一种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了蝗虫的ATP合成酶酶β亚基cDNA的保守序列，并构建其RNA、DNA等构建体，利用RNAi技术沉默蝗虫体内ATP合酶β亚基，使体内ATP合酶β亚基的表达明显受到抑制，导致蝗虫产生致死效应，可应用于RNAi技术对东亚飞蝗害虫防治。
【专利说明】-种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA在害虫防治 中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种ATP合酶β亚基基因、dsRNA及其在东 亚飞蝗防治中的应用。
【背景技术】
[0002] 害虫严重危害农业生产，由于长期施用有机氯、有机磷等化学杀虫剂，导致一系列 问题：农药残留导致环境污染严重；有毒农药危害人类身体健康；昆虫出现抗药性，防治成 本提1?等。目如已有将生物杀虫剂应用于害虫防治，但杀虫时间较长，杀虫效果不稳定，因 此迫切需要新型的害虫防治方法。
[0003] RNA干扰（RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象， 于2006年获得诺贝尔奖。这一发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破，同时也为 人类的疾病治疗和害虫防治开辟了新的途径。2008年，Price和Gatehouse总结了众多实 验结果后，提出来基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势： 1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和人类是安全的；2)对害虫具有专一性， 对非靶标生物无杀伤作用；对环境无毒无害。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种核酸分子，可以编码东亚飞蝗ATP合成酶β亚基的基 因，并作为药物靶点，使蝗虫致死。
[0005] 本发明的目的是通过以下措施实现的：
[0006] -种核酸分子，其特征在于：序列为SEQ ID NO. 1及其互补序列。
[0007] 优选地，上述核酸分子中，SEQ ID NO. 2序列及其互补序列可以作为有效的药物靶 点，干扰基因的转录表达。
[0008] 本发明的另一目的在于针对上述核酸分子，提供有效干扰其转录表达的 dsRNA(双链核糖核酸）。
[0009] RNA构建体，其包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与上述任一核酸分子 互补的核苷酸序列。
[0010] 上述RNA构建体，其中所述至少一个双链RNA区至少具有17bp。
[0011] 优选地，RNA构建体，其序列为SEQ ID NO. 3或其互补序列。
[0012] DNA构建体，包含了上述核酸分子，或者包含编码上述RNA构建体的区域。
[0013] 表达构建体，包含了上述DNA构建体。
[0014] 宿主细胞，包含上述RNA构建体、DNA构建体或表达构建体。
[0015] 杀虫组合物，包含了上述RNA构建体和/或上述DNA构建体和/或上述表达构建 体和/或上述宿主细胞以及适合的载体。
[0016] 上述任一项RNA构建体和/或DNA构建体和/或表达构建体和/或宿主细胞以及 适合的载体和/或杀虫组合物在防治蝗虫中的应用。
[0017] 有益效果
[0018] 1.本发明获得了蝗虫的ATP合成酶酶β亚基CDNA的保守序列，并构建其RNA、DNA 等构建体沉默了蝗虫体内ATP合酶β亚基，经验证体内ATP合酶β亚基的表达明显受到 抑制，并导致蝗虫产生致死效应，本发明可应用于RNAi技术对东亚飞蝗害虫防治。
[0019] 2.本发明用于防治蝗虫尤其是东亚飞蝗，种属特异性强，不会对其它物种造成干 扰，如蜜蜂、人等；本发明基因特异性强，不会对除ATP合酶或β亚基之外的基因产生干扰 影响。
[0020] 3.本发明防治蝗虫具有高效性，尤其是东亚飞蝗，剂量小（dsRNA用量为IOOng)， 起效快（处理2天左右导致蝗虫致死）。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1五龄飞蝗注射SEQ ID NO : 2合成的dsRNA后的致死情况。
[0022] 图2五龄飞蝗注射序列为SEQ ID NO :3的dsRNA后ATP合酶β亚基基因 (LmATP5B)的不同时间点mRNA表达，RP49做为内参基因。12,24,36h为注射dsRNA后的小 时数。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。
[0024] 实施例1 :飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA的获得
[0025] i、飞蝗ATP合酶β亚基基因的获得
[0026] 1)飞蝗ATP合酶β亚基基因在飞蝗EST数据库的搜索
[0027] 基于飞蝗的EST数据库，采用生物信息学方法对飞蝗ATP合酶β亚基基因进行搜 索，经过序列拼接及比对后，共获得1条飞蝗ATP合酶β亚基基因。
[0028] 2)飞蝗ATP合酶β亚基基因引物的设计
[0029] 基于已获得LmATP5B的碱基序列，设计引物。
[0030] 3)飞蝗总RNA获得
[0031] 选取大小一致雌雄各半飞蝗5龄若虫，3头一组，冷冻于液氮中，待提取RNA，具体 操作步骤参照TRIzol (Invitrogen)说明书。
[0032] 4)第一链cDNA的合成
[0033] 参照Promega M-MLV反转录酶试剂说明书，进行第一链cDNA的合成。
