本发明属于植物保护
技术领域：
，具体涉及一种含有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)与恶霉灵的杀菌组合物可湿性粉剂、制备方法及其在防治水稻立枯病中的应用。
背景技术：
：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)广泛分布在土壤及腐败的有机物中，对植物病虫害具有较好的防治作用，目前运用枯草芽孢杆菌可有效防治草莓白粉病、黄瓜菌核病、番茄枯萎病等。由于微生物发酵易大规模生产，解决了实际生产中对于原料提取的依赖性，降低了防治成本。因此，枯草芽孢杆菌在植物生防领域的应用具有广阔前景。哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)近年来在植物生防中受到研究者的重视。哈茨木霉菌是木霉菌的一种，是具有重要的生防价值的真菌。哈茨木霉菌对番茄灰霉病、叶霉病以及枯萎病、褐霉病的抑制作用明显。而对芽孢杆菌、土壤杆菌、芽单胞菌有明显促进生长作用。在欧洲和北美占有很大的市场份额，前景广阔。恶霉灵为浅黄色晶体，是内吸性土壤杀菌剂，对土壤中真菌类的腐霉菌、镰刀菌、丝核菌、根壳菌等病原菌杀菌效果较好。也是水稻立枯病防治的常用主要药剂之一。水稻是我国重要的粮食作物，但是生产中水稻立枯病发生十分严重，成为水稻育苗生产的重大问题。所以现代育苗中使用了大量的化学杀菌剂来防治水稻立枯病，在使用过程中发现抗药性逐年升高，并且由于杀菌剂的大量使用造成了不可逆的环境污染。生物农药的出现能够解决当前环境污染以及防效降低的问题。利用生防菌防治水稻立枯病具有很好防治效果。但生物菌防治效果受环境影响较大。所以为保证防治效果，本发明利用两种生防菌枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌与化学杀菌剂恶霉灵组合防治水稻立枯病。该组合物化学农药使用量减少能够有效减缓水稻立枯病产生的抗药性，减少环境污染，做到绿色安全高效。并且能够减少杀菌剂对土壤中有益菌群的不良影响，保证土壤菌群建立良性循环，为植物根系生长提供有利环境。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种含有枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌与恶霉灵的杀菌组合物可湿性粉剂及其制备方法。一种含有枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌与恶霉灵的杀菌组合物可湿性粉剂，按质量百分和100％计算，各组份组成如下：所述的杀菌组合物可湿性粉剂中，有效成分枯草芽孢杆菌的含量为20～23亿cfu/g、哈茨木霉菌的含量为35～40亿cfu/g、恶霉灵≥25mg/g。所述助剂种类以及质量百分比：载体硅藻土15％～20％、润湿剂和分散剂萘磺酸盐甲醛缩合物(d245)12％～15％、稳定剂羧甲基纤维素钠(cmc-na)1％～2％、保护剂l-抗坏血酸(vc)0.1％～0.5％作为优选，所述枯草芽孢杆菌干粉与哈茨木霉菌孢子粉以1：1质量比例混合制成复合生物菌母药。作为优选，所制备药剂原料所占质量百分比为：枯草芽孢杆菌干粉30％、哈茨木霉菌孢子粉30％、恶霉灵原药3％、载体硅藻土19.9％、润湿剂和分散剂萘磺酸盐甲醛缩合物(d245)15％、稳定剂羧甲基纤维素钠(cmc-na)2％、保护剂l-抗坏血酸(vc)0.1％。本发明所述的枯草芽孢杆菌干粉的制备，其步骤如下：(1)枯草芽孢杆菌菌株的筛选及纯化，一级平板lb固体培养基培养，二级液体培养基驯化，三级液体培养基发酵。一级平板lb固体培养基配方：称取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g、琼脂粉15g，加入到蒸馏水中，用蒸馏水定容至1l，再用naoh调节ph值到7.0～7.5；然后在121℃条件下高压灭菌20min，待冷却至50～60℃时，倒在培养皿中，得到一级平板lb固体培养基。