抗真菌组合物的制作方法

本发明涉及抗真菌组合物，并且特别是涉及用于治疗植物和动物中的真菌感染的包含抗真菌活性剂的组合的抗真菌制剂。

背景技术：

线粒体是细胞的动力室，并且因此导致生物体的能量守恒的过程的抑制对其生存能力具有重大影响。因此最成功的一类农业杀真菌剂是一组特异性靶向线粒体呼吸链的特定抑制剂。被称为嗜球果伞素(strobilurin)的抑制剂(其靶向关键性呼吸链组分泛醇的氧化)已经提高了植物中疾病控制的标准。嗜球果伞素抑制真菌呼吸以及因此通过结合于真菌呼吸所必需的复合物III(bc1复合物)的泛醇结合位点的ATP合成。

WO 2013/160670公开了用于抑制微生物交替氧化酶(AOX)和/或细胞色素bc₁复合物的一系列不同的化合物。在WO 2013/160670中公开的化合物之一(即Colletochlorin B)已证实对AOX和细胞色素bc₁复合物具有特别有效的抑制。然而，尽管WO 2013/160670中描述的抗真菌化合物具有功效，但仍然持续需要用于供治疗动物中的真菌感染的农业化学品或抗寄生虫药物中的更有效的抗真菌组合物。

本发明人因此制备了一系列包含若干在WO 2013/160670中描述的化合物与多种不同的杀真菌剂的组合的新型制剂，并测试了所得到的抗真菌活性。他们惊奇地观察到每种组合制剂中的两种化合物之间的协同作用。

技术实现要素：

因此，根据本发明的第一方面，提供包含抗真菌剂和式I化合物的抗真菌组合物：

其中R¹选自具有1至4个C原子的腈基、烷基、烯基、胺、烷氧基、醛、酮、羧酸、酯和酰胺基团，其任选地被F、O、NH₂或CN单取代或多取代，并且其中一个或多个非相邻的CH₂基团任选地在每种情况下彼此独立地被-O-、-NH-、-CO-、-COO-或-OCO-代替；

R²是氢或羟基或具有1至3个C原子的烷氧基基团；

R³是具有4至20个C原子的直链或支链的烷基或亚烷基，其任选地被C₁至C₄烷基基团单取代或多取代；

R⁴是氢或羟基或具有1至3个C原子的烷氧基基团；

R⁵是卤素基团；和

R⁶是H或C₁至C₄烷基基团；

其条件是R²和R⁴中的至少一个是具有1至3个C原子的羟基或烷氧基基团。

所述抗真菌剂可选自由以下组成的抗真菌剂的群组：苯酰胺杀真菌剂家族成员；嗜球果伞素家族成员；去甲基化抑制剂；CuPC33；啶酰菌胺(Boscalid)；苯醚甲环唑(Difenconcozole)；和唑菌胺酯(Pyraclostrobin)。

优选地，所述苯酰胺杀真菌剂家族成员是甲霜灵(Metalaxyl)。因此，在一个优选的实施方案中，所述组合物包含甲霜灵和如本文所限定的化合物(I)。

优选地，所述嗜球果伞素家族成员是嘧菌酯(Azoxystrobin)。因此，在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含嘧菌酯和如本文所限定的化合物(I)。

应理解，所述式I化合物优选地是AOX和/或细胞色素bc₁复合物的抑制剂。当化合物(I)的任何基团是烷基基团时，其可以是C₁、C₂、C₃或C₄烷基，例如甲基、乙基、丙基或丁基基团。任选地，所述烷基基团可被一个或多个杂原子例如氮、氧、硫、磷或卤素取代。

R¹可为选自以下的基团：CHO；CH₂OH；CN；CH₃；C(O)NH₂；C(O)NHCH₃；C(O)CH₃；CF₂CH₃；CH₂CH₃；CH₂OAc；COOH；和COOCH₃。

R²可为短链烷基，例如甲基、乙基或丙基基团。然而，优选地R²是羟基基团。

R³可为具有6至15个C原子、8至12个C原子或8至10个C原子的直链或支链的烷基或亚烷基，其任选地被C₁至C₄烷基基团单取代或多取代。例如，R³可为具有6至15个C原子的支链二烯，其被至少一个并且优选地两个甲基基团取代。

