNAi干涉抑制表达转基因水稻植株和对照植株 (WT)4°C冷处理表型图，经室温恢复后存活率显著优于对照组的株系即为耐冷性增强的水 稻转基因株系。（B)4°C冷处理后转基因株系和野生型株系的存活率统计。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1
[0022] 选用水稻品种"中花11"，待水稻幼苗长至3叶期后，用4°C进行处理，6小时后 立即取叶片置于液氮中冷冻保存，取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP 管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1. 5mL EP管中，抽提总RNA，用甲醛 变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模 板，按照美国Promega公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cDNA第一 链。设计两端引物：上游引物：F1 :ATGGAGCTCGACGACGCG(SEQ ID N0. 2);下游引物：R1 : TTAAGCAGGGAGCACCGG (SEQ ID NO. 3)，采用 RT-PCR 方法进行 cDNA 克隆。PCR 扩增使用 Primestar HS DNA 聚合酶（Takara, Dalian, China)。PCR 程序如下：98°C预变性 5 分钟， 98°C变性5s，58°C复性10s，72°C延伸50s，30个循环后，72°C 10min，将PCR产物加入普通 Tag酶30min，克隆至pMD18-T载体，获得质粒pMD18T-〇sSRFPl，测序后获得具有完整编码 区的水稻E3泛素连接酶基因 OsSRFPl的cDNA序列SEQ ID N0. 1。
[0023] OsSRFPl的0RF全长783bp，BioXM软件分析表明OsSRFPl共编码260个氨基酸， 使用BioXM软件（版本2. 6)估算其等电点pi = 6. 87,分子量MW = 29. 86KDa。以OsSRFPl 搜索GenBank中现有水稻基因组（包括粳稻和籼稻）数据库，发现OsSRFPl为单拷贝基因。
[0024] 实施例2
[0025] 设计引物（上游引物：F2 :AGATGCTGAAGCACGACAAGTTC(SEQ ID N0. 4)，下游引物： R2 :AGTCGTTGCACACGATCCATCC (SEQ ID NO. 5))，进行实时定量 RT-PCR 分析 OsSRFPl 基因在 水稻幼苗中的表达，以水稻actin基因 Racl(McElroy et al，1990)的表达为内参，结果表 明，OsSRFPl基因的表达在4°C处理6h后显著增强，其表达量约为对照的8倍；OsSRFPl基 因的表达在100mM NaCl处理6h后显著增强，其表达量约为对照的4倍；OsSRFPl基因的表 达在100mM H202处理lh后即表达量增加，6h时表达量达到最高，其表达量约为对照的10 倍；在脱落酸ΑΒΑ处理条件下，OsSRFPl基因的表达在lh处理后即表达量增加，12h时表达 量达到最高，其表达量约为对照的8倍。本发明的水稻OsSRFPl基因为水稻中的首次报道， 有望应用于植物尤其是单子叶植物的抗冷性遗传改良。
[0026] 实施例3
[0027] 根据水稻OsSRFPl基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并 在上游引物上引入Nco I限制性内切酶位点，下游引物引入了 BstP I限制性内切酶 位点：上游引物：0sSRFP10E-F :CCATGGAGCTCGACGACGCGTCTC(SEQ ID NO. 6)，下游引物： 0sSRFP10E-R :GGTGACCTTAAGCAGGGAGCACCG(SEQ ID NO. 7)，以实施例 1 中获得的 PCR扩增产 物为模板，经PCR扩增后，将OsSRFPl的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，通过Nco I和BstP I酶切位点进一步克隆到植物双元表达载体pCambial304 (图1)，获得OsSRFPl基因过表达 载体 pCAMBIA1304-0sSRFPl。
[0028] 同时利用在线RNAi革巴定位点预测软件（http://bioinfo· clontech. com/ rnaidesigner ；http://www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. htmL), 选取 了 OsSRFPl基因中位于SEQ ID NO. 1的自5'端起第518bp到730bp长度为213bp的 特异核苷酸序列作为干涉载体插入区段，以质粒pMD18T-〇sSRFPl的DNA为模板，利 用引物 RNAi-ZFIPlFl:GGATCCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID N0.8)、RNAi-ZFIPlRl: GGTACCAGCAGGGAGCACCGGGGCA (SEQ ID NO. 9)通过 BamH I 和 Κρη I 酶切位点将该序列 反向插入PTCK303植物干涉表达载体，同时以质粒pMD18T-〇sSRFPl的DNA为模板，利 用引物 RNAi-ZFIPlF2:GAGCTCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID N0.10)、RNAi-ZFIPlR2: ACTAGTAGCAGGGAGCACCGGGGCA(SEQ IDNO. 11)通过 Sac I 和 Spe I 酶切位点将该序列正 向插入PTCK303植物干涉表达载体，从而获得该基因的干涉表达载体pTCK303-0sSRFPl (图 2)。