二级液体培养基配方：称取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，加入到蒸馏水中，用蒸馏水定容至1l，再用naoh调节ph值到7.0～7.5，然后在121℃条件下高压灭菌20min，冷却至室温得到二级液体培养基。三级液体培养基配方：称取胰化蛋白胨10g、牛肉膏3g、nacl5g，加入到蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至1l，用naoh调节ph值到7.0～7.5；然后在120℃条件下高压灭菌20min，冷却至室温后得到三级液体培养基。接种枯草芽孢杆菌菌株于一级平板lb固体培养基上，接种量为固体培养基体积的1～3％，28℃～30℃条件下培养48～72h，然后将枯草芽孢杆菌菌落接入二级液体培养基，于28℃～30℃、150～200r/min条件下震荡培养48～72h，测定浓度大于20亿cfu/ml接入三级液体培养基，于28℃～30℃、150～200r/min条件下震荡发酵培养48～72h，将离心产物用无菌蒸馏水制得菌悬液，浓度为100～120亿cfu/ml，4℃保存；(2)将枯草芽孢杆菌菌悬液与质量百分数为1％的海藻酸钠水溶液等体积混合，恒温搅拌混合均匀；(3)称取步骤(2)溶液2倍体积的大豆油，向大豆油中加入吐温80，配置成吐温80质量百分含量为0.2％的溶液；然后于150～200r/min条件下震荡10～20min；(4)将步骤(2)所得的溶液滴加到步骤(3)所得的溶液中，100～300r/min条件下震荡10～20min；再向其中滴加质量百分含量为4％～5％的氯化钙水溶液至无沉淀物析出为止，固化静置30～60min；然后过滤出沉淀物，真空干燥后粉碎得到枯草芽孢杆菌干粉，其中枯草芽孢杆菌活菌≥70亿cfu/g。本发明所述的哈茨木霉菌孢子粉的制备方法，其步骤如下：哈茨木霉菌菌株筛选、一级斜面培养、二级平板培养、三级固体堆积发酵。哈茨木霉菌三级培养全部采用pda固体培养基。pda培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、无菌水1000ml。将上述pda培养基120℃条件下高温灭菌20分钟后冷却，倒入试管制备成一级斜面培养基。将菌株哈茨木霉菌转入一级斜面培养基，30～35℃、暗环境下培养120h～170h，然后转接到二级平板培养；再于30～35℃、暗环境下培养120h～170h，至哈茨木霉菌孢子以及菌丝全部覆盖培养基为止，然后转入三级培养瓶中进行固体堆积培养，即在250ml培养瓶中加入100mlpda培养基凝固后使用接菌环接入哈茨木霉孢子进行划线，30～35℃、光照条件下培养至覆盖培养基表面后使用玻璃棒将生长的哈茨木霉菌菌丝及孢子堆积到中心位置，重复3次堆积操作，测得菌种浓度达到140～160亿cfu/g后升温至60℃维持5h，从而制得哈茨木霉孢子粉浓度大于120亿cfu/g，4℃保存。本发明所述的杀菌组合物可湿性粉剂的制备方法，其步骤如下：(1)将哈茨木霉孢子粉和枯草芽孢杆菌干粉混合恒温均匀，制备得到菌剂母药；(2)按质量和100％计算，依次称取菌剂母药60％～68％、恶霉灵2.5％～3％、硅藻土15％～19.9％、萘磺酸盐甲醛缩合物(d245)12％～15％、羧甲基纤维素钠(cmc-na)1％～2％、l-抗坏血酸(vc)0.1％～0.5％，混合均匀；(3)将步骤(2)得到的混合物过标准400目筛后得到本发明所述的含有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)与恶霉灵的杀菌组合物可湿性粉剂，装棕色瓶保存。本发明组分合理，杀菌效果好，增效作用显著，不仅可以减缓抗性的产生，而且对作物安全性好，符合农药制剂的安全性要求。本发明对水稻立枯病具有较好的防治效果具体实施方式本发明的核心是提供一种防治水稻立枯病的新型杀菌剂组合的制备方法及应用技术。下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1：枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌和恶霉灵的室内毒力测定本实施例的目的是根据室内毒力回归方程计算出ec50值，根据ec50值确定药剂施用浓度。