R⁴可为甲基、乙基或丙基基团。然而，优选地R⁴是羟基基团。

R⁵可为氯、溴、氟或碘基团。优选地，R⁵是氯基团。

R⁶可为甲基、乙基或丙基基团。然而，优选地R⁶是甲基基团。

在式I化合物的一个实施方案中：

R¹选自CHO；CH₂OH；CN；CH₃；C(O)NH₂；C(O)NHCH₃；C(O)CH₃；CF₂CH₃；CH₂CH₃；CH₂OAc；COOH；和COOCH₃；并且其中

R²是羟基基团；

R³是具有4至20个C原子的直链或支链的烷基或亚烷基，其任选地被C₁至C₄烷基基团单取代或多取代；

R⁴是羟基基团；

R⁵是氯原子；和

R⁶是H或C₁至C₄烷基基团。

在式I化合物的另一个实施方案中：

R¹选自CHO；CH₂OH；CN；CH₃；C(O)NH₂；C(O)NHCH₃；C(O)CH₃；CF₂CH₃；CH₂CH₃；CH₂OAc；COOH；和COOCH₃；并且其中

R²是羟基基团；

R³是具有6至15个C原子的直链或支链的烷基或亚烷基，其任选地被C₁至C₂烷基基团单取代或多取代；

R⁴是羟基基团；

R⁵是氯原子；和

R⁶是H或C₁至C₄烷基基团。

在式I化合物的一个优选的实施方案中：

R¹选自CHO；CH₂OH；CN；CH₃；C(O)NH₂；C(O)NHCH₃；C(O)CH₃；CF₂CH₃；CH₂CH₃；CH₂OAc；COOH；和COOCH₃；并且其中

R²是羟基基团；

R³是具有8至10个C原子的亚烷基链，并且被至少一个甲基基团、优选地两个甲基基团取代；

R⁴是羟基基团；

R⁵是氯原子；和

R⁶是甲基基团。

优选地，在式I化合物中：

R¹是CHO；

R²是羟基基团；

R³是具有8至10个C原子的亚烷基链，并且被至少一个甲基基团、优选地两个甲基基团取代；

R⁴是羟基基团；

R⁵是氯原子；和

R⁶是甲基基团。应理解，这种式I化合物被称为Colletochlorin B，其在图1中表示。

在一些优选的实施方案中，R¹不是CHO基团。

优选地，所述抗真菌组合物包含0.1-20μM、0.5-15μM或1-10、μM的抗真菌剂。

优选地，所述抗真菌组合物包含0.1-10μM、0.5-5μM或0.8-2、μM的 式I化合物，其最优选地是Colletochlorin B。

包含抗真菌剂和式I化合物的第一方面的抗真菌组合物优选地是农业化学品。

因此，在第二方面，提供包含根据第一方面的抗真菌组合物的农业化学组合物。

在第三方面，提供根据第一方面的抗真菌组合物作为农业化学品的用途。

在第四方面，提供治疗、改善或预防植物中的农业化学疾病或感染的方法，所述方法包括使需要这种治疗的植物与农业化学有效量的抗真菌剂和式I化合物接触。

第三方面的用途或第四方面的方法优选地包括使所述植物与农业化学有效量的第一方面的组合物接触。

可通过第四方面的方法治疗的农业化学疾病可由选自由以下组成的生物体群组的生物体引起：白蜡鞘孢菌(Chalara fraxinea)；小麦壳针孢(Septoria tritici)；小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces gramminis var titici)；稻瘟菌(Magnaporthe grisea)；稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)；水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)；灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)；山核桃黑星病菌(Fusicladium effusum，同义词Cladosporium caryigenum和Fusicladosporium effusum)；美国山核桃(Carya illinoinensis)；白粉病菌(Podosphaera fusca)；雪霉微座孢(Microdochium nivale)；大型微座孢(Microdochium majus)；小麦颖枯病菌(Septoria nodoum)；塔普斯梭状芽胞杆菌(Tapesia acuformis)；香蕉黑条叶斑病菌(Mycosphaerella fijiensis)；和绿僵菌(Metarhizium anisopliae)。

应理解，本文中提及的每种微生物都会具有AOX。

应理解，小麦壳针孢和小麦全蚀病菌是小麦病原体(全蚀病)；稻瘟菌和稻瘟病菌可能引起稻瘟病和黑麦草灰斑；水稻纹枯病菌可能引起马铃薯黑皮屑，灰葡萄孢菌可能引起灰霉病(影响许多植物物种的死体真菌，但其最显著的宿主是酿酒葡萄)；山核桃黑星病菌(同义词Cladosporium caryigenum和Fusicladosporium effusum)被称为山核桃疮痂病并且是商业山 核桃的最具破坏性的疾病；美国山核桃涉及美国东南部的产量；白粉病菌是西班牙葫芦白粉病的主要致病因子并且是全球葫芦产量的最重要限制因素之一；雪霉微座孢和大型微座孢可能侵蚀大麦、硬粒小麦和软粒小麦并且存在于法国所有地区；小麦颖枯病菌可能引起叶颖斑点；并且塔普斯梭状芽胞杆菌可能引起眼斑病。香蕉黑条叶斑病菌引起香蕉真菌病香蕉叶斑病(Black Sigatoka)(黑色条斑病)。此外，对于作为害虫管理替代物的昆虫病原真菌的绿僵菌的农业化学关注增长。