[0029] 将获得的OsSRFPl过表达和RNAi干涉抑制表达载体转入农杆菌，进一步转入水 稻，对获得的转基因植株进行PCR，以及RT-PCR验证：
[0030] 取转基因水稻叶片，提取总RNA反转成cDNA。用OsSRFPl基因 qRT-PCR特异引 物 F3:AGATGCTGAAGCACGACAAGTTC(SEQ ID N0.12)、R3:AGTCGTTGCACACGATCCATCC(SEQ ID N0·13)及内参18srRNA基因引物18srRNA-F:ATGGTGGTGACGGGTGAC(SEQIDN0·14)、18sr RNA-R:AGTCGTTGCACACGATCCATCC(SEQ ID NO. 15)对转基因株系进行 qRT-PCR 验证（图 3)。
[0031] 经RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株的T3代和对照植株进行耐 冷性分析：取转基因水稻种子和野生型种子，30°C浸种直至露白，然后将发芽一致的18粒 种子分别播于蛭石与营养土 2:1的混合基质中，培养4周后，置于4°C光照培养箱中处理， 当表型出现明显差异时，室温恢复5d，统计存活率，电解质渗透率。转基因植株和野生型水 稻幼苗的低温处理结果显示，35S:0sSRFPl转基因水稻植株（即转pCAMBIA1304-0sSRFPl 载体的转基因植株）相对于WT对低温更敏感，而35S:0sSRFPl-RNAi转基因株系（即转 pTCK303-0sSRFPl载体的转基因植株）更抗低温（图4)。存活率统计显示，冷处理3天恢 复后，相对于75%的野生型存活率，只有16%的35S:0sSRFPl转基因水稻植株植株可以存 活；而冷处理7天恢复后，相对于20%的野生型存活率，85%的OsSRFPl-RNAi植株能快速 恢复正常生长（图4)。随着冷胁迫处理的进行，分别取处理0h、5h、24h的样进行电解质渗 透率的测定，结果显示过表达株系的电解质渗透率明显大于野生型，而干涉抑制表达株系 的电解质渗透率明显小于野生型（图4)，说明水稻植株在冷胁迫处理时，干涉抑制OsSRFPl 表达能更好的保持细胞膜的完整性，增强植株的抗性。以上结果表明OsSRFPl负调控水稻 中冷响应过程。
[0032] 上述实施例表明本发明中克隆的水稻E3泛素连接酶基因 OsSRFPl，为水稻中首次 克隆的E3泛素连接酶基因。实施例2表明该基因与水稻的非生物胁迫密切相关。实施例 3表明抑制表达该基因后能够提高转基因水稻的抗冷性，可以通过RNAi，microRNA调控、 TALEN或CRISPR等技术培养抑制或阻断表达OsSRFPl基因的水稻转基因植株，进行水稻的 抗冷性遗传改良。
【权利要求】
1. cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示的E3泛素连接酶基因 OsSRFPl的抗冷性基因工程应 用，其特征在于抑制所述的E3泛素连接酶基因 OsSRFPl的表达，能够提高水稻的抗冷性。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于将针对E3泛素连接酶基因 OsSRFPl的RNAi 载体导入水稻，抑制所述的E3泛素连接酶基因 OsSRFPl的表达，能够提高水稻的抗冷性。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的针对E3泛素连接酶基因 OsSRFPl 的RNAi载体通过以下方法构建：选取了 OsSRFPl基因中位于SEQ ID NO. 1的第518到730 位，长度为213bp的特异核苷酸序列作为干涉载体插入区段，以质粒pMD18T-〇sSRFPl的DNA 为模板，利用引物 RNAi-ZFIPIFl :SEQ ID NO. 8、RNAi-ZFIPIRl :SEQ ID NO. 9 进行 PCR 扩 增，通过BamH I和Κρη I酶切位点将扩增的目的片段反向插入pTCK303植物干涉表达载 体；同时以质粒 pMD18T-〇sSRFPl 的 DNA 为模板，利用引物 RNAi-ZFIPlF2 :SEQ ID NO. 10、 RNAi-ZFIPlR2 :SEQ ID NO. 11进行PCR扩增，通过Sac I和Spe I酶切位点将扩增的目 的片段正向插入PTCK303植物干涉表达载体，从而获得该基因的干涉表达载体。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的质粒pMD18T-〇sSRFPl通过以下方法 获得： 1) 选用水稻品种"中花11"，待水稻幼苗长至3叶期后，用4°C进行处理，5?8小时后 立即取叶片抽提总RNA，以获得的总RNA为模板，按照美国Promega公司提供的反转录试剂 盒的说明书进行反转录，合成cDNA第一链； 2) 以上一步合成的cDNA第一链为模板，以引物F1:SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 2和引 物F2 :SEQ ID NO. 3通过PCR扩增获得E3泛素连接酶基因 OsSRFPlI的cDNA，将其克隆至 PMD18-T 载体，获得质粒 pMD18T-〇sSRFPl。
【文档编号】A01H5/00GK104195168SQ201410444392
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月2日 优先权日:2014年9月2日
【发明者】黄骥, 张红生, 方慧敏, 唐海娟, 鲍永美, 王州飞 申请人:南京农业大学