具体步骤如下：采用菌丝生长抑制率法，对枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌、恶霉灵进行室内毒力测定。首先，制备枯草芽孢杆菌干粉：(1)枯草芽孢杆菌菌株的筛选及纯化，一级平板lb固体培养基培养，二级液体培养基驯化，三级液体培养基发酵。一级平板lb固体培养基配方：称取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g、琼脂粉15g，加入到蒸馏水中，用蒸馏水定容至1l，再用naoh调节ph值到7.0；然后在121℃条件下高压灭菌20min，待冷却至50℃时，倒在培养皿中，得到一级平板lb固体培养基。二级液体培养基配方：称取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，加入到蒸馏水中，用蒸馏水定容至1l，再用naoh调节ph值到7.0，然后在121℃条件下高压灭菌20min，冷却至室温得到二级液体培养基。三级液体培养基配方：称取胰化蛋白胨10g、牛肉膏3g、nacl5g，加入到蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至1l，用naoh调节ph值到7.0；然后在120℃条件下高压灭菌20min，冷却至室温后得到三级液体培养基。接种枯草芽孢杆菌菌株(上海鲁微科技有限公司，菌种编号：atcc6633)于一级平板lb固体培养基上，接种量为固体培养基体积的1％，28℃条件下培养48h，然后将枯草芽孢杆菌菌落接入二级液体培养基，于28℃、150r/min条件下震荡培养48h，测定浓度大于20亿cfu/ml接入三级液体培养基，于28℃、150r/min条件下震荡发酵培养48h，将离心产物用无菌蒸馏水制得菌悬液，浓度为100亿cfu/ml，4℃保存。(2)将枯草芽孢杆菌菌悬液与质量百分数为1％的海藻酸钠水溶液等体积混合，恒温搅拌混合均匀；(3)称取步骤(2)溶液2倍体积的大豆油，向大豆油中加入吐温80，配置成吐温80质量百分含量为0.2％的溶液；然后于150r/min条件下震荡10min；(4)将步骤(2)所得的溶液滴加到步骤(3)所得的溶液中，100r/min条件下震荡10min；再向其中滴加质量百分含量为4％的氯化钙水溶液至无沉淀物析出为止，固化静置30min；然后过滤出沉淀物，真空干燥后粉碎得到枯草芽孢杆菌干粉，枯草芽孢杆菌干粉活菌浓度为70亿cfu/g。其次，制备哈茨木霉菌孢子粉：哈茨木霉菌菌株筛选、一级斜面培养、二级平板培养、三级固体堆积发酵。哈茨木霉菌三级培养全部采用pda固体培养基。pda培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、无菌水1000ml。将上述pda培养基120℃条件下高温灭菌20分钟后冷却，倒入试管制备成一级斜面培养基。将哈茨木霉菌菌株转入一级斜面培养基，30℃、暗环境下培养170h，然后转接到二级平板培养；再于30℃、暗环境下培养170h，至哈茨木霉菌孢子以及菌丝全部覆盖培养基为止，然后转入三级培养瓶中进行固体堆积培养，即在250ml培养瓶中加入100mlpda培养基凝固后使用接菌环接入哈茨木霉孢子进行划线，30℃、光照条件下培养至覆盖培养基表面后使用玻璃棒将生长的哈茨木霉菌菌丝及孢子堆积到中心位置，重复3次堆积操作，测得哈茨木霉菌孢子粉浓度大于140亿cfu/g后升温至60℃维持5h，从而制得哈茨木霉孢子粉浓度大于120亿cfu/g，4℃保存。利用发酵培养和制备的枯草芽孢杆菌干粉、哈茨木霉菌孢子粉及恶霉灵原药使用无菌蒸馏水配置出五个浓度的药液，分别为枯草芽孢杆菌药液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0cfu/ml，哈茨木霉菌药液0.1、0.3、0.5、1.0、1.2cfu/ml，恶霉灵药液10、50、100、150、200μg/ml，重复3次试验。