应理解，白蜡鞘孢菌引起白蜡树灰枯梢病。

第二方面的农业化学组合物可包含将抗真菌剂和式I化合物混合在其中一种或多种溶剂。所述组合物中的溶剂量可在1％至99％、或30％至80％范围内。合适的溶剂包括例如非极性水不混溶性溶剂，或极性非质子性水混溶性有机溶剂。非极性溶剂包括例如被取代或未被取代的脂族或芳族烃和植物油酯或其混合物。芳族烃的非限制性实例包括苯或被取代的苯衍生物，例如甲苯、二甲苯、1,2,4-三甲基苯、萘或其混合物。在一个实施方案中，溶剂包括萘和1,2,4-三甲基苯的混合物。在另一个实施方案中，溶剂是Aromatic 150，即含有<10％萘和<1.7％1,2,4-三甲基苯的重芳烃石脑油溶剂。

烷基酯也可以用作非极性水不混溶性溶剂。植物油可用各种醇酯化以形成植物油的烷基酯。这些植物油的脂肪酸具有5至20个、或6至15个碳原子。植物油的烷基酯包括(但不限于)芥花(甘蓝型油菜(B.napus))、亚麻籽、红花(Carthamus tinctorius L)、大豆和向日葵油的甲酯、乙酯和丁酯。在一个实施方案中，所述溶剂是甲酯的混合物。甲酯的特定非限制性实例是由Stepan公司(22W.Frontage Road,Northfield,Illinois)制造的Agent2416-21。

水混溶性极性非质子性溶剂可包括例如乳酸烷酯、乳酸异丙酯、碳酸烷酯、聚乙二醇、聚乙二醇烷基醚、聚丙二醇和聚丙二醇烷基醚，或其混合物。

第二方面的农业化学组合物可包含一种或多种佐剂。佐剂例如可增强或改进除草性能。佐剂可在配制时添加至组合物，或在处理之前通过施用 器添加至混合物。佐剂包括例如表面活性剂(乳化剂)、作物油、肥料、分散剂、相容剂、发泡活化剂、泡沫抑制剂、矫味剂和喷雾着色剂(染料)。佐剂可以任何所需的量存在。例如，制剂可含有1％至3％佐剂、3％至8％佐剂、8％至16％佐剂、17％至30％佐剂、或30％或(例如40％或更多)更多佐剂。

所述农业化学组合物可包含一种或多种表面活性剂。表面活性剂可增加抗真菌剂和式I化合物在溶液中的溶解性。表面活性剂还可能影响喷雾保留、液滴散布和干燥速率。表面活性剂可为阴离子型或非离子型。阴离子型表面活性剂的实例包括具有14至22个碳原子的长链醇的磷酸单酯和二酯以及其盐；具有14至22个碳原子的长链醇的氧化烯加成产物的磷酸单酯和二酯以及其盐；具有14至22个碳原子的硫酸烷基酯；具有14至22个碳原子的醇的聚氧乙烯烷基醚硫酸酯；具有14至22个碳原子的烷烃磺酸盐；和具有14至22个碳原子的烯烃磺酸盐。

合适的非离子型表面活性剂包括例如乙氧基化脂肪酸、醇乙氧基化物、三苯乙烯基苯酚乙氧基化物、乙氧基化脱水山梨醇酯脂肪酸酯或其混合物。乙氧基化脂肪酸包括具有至少25个、优选地27至37个乙氧基单元的蓖麻油或芥花油乙氧基化物，例如Uniqema(原ICI Surfactants)的Sunaptol RTM CA350(具有35个乙氧基单元的蓖麻油乙氧基化物)、Henkel KGaA的Mergital RTM EL33(具有33个乙氧基单元的蓖麻油乙氧基化物)、Henkel KGaA的Eumulgin RTM C03373(具有30个乙氧基单元的芥花油乙氧基化物)和Uniqema的Ukanil RTM 2507(蓖麻油乙氧基化物)。

表面活性剂可以任何所需的量存在。例如，表面活性剂可以约0.1重量％至约30重量％的量存在于制剂中。在一个特定实施方案中，表面活性剂以约1重量％至约9重量％的量存在于制剂中。在另一个实施方案中，表面活性剂以约10重量％至约20重量％的量存在于制剂中。

