本发明涉及一种微生物制剂及其制备方法，具体涉及一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂及其制备方法和应用，属于农业技术领域。
背景技术：
根结线虫(meloidogyne)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。根结线虫主要为害各种蔬菜的根部，表现为侧根和须根较正常增多，并在幼根的须根上形成球形或圆锥形大小不等的白色根瘤，有的呈念珠状。被害株地上部生长矮小、缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。
根结线虫的生活史要经历卵、幼虫和成虫三个时期。根结线虫主要以卵、卵囊或2龄幼虫随病残体在土壤中越冬，当气温达到10℃以上时，卵就能孵化出幼虫。多数根结线虫只进行孤雌生殖(castagnone-sereno,2006)，雌成虫产卵繁殖后代的速度极快，产卵多，且卵和卵囊难以被普通药物杀死，这也是多次施药根结线虫却反复复发的根本原因。
活动状态的根结线虫对环境的适应能力较差，不耐高温、低温、淹水、干旱、缺氧、高或低ph值和高渗透压等；未孵化的卵和卵囊中的卵适应恶劣环境的能力较强，以休眠状态存活在土壤中。有研究发现0-5℃的低温能杀死南方根结线虫幼虫，但不能杀死卵(刘维志，2000)，在根结线虫在土壤里无寄主存在的条件下，仍可存活3年之久(刘善勇，2005)。
现有技术的防治根结线虫的方法对成虫杀灭效果较好，对卵和卵囊的杀灭效果较差。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂及其制备方法和应用，提高根结线虫的卵和卵囊的致死率，有效抑制根结线虫繁殖。
为解决现有的技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂，包括以下组分：侧孢芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、艾草粉、苍耳子粉、烟草粉、钙镁磷肥。
所述的微生物制剂还包括以下组分：纳豆芽孢杆菌菌粉、苦楝素、木质素磺酸盐、香叶烯。
所述的微生物制剂各组分的重量份配比为：
纳豆芽孢杆菌菌粉0-9份、侧孢芽孢杆菌菌粉1-4份、枯草芽孢杆菌菌粉4-7份、地衣芽孢杆菌菌粉3-5份、艾草粉27-32份、苍耳子粉19-24份、烟草粉17-22份、钙镁磷肥18-23份、苦楝素0-2.5份、木质素磺酸盐0-3.5份、香叶烯0-4份。
进一步优选，所述的微生物制剂各组分的重量份配比为：
纳豆芽孢杆菌菌粉7-9份、侧孢芽孢杆菌菌粉1-4份、枯草芽孢杆菌菌粉4-7份、地衣芽孢杆菌菌粉3-5份、艾草粉27-32份、苍耳子粉19-24份、烟草粉17-22份、钙镁磷肥18-23份、苦楝素1-2.5份、木质素磺酸盐2.5-3.5份、香叶烯1-4份。
进一步优选，所述的微生物制剂各组分的重量份配比为：
纳豆芽孢杆菌菌粉7.5份、侧孢芽孢杆菌菌粉2份、枯草芽孢杆菌菌粉6份、地衣芽孢杆菌菌粉4.5份、艾草粉31份、苍耳子粉23份、烟草粉20份、钙镁磷肥21份、苦楝素2份、木质素磺酸盐3.2份、香叶烯3份。
一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：制备微生物菌粉、喷菌后处理、称量、非微生物组分处理和共混；
所述的喷菌后处理：将菌粉放入恒温箱，-18℃保持60min后，以0.2℃/min的升温速率升温至28℃，恒温2h，然后以0.2℃/min的降温速率降温至20℃。
所述的制备微生物菌粉：
将大豆磷脂和土豆淀粉按照1：5的质量比混合均匀，过80目筛，70-80℃烘干40min，得到载体a；
将大豆粉和松花粉按2：1的质量比混合均匀，过100目筛，经60-65℃低温烘干60min，得到载体b；
将魔芋粉和凹凸棒粉按照1：3的质量比混合均匀，过100目筛，得到载体c；