实验结果见表1。表1：枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌和恶霉灵的室内毒力测定名称毒力回归方程r值ec50枯草芽孢杆菌y＝0.1819x+5.3010.96270.02亿cfu/ml哈茨木霉菌y＝-1.1294x+3.360.99940.035亿cfu/ml恶霉灵y＝1.5485x+2.87650.974625μg/ml从表1可以看出，枯草芽孢杆菌ec50为0.02亿个cfu/ml，哈茨木霉菌ec50为0.035亿cfu/ml，恶霉灵ec50为25μg/ml。为生物菌混配比例以及与恶霉灵的组合使用提供了理论基础。实施例2：枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌与恶霉灵杀菌组合物可湿性粉剂的制备枯草芽孢杆菌干粉、哈茨木霉菌孢子粉的制备如实施例1，枯草芽孢杆菌干粉浓度为70亿cfu/ml，哈茨木霉菌孢子粉浓度120亿cfu/g、恶霉灵原药浓度为质量百分数为99％。1、将制得的枯草芽孢杆菌干粉与哈茨木霉孢子粉，按照质量比例为1：1使用恒温搅拌机混匀，制备为菌剂母药备用。2、按质量和100％计算，依次称取菌剂母药60％、恶霉灵3％、硅藻土19.9％、萘磺酸盐甲醛缩合物(d245)15％、羧甲基纤维素钠(cmc-na)2％、l-抗坏血酸(vc)0.1％，混合均匀；3、杀菌组合物混匀后过标准400目筛后装棕色瓶保存，从而制得复合微生物菌剂和恶霉灵的组合可湿性粉剂。经平板菌落计数法测定所述的杀菌组合物可湿性粉剂中，有效成分枯草芽孢杆菌的含量为20亿cfu/g、哈茨木霉菌的含量为35亿cfu/g、恶霉灵≥25mg/g。实施例3：枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌与恶霉灵杀菌组合物的田间应用试验设计见表2。分别设计了三种不同的施用方式：叶面喷雾、土壤灌根、叶面喷雾和土壤灌根同时施用。施药时期及施药方式设定如下：土壤灌根是在水稻播种后，种子露白时进行灌根1次。叶面喷雾是在水稻两叶期时进行叶面喷雾1次。施药方式分为：灌根1次、喷雾1次、灌根与喷雾共2次施药含量及浓度设定如下：单剂枯草芽孢杆菌的药剂含量为40亿cfu/g(本发明制备的枯草芽孢杆菌干粉加入载体硅藻土加工制成)，施用稀释1000倍水溶液；单剂哈茨木霉菌的药剂含量为70亿cfu/g(本发明制备的哈茨木霉孢子粉加入载体硅藻土加工制成)，施用稀释1000倍水溶液；单剂恶霉灵的药剂含量为50mg/g(恶霉灵直接用水稀释为需要浓度并加入药液体积比为1％的吐温80)，施用稀释1000倍水溶液；杀菌组合物有效成分含量：枯草芽孢杆菌20亿cfu/g、哈茨木霉菌35亿cfu/g、恶霉灵25mg/g，施用稀释1000倍水溶液；表2：杀菌组合物对立枯病田间试验设计根据发病率以及相对防效计算公式如下：得出表3：田间试验防效统计表表3：杀菌组合物对立枯病田间防效枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌与恶霉灵杀菌组合物的田间实验结果见表3。从表3可以看出枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌与恶霉灵杀菌组合物以灌根和喷雾两种方法相结合，防效均达到79％以上，而且最高可以达到83.23％；杀菌组合物可湿性粉剂中有效成分枯草芽孢杆菌含量为20亿cfu/g、哈茨木霉菌含量为35亿cfu/g、恶霉灵≥25mg/g。本发明在水稻育苗期间防治水稻立枯病期间防效最高达到了83.23％，稀释1000倍液。其最佳的使用方法是两次用药，第一次在播种后，种子露白时使用药剂灌溉。第二次在水稻2叶期时喷雾防治。实施例中其杀菌药剂恶霉灵、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌的使用量减少了50％，为水稻育苗期间施药方法提供了高效施用方法。以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。当前第1页12