所述农业化学组合物可包含一种或多种乳化剂。乳化剂是通常用于保持乳液良好分散的一类表面活性剂。乳化剂的非限制性实例包括Agent2201-76、Agent 2416-20、Emulpon CO-360、T-Det C-40(R)和Agnique(TM) SBO-IO。Agent 2201-76是由Stepan公司(22W.Frontage Road,Northfield,Illinois)制造的，它是非离子型和阴离子型表面活性剂(82％)的共混物。Agent2201-76中的成分是烷基苯磺酸盐和脂肪酸乙氧基化物、芳族石油烃、1-己醇和萘。Agent 2416-20也是由Stepan公司(22W.Frontage Road,Northfield,Illinois)制造的，它是非离子型和阴离子型表面活性剂(35-37％)的共混物。Agent 2416-20也包括芳族石油烃(57-58％)和萘(6-7％)。Emulpon CO-360是由Akzo Nobel Chemicals Ltd.(525West Van Buren,Chicago,Illinois)制造的，它含有乙氧基化蓖麻油(100重量％)和环氧乙烷(<0.001重量％)。T-Det C-40(R)可购自Harcros Organics(5200Speaker Road.,P.O.Box 2930,Kansas City,Kansas)，或购自Akzo Nobel Chemicals Ltd.(525West Van Buren,Chicago,Illinois)，它是非离子型乳化剂，和乙氧基化(聚乙氧基化)蓖麻油的品牌。Agnique(TM)SBO-IO是由总部设在德国蒙海姆(Monheim,Germany)的Cognix GmbH制造的，它含有烷氧基化甘油三酯作为乙氧基化大豆油。

作物油或作物油浓缩物可用于增加除草剂制剂的功效。虽然不希望受任何特定理论束缚，作物油被认为相比于水更长时间地保持叶面湿润，这又允许除草剂更多时间地渗透，从而增加将进入植物(例如杂草)的除草剂的量。作物油可提高植物(例如杂草)对除草剂的吸收。作物油因此可以改进、增强、增加或促进除草功效或活性。作物油可以1重量％至40重量％、或1重量％至20重量％包含在制剂中。作物油可从石油或植物油中获得。作物油的非限制性实例包括大豆油和石油基油类。

本发明的农业化学组合物可呈常规制剂形式。非限制性实例包括溶液、乳液、悬浮液、可湿性粉剂、粉剂、粉末、糊剂、可溶性粉剂、颗粒剂、丸剂、可乳化浓缩物、油喷雾剂、气雾剂、用活性化合物浸渍的天然和合成材料，和非常细小的胶囊(例如在聚合物质中)。在某些实施方案中，所述组合物呈可乳化浓缩物、可湿性粉剂、颗粒剂、粉末、油喷雾剂或气雾剂形式。

所述农业化学组合物可任选地包括粘附涂层。这种涂层包括辅助抗真 菌剂和式I化合物粘附到预期环境(例如，待处理的植物)的那些涂层。粘附涂层包括呈各种形式(例如粉末、颗粒或胶乳)的羧甲基纤维素、天然和合成聚合物。其他粘附涂层包括阿拉伯树胶、聚乙烯醇和聚乙酸乙烯酯。磷脂如脑磷脂和卵磷脂以及合成磷脂也是粘附涂层的实例。其他添加剂可以是矿物油和植物油。

着色剂也可包括在所述农业化学组合物中。非限制性实例是无机颜料，例如氧化铁、氧化钛和普鲁士蓝；和有机染料，例如茜素染料、偶氮染料和金属酞菁染料；和痕量营养素，例如铁、锰、硼、铜、钴、钼和锌的盐。

根据本发明的农业化学组合物可以预拌物形式施用。除草组合物也可以单独配制并在使用时混合，即以桶混形式施用。本发明的组合物可以原样使用或者以其制剂形式使用，并且此外还可以与除草剂的混合物、预拌物或桶混物形式使用。所述组合物还可与其他活性化合物混合，例如其他杀真菌剂、杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、驱鸟剂、生长物质、植物营养剂和改善土壤结构的试剂。对于特定施用目的，特别是当出苗后施用时，可以包括制剂如被植物耐受的矿物油或植物油(例如商业产品“Oleo DuPont 1IE”)或铵盐如例如硫酸铵或硫氰酸铵作为其他添加剂。

所述组合物可以原样使用，以其制剂形式使用或以通过稀释浓缩形式而从其制备的形式如即用型或浓缩液体、溶液、悬浮液、乳液、或固体如粉剂、糊剂、颗粒剂和丸剂使用。它们例如通过浇灌、喷雾、雾化、撒布或散布以常规方式分散。

本发明的组合物可以通过混合或悬浮一种或多种稳定剂、活性成分和任选地佐剂、稀释剂或溶剂来制备。在某些实施方案中，本发明的组合物可以例如通过首先将一种或多种抗真菌剂和/或式I化合物与稀释剂或溶剂混合或用稀释剂或溶剂悬浮一种或多种抗真菌剂和/或式I化合物来制备。接着，将适当量的佐剂与含有抗真菌剂和式I化合物的所得混合物组合。所述抗真菌剂和式I化合物可以在最后添加并共混直至制剂变成几乎或完全均匀的。