将玉米淀粉和脱脂鱼粉按1：1的质量比混合均匀，过80目筛，得到载体d；
将纳豆芽孢杆菌菌体均匀喷洒于载体a中，得到纳豆芽孢杆菌含量为18亿/g的纳豆芽孢杆菌菌粉；
将侧孢芽孢杆菌菌体均匀喷洒于载体b中，得到侧孢芽孢杆菌含量为62亿/g的侧孢芽孢杆菌菌粉；
将枯草芽孢杆菌菌体均匀喷洒于载体c中，得到枯草芽孢杆菌含量为35亿/g的枯草芽孢杆菌菌粉；
将地衣芽孢杆菌均匀喷洒于载体d中,得到地衣芽孢杆菌含量为54亿/g的地衣芽孢杆菌菌粉。
所述的非微生物组分处理：将艾草粉、烟草粉和苍耳子粉混合，研磨至200目的细粉，加入水配制成混合液，料液比为1:33；将混合液置于超声波破碎仪中，超声波破碎仪功率为1500w，处理时间为5min；将混合液浓缩烘干至含水量为9-10%的混合粉末。
一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂的应用，所述的应用：用于植物苗期，施用量为植物培养基质质量的百分之一。
应用后，对根结线虫虫卵的致死率可达85.8-99.2%，对根结线虫卵囊的致死率可达87.8-99.7%。
由于采用了上述技术方案，本发明达到的技术效果是：
1、对根结线虫虫卵的致死率可达85.8-99.2%；
2、对根结线虫卵囊的致死率可达87.8-99.7%；
3、施用本发明微生物制剂15天后，病株治愈率可达88-98%。
具体实施方式
本发明所述纳豆芽孢杆菌保藏号为cicc10023；侧孢芽孢杆菌保藏号为accc11079；枯草芽孢杆菌保藏号cicc10071；地衣芽孢杆菌保藏号为accc02002，上述菌种均来源于市售。
实施例1一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂
所述微生物制剂包括以下重量份的组分：
侧孢芽孢杆菌菌粉2份、枯草芽孢杆菌菌粉5份、地衣芽孢杆菌菌粉3份、艾草粉30份、苍耳子粉20份、烟草粉20份、钙镁磷肥20份。
上述微生物制剂的制备方法包括以下步骤：
1、制备微生物菌粉
采用传统的发酵方法，制备侧孢芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液和地衣芽孢杆菌菌液；
分别将上述菌液离心，收集菌体；
从市场上购买玉米淀粉作为微生物载体；
将侧孢芽孢杆菌菌体、枯草芽孢杆菌菌体、地衣芽孢杆菌菌体分别喷洒于载体上,得到含菌量为62亿/g的侧孢芽孢杆菌菌粉、含菌量为35亿/g的枯草芽孢杆菌菌粉和含菌量为54亿/g的地衣芽孢杆菌菌粉。
2、称量
按照一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂的配方，用电子称准确称取各原料，备用。
3、非微生物组分处理
将艾草粉、烟草粉和苍耳子粉混合，研磨至200目的细粉，加入水配制成混合液，料液比为1:33；将混合液置于超声波破碎仪中，超声波破碎仪功率为1500w，处理时间为5min；将混合液浓缩烘干至含水量为9-10%的混合粉末；
将制得的混合粉末置于混料罐内；加入钙镁磷肥，开启搅拌800rpm，30min后，放料，得到非微生物组分混合料。
4、共混
将上述步骤得到的非微生物组分混合料与侧孢芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉混合，为保证微生物活性，在120rpm搅拌40-50min，混合均匀，制得抑制根结线虫繁殖的微生物制剂。
实施例2一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂
所述微生物制剂包括以下重量份的组分：
纳豆芽孢杆菌菌粉7份、侧孢芽孢杆菌菌粉1份、枯草芽孢杆菌菌粉4份、地衣芽孢杆菌菌粉3份、艾草粉27份、苍耳子粉19份、烟草粉17份、钙镁磷肥18份、苦楝素1份、木质素磺酸盐2.5份、香叶烯1份。
所述纳豆芽孢杆菌菌粉：纳豆芽孢杆菌含量为18亿/g，载体由大豆磷脂、土豆淀粉按1：5的质量比混合而成；
