一种用于农杆菌介导大豆子叶节转化的外植体选择方法及应用与流程

文档序号:12421885阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种制备大豆目标子叶节外植体的方法,包括如下步骤:

1)检测待测大豆种子在6个萌发状态下子叶节外植体的瞬时转化率和丛生芽率,选择满足如下A和B,作为外植体制备候选萌发时期;

A为6个萌发状态下子叶节外植体的瞬时转化率中显著高的某个萌发状态或某几个萌发状态;

B为6个萌发状态下子叶节外植体的丛生芽率中显著高的某个萌发状态或某几个萌发状态;

2)检测待测大豆种子在所述外植体制备候选萌发时期下子叶节外植体的稳定转化率,选择所有候选萌发时期子叶节外植体的转化率显著高的某个候选萌发时期或某几个候选萌发时期,作为外植体制备时期;

3)对所述外植体制备时期的待测大豆种子截取子叶节,得到待测大豆目标子叶节外植体;

所述6个萌发状态为如下(1)-(6):

(1)Y状态:子叶呈白色,下胚轴包裹在种皮中;

(2)YL状态:子叶呈白色,下胚轴突破种皮且呈白色;

(3)HG状态:子叶呈白色,下胚轴突破种皮且呈黄绿色;

(4)HG+CG状态:子叶近下胚轴处呈黄绿色其余部分呈白色,下胚轴突破种皮且呈绿色;

(5)CG状态:子叶全部呈黄绿色,下胚轴突破种皮且呈绿色;

(6)G状态:子叶叶边缘呈墨绿色,下胚轴突破种皮且呈绿色。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:

步骤1)中,所述检测待测大豆种子在6个萌发状态下子叶节外植体的瞬时转化率的方法包括如下步骤:将报告基因分别转入6个萌发状态下子叶节外植体,得到每个萌发状态对应的转基因外植体,检测所述转基因外植体中转入报告基因的外植体,计算所述每个萌发状态对应的转基因外植体中转入报告基因的外植体与所述每个萌发状态下子叶节外植体的数量比或数量百分比,得到每个萌发状态下子叶节外植体的瞬时转化率;

所述检测待测大豆种子在6个萌发状态下子叶节外植体的丛生芽率的方法包括如下步骤:用农杆菌分别侵染6个萌发状态下子叶节外植体,得到每个萌发状态对应的转染后外植体,将所述每个萌发状态对应的转染后外植体进行丛生芽诱导培养,得到每个萌发状态对应的丛生芽诱导后外植体;检测所述丛生芽诱导后外植体中带有丛生芽的外植体,计算所述每个萌发状态对应的丛生芽诱导后外植体中带有丛生芽的外植体与所述每个萌发状态下子叶节外植体的数量比或数量百分比,得到每个萌发状态下子叶节外植体的丛生芽率。

3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:

步骤2)中,所述检测待测大豆种子在所述外植体制备候选萌发时期下子叶节外植体的稳定转化率的方法包括如下步骤:将外源基因分别转入每个候选萌发时期下子叶节外植体,得到每个候选萌发时期对应的转染后外植体,将所述每个候选萌发时期对应的转染后外植体依次进行丛生芽诱导培养、再生芽诱导培养和生根培养,得到再生植株,检测再生植株中转入外源基因的再生植株,计算每个候选萌发时期对应的再生植株中转入外源基因的再生植株与所述每个候选萌发时期下子叶节外植体的数量比或数量百分比,得到每个候选萌发时期下子叶节外植体的稳定转化率。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:

所述报告基因为GUS;

或,所述农杆菌为根癌农杆菌;

或,所述外源基因为EPSPS基因;

或,所述外源基因通过表达其的载体GR16导入外植体,

或,所述待测大豆的品种为Jack、中黄10号或水里站。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述检测所述转基因外植体中转入报告基因的外植体的时间为将外源基因转入6个萌发状态下子叶节外植体的第3天;

或所述检测所述丛生芽诱导后外植体中带有丛生芽的外植体的时间为所述诱导培养第15-30天。

6.一种选择大豆子叶节外植体制备候选萌发时期的方法,包括权利要求1-5中任一所述方法的步骤1)。

7.一种选择大豆子叶节外植体制备时期的方法,包括权利要求1-5中任一所述方法的步骤1)-2)。

8.一种制备大豆子叶节外植体的试剂盒,包括参数采集系统和可读性载体;

所述参数采集系统包括采集所述可读性载体中涉及的子叶颜色、下胚轴颜色和形态的参数采集设备和参数采集试剂;

所述可读载体记载如下6种种子萌发形态:

(1)Y状态:子叶呈白色,下胚轴包裹在种皮中;

(2)YL状态:子叶呈白色,下胚轴突破种皮且呈白色;

(3)HG状态:子叶呈白色,下胚轴突破种皮且呈黄绿色;

(4)HG+CG状态:子叶近下胚轴处呈黄绿色其余部分呈白色,下胚轴突破种皮且呈绿色;

(5)CG状态:子叶全部呈黄绿色,下胚轴突破种皮且呈绿色;

(6)G状态:子叶叶边缘呈墨绿色,下胚轴突破种皮且呈绿色。

9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于:

所述参数采集设备包括种子萌发容器;

所述参数采集试剂包括用于种子萌发的培养基或培养体系。

10.权利要求8或9所述的试剂盒在制备大豆子叶节外植体中的应用;

或,权利要求8或9所述的试剂盒中的所述可读性载体或所述参数采集系统在制备大豆子叶节外植体中的应用;

或,权利要求8或9所述的试剂盒中的所述可读性载体或所述参数采集系统在选择大豆子叶节外植体制备的种子候选萌发时期中的应用;

或权利要求1-7任一所述方法或权利要求8或9所述的试剂盒中的所述可读性载体或所述参数采集系统在大豆转基因研究或转基因大豆培育中的应用。

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