可用农业化学组合物处理的植物在本文通常被称为“作物植物”。如本 文所用的术语“作物植物”包括任何可食用或不可食用的植物，包括出于商业用途种植和栽培的具有商业价值的装饰性植物物种。因此，作物植物包括花卉和非花卉植物、树木、蔬菜植物、草皮和地被植物。作物植物的非限制性具体实例包括芸苔、亚麻、豌豆、扁豆、蚕豆、黄色亚麻(linola)、芥菜、鹰嘴豆、向日葵、马铃薯、紫花苜蓿幼苗、洋葱、大豆和草皮草。术语“植物”意在包括发芽的种子、出土幼苗和长成的植物，包括根和地上部分(例如，叶、茎、花、果实、分枝、大枝、根等)。本文所用的术语“草皮”是指生长在需要它们或者特意计划和维持的区域(例如，草坪)中的草。草皮也是指草地，其中地面的表面层由草毡和草根组成。

抗真菌剂和式I化合物的施用量取决于例如用所述农业化学组合物处理的作物而改变。一般来说，施用量可为0.01kg/ha至5.00kg/ha或者0.03kg/ha至3.00kg/ha的抗真菌剂和/或式I化合物。

本发明人还发现，本发明的抑制剂可以有效地用于治疗包含AOX酶的动物或人类真菌病原体的感染。

因此，在第五方面，提供用于疗法中或用作药剂的根据第一方面的抗真菌组合物。

在第六方面，提供用于治疗真菌感染的根据第一方面的抗真菌组合物。

在第七方面，提供治疗、改善或预防受试者中的真菌感染的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的抗真菌剂和式I化合物。

在第八方面，提供抑制微生物交替氧化酶(AOX)和/或细胞色素bc₁复合物的活性的方法，所述方法包括使微生物交替氧化酶(AOX)和/或细胞色素bc₁复合物与治疗有效量的抗真菌剂和式I化合物接触。

优选地，所述抗真菌组合物用于治疗任何真菌感染。例如，所述组合物有效抵抗的真菌可包括丝状真菌，例如子囊菌(Ascomycete)。所述组合物有效抵抗的真菌的实例可选自由以下组成的属的群组：曲霉属(Aspergillus)；布氏白粉属(Blumeria)；念珠菌属(Candida)；隐球菌属(Cryptococcus)；脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon)；镰刀菌属(Fusarium)； 小球腔菌属(Leptosphaeria)；大毁壳属(Magnaporthe)；疫霉属(Phytophthora)；单轴霉属(Plasmopara)；肺囊虫属(Pneumocystis)；梨孢属(Pyricularia)；腐霉属(Pythium)；柄锈菌属(Puccinia)；丝核菌属(Rhizoctonia)；毛藓菌属(richophyton)；和黑穗菌属(Ustilago)。

真菌的优选实例可选自由曲霉属和念珠菌属组成的属的群组。所述真菌可选自由以下组成的物种的群组：黄曲霉(Aspergillus flavus)；烟曲霉(Aspergillus fumigatus)；构巢曲霉(Aspergillus nidulans)；黑曲霉(Aspergillus niger)；寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)；土曲霉(Aspergillus terreus)；禾谷布氏白粉菌(Blumeria graminis)；白色念珠菌(Candida albicans)；克鲁斯念珠菌(Candida cruzei)；光滑念珠菌(Candida glabrata)；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)；热带念珠菌(Candida tropicalis)；新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)；兔脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)；茄病镰刀菌(Fusarium solani)；颖枯小球腔菌(Leptosphaerianodorum)；稻瘟菌；南瓜疫病菌(Phytophthora capsici)；马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)；葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola)；耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci)；禾冠柄锈菌(Puccinia coronata)；禾柄锈菌(Puccinia graminis)；稻热病菌(Pyricularia oryzae)；终极腐霉菌(Pythium ultimum)；水稻纹枯病菌；指间毛藓菌(Trichophytoninterdigitale)；红色毛藓菌(Trichophyton rubrum)；和玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)。

如实施例2中所述，包含Colletochlorin B和嘧菌酯的制剂显示针对已经表达AOX的酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)的令人惊讶的协同特性。

因此，真菌的其他优选实例包括酵母，例如来自子囊菌门，或酵母属(Saccharomyces spp.)，例如酿酒酵母，或念珠菌属，和白色念珠菌，其已知感染人类。

所述抗真菌组合物可用于治疗与人类病原体相关的疾病，例如肠道疾病；利什曼病(Leishmaniasis)；念珠菌病(Candidiasis)；和与隐形眼镜使用相关的疾病。

应理解，锥虫(Trypanosoma)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum) 和人芽囊原虫(Blastocystis hominis)可引起肠道疾病；利什曼病是由利什曼寄生虫引起的；念珠菌病是由白色念珠菌引起的(通常称为鹅口疮)；并且与隐形眼镜使用相关的疾病可由自由生活的原生动物棘阿米巴属(Acanthamoeba)引起。