所述侧孢芽孢杆菌菌粉：侧孢芽孢杆菌含量为62亿/g，载体由大豆粉、松花粉按2：1的质量比混合而成；
所述枯草芽孢杆菌菌粉：枯草芽孢杆菌含量为35亿/g，载体由魔芋粉、凹凸棒粉按1：3的质量比混合而成；
所述地衣芽孢杆菌菌粉：地衣芽孢杆菌含量为54亿/g，载体由玉米淀粉、脱脂鱼粉按1：1的质量比混合而成；
所述钙镁磷肥：p2o5含量7%，cao含量40%，sio2含量23%，mgo含量1%。
上述一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
1、制备微生物菌粉
采用传统的发酵方法，制备纳豆芽孢杆菌菌液、侧孢芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液和地衣芽孢杆菌菌液；
分别将上述菌液离心，收集菌体；
从市场上购买大豆磷脂、土豆淀粉、大豆粉、松花粉、魔芋粉、凹凸棒粉、玉米淀粉、脱脂鱼粉
将大豆磷脂和土豆淀粉按照1：5的质量比混合均匀，过80目筛，70-80℃烘干40min，得到载体a；
将大豆粉和松花粉按2：1的质量比混合均匀，过100目筛，经60-65℃低温烘干60min，得到载体b；
将魔芋粉和凹凸棒粉按照1：3的质量比混合均匀，过100目筛，得到载体c；
将玉米淀粉和脱脂鱼粉按1：1的质量比混合均匀，过80目筛，得到载体d；
将纳豆芽孢杆菌菌体均匀喷洒于载体a中，得到纳豆芽孢杆菌含量为18亿/g的纳豆芽孢杆菌菌粉；
将侧孢芽孢杆菌菌体均匀喷洒于载体b中，得到侧孢芽孢杆菌含量为62亿/g的侧孢芽孢杆菌菌粉；
将枯草芽孢杆菌菌体均匀喷洒于载体c中，得到枯草芽孢杆菌含量为35亿/g的枯草芽孢杆菌菌粉；
将地衣芽孢杆菌均匀喷洒于载体d中,得到地衣芽孢杆菌含量为54亿/g的地衣芽孢杆菌菌粉。
2、喷菌后处理
将步骤1制备的纳豆芽孢杆菌菌粉、侧孢芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉分别放入恒温箱，-18℃保持60min后，以0.2℃/min的升温速率升温至28℃，恒温2h，然后以0.2℃/min的降温速率降温至20℃，恒温备用。
3、称量
按照一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂的配方，用电子称准确称取各原料，备用。
4、非微生物组分处理
将艾草粉、烟草粉和苍耳子粉混合，研磨至200目的细粉，加入水配制成混合液，料液比为1:33；将混合液置于超声波破碎仪中，超声波破碎仪功率为1500w，处理时间为5min；将混合液浓缩烘干至含水量为9-10%的混合粉末；
将制得的混合粉末置于混料罐内；依次加入钙镁磷肥、苦楝素，开启搅拌800rpm，30min；将搅拌速率升至2000rpm，边搅拌边向混料罐中依次加入木质素磺酸盐、香叶烯；搅拌10min后，放料，得到非微生物组分混合料。
5、共混
将上述步骤得到的非微生物组分混合料与纳豆芽孢杆菌菌粉、侧孢芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉混合，为保证微生物活性，在120rpm搅拌40-50min，混合均匀，制得抑制根结线虫繁殖的微生物制剂。
实施例3一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂
所述微生物制剂包括以下重量份的组分：
纳豆芽孢杆菌菌粉8份、侧孢芽孢杆菌菌粉3份、枯草芽孢杆菌菌粉5份、地衣芽孢杆菌菌粉4份、艾草粉29份、苍耳子粉22份、烟草粉18份、钙镁磷肥20份、苦楝素1.5份、木质素磺酸盐3份、香叶烯2份。
所述纳豆芽孢杆菌菌粉：纳豆芽孢杆菌含量为18亿/g，载体由大豆磷脂、土豆淀粉按1：5的质量比混合而成；
所述侧孢芽孢杆菌菌粉：侧孢芽孢杆菌含量为62亿/g，载体由大豆粉、松花粉按2：1的质量比混合而成；
所述枯草芽孢杆菌菌粉：枯草芽孢杆菌含量为35亿/g，载体由魔芋粉、凹凸棒粉按1：3的质量比混合而成；
