一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养等步骤，本发明方法所制备的云南栘依悬浮细胞克服了生境的局限，生长分裂速度快，操作可控，有助于获得大量的药用代谢产物。
【专利说明】一种南栘依悬淳细胞培养的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及云南栘依悬浮细胞培养的快繁方法，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 云南栘依，又称：西南栘棍，桃姨（云南土名），ofe/araja· (Franch.) Schneid.，蔷薇科，常绿乔木，高5?10米，小枝粗壮，幼时有黄白色绒毛，渐脱落，红褐色或 紫褐色。叶片披针形或卵状披针形，长5?8厘米，宽2?3厘米，先端急尖或渐尖，基部阔 楔形或近圆形，全缘或稍有浅钝锯齿，下面密生黄白色绒毛；叶柄长约1厘米，密生绒毛。花 3?5朵丛生于小枝顶端；花梗短粗或近于无梗，果期伸长，密生绒毛；花白色，直径2. 5? 8厘米；萼筒钟状，外面密生黄白色绒毛。梨果较大，卵形或矩圆形，直径2?3厘米，萼裂 片宿存；果柄较长。产云南、四川、贵州。生山谷、溪旁、灌或路旁杂木林中，海拔1000-3000 米。在云南腾冲一带极为常见，当地人经常当山楂来食用，作为健胃消食和行气散淤之用， 目前，国内对此研究和报道很少，悬浮细胞具有操作简单可控，生产成本低，繁殖率高等优 点。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种云南栘依悬浮细胞的快速繁殖方法，由该 方法所制备得到的云南栘依悬浮细胞生长分裂速度快，操作可控，有助于获得大量的药用 代谢产物，克服生境的局限。
[0004] 本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的： 取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗 lOmin，超净工作台上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同时均匀摇动，无菌水冲洗6-7遍，吸水 纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入B5+KIU 4mg/L+6-BA0· 5mg/L+IBA0. 2mg/L+3%蔗 糖+0. 65%琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度8001x，光期7h，暗期17h，诱导出来的 嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B 5+L 5mg/L2,4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋白 +lmol/L蔗糖进行悬浮细胞的培养，pH5. 6,光照30001x，温度25°C，接种量为40%，振荡速度 为llOr/min，培养10天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15天继 代1次。
[0005] 采用本发明制备的云南栘依悬浮细胞生长分裂速度快，操作可控，有助于获得大 量的药用次生代谢产物，克服生境的局限。
[0006] 下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不 局限于下列实施方式。
【具体实施方式】 [0007] 实施例1 取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗 lOmin，超净工作台上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同时均匀摇动，无菌水冲洗6-7遍，吸水 纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入Β5+ΚΤ0· 3mg/L+6-BA0. 5mg/L+IBA0. 2mg/L+3%蔗 糖+0. 65%琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度8001x，光期7h，暗期17h，诱导出来的 嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B 5+L 5mg/L2,4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋白 +lmol/L蔗糖进行悬浮细胞的培养，pH5. 6,光照30001x，温度25°C，接种量为40%，振荡速度 为llOr/min，培养10天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15天继 代1次。
[0008] 实施例2 取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗 lOmin，超净工作台上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同时均匀摇动，无菌水冲洗6-7遍，吸水 纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入Β5+ΚΤ0· 5mg/L+6-BAl. Omg/L+IBAO. 25mg/L+3% 蔗糖+0. 65%琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度8001x，光期7h，暗期17h，诱导出来 的嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B 5+L 5mg/L2,4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋 白+lmol/L蔗糖进行悬浮细胞的培养，pH5. 6,光照30001x，温度25°C，接种量为40%，振荡 速度为ll〇r/min，培养10天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15 天继代1次。
[0009] 实施例3 取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗 lOmin，超净工作台上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同时均匀摇动，无菌水冲洗6-7遍，吸水 纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入Β5+ΚΤ0· 4mg/L+6-BAl. Omg/L+IBAO. 25mg/L+3% 蔗糖+0. 65%琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度8001x，光期7h，暗期17h，诱导出来 的嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B 5+L 5mg/L2,4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋 白+lmol/L蔗糖进行悬浮细胞的培养，pH5. 6,光照30001x，温度25°C，接种量为40%，振荡 速度为ll〇r/min，培养10天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15 天继代1次。
【权利要求】
1. 一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱 导、悬浮细胞的培养，其主要步骤如下： (1) 采取云南栘依幼嫩的叶片，在超净工作台上对其进行消毒处理； (2) 取步骤（1)消毒处理过的叶片接种入B5+KIU 3-0. 5mg/L+6-BA0. 5-L Omg/ L+IBAO. 2-0. 25mg/L+3%蔗糖+0. 65%琼脂培养基中进行愈伤组织诱导，光照强度8001x，光 期7h，暗期17h; (3) 取步骤（2)中诱导出来的嫩绿松散的云南栘依愈伤组织接入B5+1.5mg/L2， 4-D+lmol/L蛋白胨+100mg/L水解酪蛋白+lmol/L鹿糖进行悬浮细胞的培养，ρΗ5· 6,光照 30001χ，温度 25°C ; 按照权利要求1所述的一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于：步 骤（1)中所述云南栘依无菌叶片的获得为，取云南栘依幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2min， 毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗lOmin，超净工作台上0. 1%氯化汞溶液消毒llmin，同 时均匀摇动，无菌水冲洗6-7遍，吸水纸吸去表面水分。
2. 按照权利要求1所述的一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于： 步骤（3)中培养基中附加了蛋白胨和水解酪蛋白，可促进悬浮细胞的生长分裂。
3. 按照权利要求1所述的一种云南栘依悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于： 步骤（3)细胞悬浮培养的方法为接种量为40%，振荡速度为110r/min，培养10天后用80目 的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，15天继代1次。
【文档编号】A01H4/00GK104206276SQ201410463173
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司