所述抗真菌剂和式I化合物可同时地(例如呈根据本发明的第一方面的组合物形式)或依次地施用。如果依次施用，则所述抗真菌剂和式I化合物应该同时在所治疗的受试者内具治疗活性。

用抗真菌剂和根据本发明的式I化合物治疗真菌疾病是特别有用的，因为这种疗法导致令人惊讶的协同作用。此外，可使用与单一疗法中所需相比较低的剂量来实现令人满意的疗法。这具有如下优点：可避免或降低与高剂量的抗真菌剂和式I化合物相关的任何有害副作用。

所述抗真菌剂和式I化合物可用于治疗现有的医学病状，但当预防性治疗被认为在医学上必要时也可使用。

所述抗真菌剂和根据本发明的式I化合物可组合在特别取决于组合物的使用方式而具有多种不同形式的抗真菌组合物中。因此，例如，所述抗真菌组合物可呈粉剂、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气雾剂、喷雾剂、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液形式或可施用至需要治疗的个人或动物的任何其他合适的形式。应理解，根据本发明的药剂的媒介物应该是被其所给与的受试者良好耐受者。

包含抗真菌剂和式I化合物的药剂可以多种方式使用。例如，可能需要口服施用，在这种情况下所述抗真菌剂和式I化合物可包含在可以例如以片剂、胶囊或液体形式经口摄取的组合物内。包含本发明化合物的组合物可通过吸入(例如鼻内)施用。组合物也可以配制用于局部使用。例如，凝胶、乳膏或软膏可涂在皮肤上，例如与治疗部位(即现有或潜在的真菌感染部位)相邻。

抗真菌剂和式I化合物还可并入缓释或延迟释放装置中。这类装置可例如插入皮肤上或皮肤下，并且药剂可在数周或甚至数月内释放。所述装置可至少相邻治疗部位定位。当需要用根据本发明使用的化合物长期治疗 并且其通常将需要频繁施用(例如至少每日注射)时，这类装置可能是特别有利的。

在一个优选实施方案中，抗真菌剂和式I化合物可通过注射至血流中或直接注射至需要治疗的部位而施用至受试者。注射可以是静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)或皮内(推注或输注)。

应理解，所需的抗真菌剂和式I化合物的量由它们的生物活性和生物利用度决定，这反过来又取决于施用模式、每种化合物的物理化学特性以及它是以单一疗法形式使用抑或用于组合疗法中。施用频率也将受到抗真菌剂和式I化合物在所治疗的受试者中的半衰期影响。待施用的最佳剂量可由本领域技术人员确定，并且将随着使用的特定化合物、药物组合物的强度、施用模式和所治疗的真菌感染的进展而改变。取决于所治疗的具体受试者的其他因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。

通常，取决于使用哪种化合物，日剂量为0.01μg/kg体重至0.5g/kg体重的抗真菌剂和根据本发明的式I化合物可用于治疗、改善或预防微生物感染。更优选地，抗真菌剂和式I化合物的日剂量为0.01mg/kg体重至500mg/kg体重，更优选地为0.1mg/kg至200mg/kg体重，并且最优选地为大约1mg/kg至100mg/kg体重。

所述抗真菌剂和式I化合物可在微生物感染发作之前、期间或之后施用。日剂量可以单次施用(例如单次每日注射)形式给与。可选地，所述抗真菌剂和式I化合物可能需要在一天内施用两次或更多次。举例来说，抗真菌剂和式I化合物可以介于25mg至7000mg(即假设体重为70kg)的两次(或更多次，取决于所治疗疾病的严重程度)日剂量施用。接受治疗的患者可在醒来时服用第一剂量并且然后在晚上(如果是两剂量方案的话)或在其后每3或4小时的时间间隔下服用第二剂量。可选地，可使用缓释装置向患者提供最佳剂量的根据本发明的化合物而无需施用重复剂量。

可使用已知程序(例如制药工业(例如体内实验、临床试验等)常规 使用的那些)来形成包含抗真菌剂和根据本发明的式I化合物的特定制剂和精确的治疗方案(例如所述化合物的日剂量和施用频率)。本发明人认为是他们首次描述了基于抗真菌剂和式I化合物的组合使用来治疗微生物感染的组合物。