[0034] 5)飞蝗ATP合酶β亚基基因的获得
[0035] 根据Thermo Fusion说明书进行PCR，进一步克隆获得飞蝗ATP合酶β亚基基因 cDNA序列。
[0036] 6)飞蝗ATP合酶β亚基基因碱基序列的分析
[0037] 利用Expasy网站中相关在线软件和GENED0C、基因探索者等软件分析所得序列， 之后在NCBI网站中使用BLAST功能进行序列同源性比对。经序列验证后，获得的ATP合酶 β亚基LmATP5B)序列全长1914bp，开放阅读框1575bp。
[0038] II、飞蝗ATP合酶β亚基基因片段及其dsRNA合成
[0039] 1)飞蝗ATP合酶β亚基基因片段的获得
[0040] 基于本研究所得到飞蝗ATP合酶β亚基基因的序列SEQ ID NO : 1 ; 1，设计dsRNA 引物，引物序列分别为SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5。选取大小一致雌雄各半东亚飞蝗5龄 若虫，三头一组，冻存于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TRIzol (Invitrogen)说明 书。M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此为模板，以SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5为引物进行PCR扩增，获得ATP合酶β亚基基因片段。
[0041] 2)飞蝗ATP合酶β亚基dsRNA的合成
[0042] 胶回收试剂盒纯化基因片段，试剂盒纯化后按照MEGAscript high yield transcription kit (Ambion)说明书合成dsRNA，dsRNA浓度采用紫外分光光度计测定，并 稀释至终浓度为20ng/y 1。所述的dsRNA片段如SEQ ID NO :3所示。
[0043] 实施例2 :飞蝗ATP合酶β亚基dsRNA致死五龄飞蝗
[0044] 1、飞蝗ATP合酶β亚基dsRNA注射
[0045] 选取五龄第三天、大小均一、健康状况一致的若虫用于注射上述合成的dsRNA(SEQ ID NO :3)，25μ 1规格微量注射器用于注射，注射时不可用力过大，顺着血液流动的方向， 侧腹部第2至3腹节的连接处作为注射点，避开气门。注射dsRNA的量为lOOng，并设置 dsGFP (IOOng)的对照组，每组20头虫，3个生物学重复，共计60头。注射完毕后，将试虫用 朔料笼子饲养（光照：黑暗时间为14h :10h，温度30±2°C )，给以新鲜小麦幼苗。
[0046] 2、注射dsRNA后五龄飞蝗表型的观察
[0047] 五龄幼虫经注射dsRNA后，注射dsGFP对照组5天后开始蜕皮并全部成功蜕皮至 成虫，蜕皮至成虫后形态活力正常。注射SEQ ID NO :3的dsRNA的处理组幼虫共60头，第 2天开始死亡，第4天死亡率超过90 %，生测图如图1和表1所示。
[0048] 3、飞蝗ATP合酶β亚基基因 mRNA水平检测
[0049] 对5龄飞蝗若虫dsRNA注射后不同时间点的沉默效率检测，选择注射后12h、24h 和36h的虫体作为RNA提取对象，每组各个时间点设置3个生物学重复。提取各样品的总 RNA并反转录成第一链eDNA，用RT-PCR检测目的基因（LmATP5B)和管家基因（RP49)的表 达量（图2)。
[0050] 经数据分析发现，飞蝗体内注射ATP合酶β亚基双链RNA后，LT5tl为2. 4±0. 4天； mRNA表达量在注射后12小时、24小时和36小时依次降低了 91. 7%，93. 6%和95. 7% (见 表2和图2)。而注射GFP dsRNA的东亚飞蝗体内的ATP合酶β亚基的mRNA没有显著性的 变化，也不引起致死。
[0051] 按照实施例2所述方法将dsRNA (SEQ ID NO :3)分别注射入蜜蜂、蜘蛛体内，未发 现致死现象。
[0052] 表1实施例2中注射dsRNA后体内β亚基相对表达量
[0053]
【权利要求】
1. 一种核酸分子，其特征在于：序列为SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2,或SEQ ID NO. 1 或SEQ ID NO. 2的互补序列。
2. -种RNA构建体，其包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与权利要求1或 2所述任一核酸分子互补的核苷酸序列。
3. 权利要求2的RNA构建体，其中所述至少一个双链RNA区至少为17bp。
4. 权利要求2的RNA构建体，序列为SEQ ID NO. 3或其互补序列。
5. -种DNA构建体，包含了权利要求1或2核酸分子，或者包含编码权利要求3或4 所述RNA构建体的区域。
6. 表达构建体，包含了如权利要求5所述DNA构建体。
7. -种宿主细胞，包含权利要求3或4所述RNA构建体或权利要求5所述DNA构建体 或权利要求6所述表达构建体。
8. -种杀虫组合物，包含了权利要求3或4所述RNA构建体和/或权利要求5所述 DNA构建体和/或权利要求6所述表达构建体和/或权利要求7所述宿主细胞以及适合的 载体。
9. 权利要求3或4所述RNA构建体和/或权利要求5所述DNA构建体和/或权利要 求6所述表达构建体和/或权利要求7所述宿主细胞以及适合的载体和/或权利要求8所 述杀虫组合物在防治蝗虫中的应用。
10. 如权利要求9所述的蝗虫为东亚飞蝗。
【文档编号】A01N57/16GK104404042SQ201410647729
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】夏玉先, 胡军 申请人:重庆大学, 夏玉先