所述地衣芽孢杆菌菌粉：地衣芽孢杆菌含量为54亿/g，载体由玉米淀粉、脱脂鱼粉按1：1的质量比混合而成；
所述钙镁磷肥：p2o5含量7%，cao含量40%，sio2含量23%，mgo含量1%。
上述一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂的制备方法与实施例2相同。
实施例4一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂
所述微生物制剂包括以下重量份的组分：
纳豆芽孢杆菌菌粉7.5份、侧孢芽孢杆菌菌粉2份、枯草芽孢杆菌菌粉6份、地衣芽孢杆菌菌粉4.5份、艾草粉31份、苍耳子粉23份、烟草粉20份、钙镁磷肥21份、苦楝素2份、木质素磺酸盐3.2份、香叶烯3份。
所述纳豆芽孢杆菌菌粉：纳豆芽孢杆菌含量为18亿/g，载体由大豆磷脂、土豆淀粉按1：5的质量比混合而成；
所述侧孢芽孢杆菌菌粉：侧孢芽孢杆菌含量为62亿/g，载体由大豆粉、松花粉按2：1的质量比混合而成；
所述枯草芽孢杆菌菌粉：枯草芽孢杆菌含量为35亿/g，载体由魔芋粉、凹凸棒粉按1：3的质量比混合而成；
所述地衣芽孢杆菌菌粉：地衣芽孢杆菌含量为54亿/g，载体由玉米淀粉、脱脂鱼粉按1：1的质量比混合而成；
所述钙镁磷肥：p2o5含量7%，cao含量40%，sio2含量23%，mgo含量1%。
上述一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂的制备方法与实施例2相同。
实施例5一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂
所述微生物制剂包括以下重量份的组分：
纳豆芽孢杆菌菌粉9份、侧孢芽孢杆菌菌粉4份、枯草芽孢杆菌菌粉7份、地衣芽孢杆菌菌粉5份、艾草粉32份、苍耳子粉24份、烟草粉22份、钙镁磷肥23份、苦楝素2.5份、木质素磺酸盐3.5份、香叶烯4份。
所述纳豆芽孢杆菌菌粉：纳豆芽孢杆菌含量为18亿/g，载体由大豆磷脂、土豆淀粉按1：5的质量比混合而成；
所述侧孢芽孢杆菌菌粉：侧孢芽孢杆菌含量为62亿/g，载体由大豆粉、松花粉按2：1的质量比混合而成；
所述枯草芽孢杆菌菌粉：枯草芽孢杆菌含量为35亿/g，载体由魔芋粉、凹凸棒粉按1：3的质量比混合而成；
所述地衣芽孢杆菌菌粉：地衣芽孢杆菌含量为54亿/g，载体由玉米淀粉、脱脂鱼粉按1：1的质量比混合而成；
所述钙镁磷肥：p2o5含量7%，cao含量40%，sio2含量23%，mgo含量1%。
上述一种抑制根结线虫繁殖的微生物制剂的制备方法与实施例2相同。
实验1：
将实施例1-5的抑制根结线虫繁殖的微生物制剂分别制备成培养基质，具体方法如下：称取5克微生物制剂与500g灭菌土混合均匀，喷水至含水量为28-33%，得到培养基质；
向实施例1-5微生物制剂制备的培养基质中分别混入等量根结线虫的卵（未孵化的卵）和卵囊（卵囊中的卵），并置于26℃、湿度58%的培养箱内培养48h。
检测并统计根结线虫卵和卵囊的致死率，具体结果如表1所示；
表1根结线虫卵和卵囊的致死率
可见，本发明微生物制剂对根结线虫虫卵的致死率可达85.8-99.2%，对根结线虫卵囊的致死率可达87.8-99.7%，能够很好的抑制根结线虫的繁殖。
实验2：
将600棵感染根结线虫的西瓜苗株（病株）分别移栽至营养钵内培养，分为六组，其中一组为对照组：营养钵内为西瓜育苗基质；其余五组为实验组：营养钵内分别为西瓜育苗基质和本发明实施例1-5的微生物制剂，基质与微生物制剂的质量配比为100:1；培养15天后，检测西瓜苗株感染根结线虫的情况，具体结果见表2；
表2西瓜苗株感染根结线虫的情况
可见，感染根结线虫的西瓜苗株在施用本发明微生物制剂15天后，病株治愈率可达88-98%。
除非特殊说明和本领域常用单位，本发明所述比例，均为质量比例，所述百分比，均为质量百分比。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。