因此，在本发明的第九方面，提供包含抗真菌剂和式I化合物以及药学上可接受的媒介物的抗真菌药物组合物。

在第十方面，本发明还提供用于制造根据第九方面的抗真菌药物组合物的方法，所述方法包括使治疗有效量的抗真菌剂和式I化合物与药学上可接受的媒介物接触。

所述抗真菌剂可选自由以下组成的抗真菌剂的群组：苯酰胺杀真菌剂家族成员；嗜球果伞素家族成员；去甲基化抑制剂；CuPC33；啶酰菌胺；苯醚甲环唑；和唑菌胺酯。

优选地，所述苯酰胺杀真菌剂家族成员是甲霜灵。因此，在一个优选实施方案中，所述抗微生物组合物包含甲霜灵和如本文所限定的化合物(I)。

优选地，所述嗜球果伞素家族成员是嘧菌酯。因此，在另一个优选实施方案中，所述抗微生物组合物包含嘧菌酯和如本文所限定的化合物(I)。

化合物(I)如本文所限定。

“受试者”可能是脊椎动物、哺乳动物或家养动物。因此，根据本发明的抑制剂、组合物和药剂可用于治疗任何哺乳动物，例如家畜(例如马)、宠物，或者可用于其他兽医应用中。然而，最优选地，所述受试者是人类。

抗真菌剂和式I化合物的“治疗有效量”是当施用至受试者时作为治疗微生物感染或产生所需作用(即AOX和/或细胞色素bc₁复合物的抑制)所需的药剂或药物量的任何量。

例如，所述抗真菌剂和式I化合物的治疗有效量可以是约0.01mg至约800mg，并且优选地约0.01mg至约500mg。优选的是，所述抗真菌剂和式I化合物的量是约0.1mg至约250mg并且最优选地约0.1mg至约20mg的量。

如本文所提及的“药学上可接受的媒介物”是本领域技术人员已知可用 于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。

在一个实施方案中，所述药学上可接受的媒介物可以是固体，并且所述组合物可呈粉剂或片剂形式。固态的药学上可接受的媒介物可包括一种或多种物质，其也可充当调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填充剂、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、涂料或片剂崩解剂。所述媒介物也可以是包封材料。在粉剂中，所述媒介物是与根据本发明的细粉状活性剂混合的细粉状固体。在片剂中，所述活性剂(例如抗真菌剂和式I化合物)可与具有必要压缩特性的媒介物以合适的比例混合并压制成所需形状和尺寸。所述粉剂和片剂优选地含有高达99％的活性剂。合适的固体媒介物包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施方案中，所述药物媒介物可以是凝胶并且所述组合物可呈乳膏等形式。

然而，所述药物媒介物可以是液体，并且所述药物组合物呈溶液形式。液体媒介物被用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。所述抗真菌剂和式I化合物可溶解或悬浮在药学上可接受的液体媒介物如水、有机溶剂、两者的混合物或者药学上可接受的油或脂肪中。所述液体媒介物可含有其他合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、色素、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。用于口服和肠胃外施用的液体媒介物的合适实例包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选地羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇类)和它们的衍生物，以及油类(例如分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，所述媒介物也可以是油酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体媒介物可用于供肠胃外施用的无菌液体形式组合物中。用于加压组合物的液体媒介物可以是卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。

作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可以通过例如肌内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内和尤其皮下注射使用。活性化合物可制备成可以 在施用时使用无菌水、盐水或其他适当的无菌可注射介质溶解或悬浮的无菌固体组合物。

本发明的抗真菌剂和式I化合物和药物组合物可以含有其他溶质或悬浮剂(例如，足以使溶液等渗的盐水或葡萄糖)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(与环氧乙烷共聚的山梨糖醇油酸酯和其酸酐)等的无菌溶液或悬浮液形式经口施用。根据本发明的化合物还可以液体或固体组合物形式经口施用。适合口服施用的组合物包括固体形式，例如丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂和粉剂；以及液体形式，例如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液。适合肠胃外施用的形式包括无菌溶液、乳液和悬浮液。

在另一个方面，提供包含抗真菌剂和式I化合物的抗真菌组合物：

其中R¹选自具有1至4个C原子的腈基、烷基、烯基、胺，其任选地被F、O、NH₂或CN单取代或多取代，并且其中一个或多个非相邻的CH₂基团任选地在每种情况下彼此独立地被-O-、-NH-、-CO-、-COO-或-OCO-代替；

R²是氢或羟基或具有1至3个C原子的烷氧基基团；

R³是具有4至20个C原子的直链或支链的烷基或亚烷基，其任选地被C₁至C₄烷基基团单取代或多取代；

R⁴是氢或羟基或具有1至3个C原子的烷氧基基团；

R⁵是卤素基团；和

R⁶是H或C₁至C₄烷基基团；

其条件是R²和R⁴中的至少一个是具有1至3个C原子的羟基或烷氧基基团。

本文描述的所有特征(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可与任何上述方面以任何组合形式组合，其中这些特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。

附图说明

现在将参考以下实施例和附图仅通过示例的方式来进一步描述本发明的实施方案，在所述附图中：

图1表示在本发明组合物中使用的化合物I的一个实施方案(即Colletochlorin B)的化学式；

图2表示甲霜灵的化学式；

图3表示嘧菌酯的化学式；

图4表示去甲基化抑制剂(DMI)的一个实施方案的化学式；

图5表示啶酰菌胺的化学式；

图6表示苯醚甲环唑的化学式；

图7表示唑菌胺酯的化学式；和

图8示出Collectochlorin B(1μM)和嘧菌酯(1μM)对于在琼脂板上生长的酿酒酵母真菌生长的协同作用。

具体实施方式

实施例

本发明人测试了一系列包含WO 2013/160670中所述的化合物与多种不同杀真菌剂的组合的新型制剂的抗真菌活性。WO 2013/160670公开了Colletochlorin B，其已经证实为微生物交替氧化酶(AOX)和/或细胞色素bc₁复合物的抑制剂。

实施例1-用于测试针对真菌(例如白蜡鞘孢菌)的杀真菌剂的测定法

材料：

YPD培养基/琼脂

○2％酵母提取物

○2％蛋白胨

○2％D-葡萄糖

○2％琼脂

YPG

○2％酵母提取物

○2％蛋白胨

○2％甘油

○2％琼脂

杀真菌剂制剂

参照图7，Colletochlorin B是使用WO 2013/160670中所述的方法合成的。然后，将1μM的Colletochlorin B分别地与各5μM的以下杀真菌剂组合以产生七种不同制剂：

1)甲霜灵，属于苯酰胺杀真菌剂家族(Sukul,P.和M.Spiteller(2000)"Metalaxyl:persistence,degradation,metabolism,and analytical methods."《环境污染与毒物学通报(Rev Environ Contam Toxicol)》164:1-26)；

2)嘧菌酯，属于嗜球果伞素家族；

3)DMI(去甲基化抑制剂)；

4)CuPC33，基于铜的化合物；

5)啶酰菌胺；

6)苯醚甲环唑；和

7)唑菌胺酯。

方法

1.将酵母菌株划线接种并在30℃下在YPD琼脂板上生长3天。

2.用相关真菌菌株(例如白蜡鞘孢菌)接种5mL的YPD液体培养基并使其在30℃下在180rpm下振摇下生长3天。

3.将1μL真菌菌株接种物添加至9999μL YPG液体培养基并轻轻混合。

4.然后将5μL的每种菌株(酵母和真菌)铺在含有多种不同抑制剂浓度(例如1μM、1.5μM和2μM)的七种包含1μM Colletochlorin B和5μM杀真菌剂的制剂中的每一种的YPG琼脂板上。

5.使板在30℃下生长3-5天。

6.然后评估由抑制剂造成的真菌/酵母生长的抑制程度。

结果

对于七种组合制剂中的每一种，本发明人惊讶地观测到可见协同抑制作用。例如，本发明人单独地和组合地测试了针对白蜡鞘孢菌的Colletochlorin B和嘧菌酯。当所述化合物单独使用时，观测到真菌的部分生长抑制。然而，当组合使用时，可见完全抑制。因此，本发明人认为，七种包含化合物I(优选地Colletochlorin B)和各种其他抗真菌化合物的制剂可以有效地用于治疗或预防真菌感染。

实施例2-Colletochlorin B和嘧菌酯针对真菌(例如酿酒酵母)的协同作用

本发明人测试了Colletochlorin B和嘧菌酯的组合对酿酒酵母生长的功效。如在实施例1中一样，参照图7，Colletochlorin B是使用WO 2013/160670中所述的方法合成的。

方法

1.将酿酒酵母划线接种并在30℃下在YPD琼脂板上生长3天。

2.用来自所述YPD板的酿酒酵母接种5mL的YPD液体培养基并使其在30℃下在180rpm下振摇下生长3天以产生细胞培养物。

3.然后将约5×10⁵个酿酒酵母细胞铺在含有1μM Colletochlorin B或1μM嘧菌酯或1μM Colletochlorin和1μM嘧菌酯的组合的YPG琼脂板上。

4.将所述板在30℃下温育3-5天。

5.然后评估由抑制剂造成的真菌/酵母生长的抑制程度。

所述板示于图8中。对于每个板，在顶部中心生长的酵母菌落在充当 阴性对照的任何抑制剂存在下不生长。然而，对于图8A中所示的板，在左下方所示的菌落在仅1μM Colletochlorin B存在下生长，并且对于图8B中所示的板，在左下方所示的菌落在仅1μM嘧菌酯存在下生长。然而，对于图8C，在板的左下方的菌落在1μM嘧菌酯和1μM Colletochlorin B的组合存在下生长。

结果

本发明人单独地(图8a和图8b)和组合地(图8c)测试了针对酿酒酵母的Colletochlorin B和嘧菌酯。当所述化合物单独使用时，观测到真菌的部分生长抑制。然而，当组合使用时，观测到完全抑制。因此，本发明人已经令人惊讶地证实，包含AOX抑制剂和常规杀真菌剂的制剂可以有效地用于治疗或预防真菌感染。