本发明涉及一种高密度生产棕色蘑菇液体菌种的方法。
背景技术：
棕色蘑菇(Agaricus brunnescens Peck)是蘑菇中的珍稀类品种，属于担子菌纲(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaritales)、蘑菇科(Agaricaceae)、蘑菇属(Agaricus)，也称为棕蘑、变褐蘑菇、有色蘑菇、洋菇、美味蘑菇等。
棕色蘑菇菌盖呈天然棕褐色，菌柄白色，因其菌盖色泽而得名，该品种肉质致密、紧实、口感鲜嫩。棕色蘑菇与双孢蘑菇相比，在菇质、抗性、营养等方面都具有一定的优势。棕色蘑菇菇质结实、口感韧性强、香味浓郁，更接近于野生口蘑，与双孢蘑菇相比，其菌盖不会随时间延长而氧化褐变导致商品性状的下降，因此无需使用化学护色、漂白剂等处理，食品的营养和安全性更能得到保障。
由于消费需求，棕色蘑菇在国内外市场上的份额呈逐年增加的趋势，在亚洲的日本、韩国也有栽培。在我国由于其色泽和气味偏重，一直未被市场广泛接受，仅有福建等地有少量栽培，产品均外销。近些年来，由于棕色蘑菇抗病性强、耐储存、保鲜期长、基本无农药残留等优势，受到市场的欢迎，我国山东、新疆、湖北、宁夏、天津等地也开始进行种植。
棕色蘑菇的培养周期很长，大约6个月左右，因此大大影响了其工业化效率。为了缩短棕色蘑菇的培养周期，可以采用液态棕色蘑菇种子。液态棕色蘑菇种子与传统麦粒种接种方式相比，可以缩短棕色蘑菇种子培育时间大约一个半月，因此在工业化生产中具有巨大的经济价值。
因此本专利获得的高密度生产棕色蘑菇液态菌种的方法具有广阔的市场前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出了一种新型的棕色蘑菇液态菌种的高密度生产方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种棕色蘑菇液态菌种的高密度生产方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：将棕色蘑菇菌种转接入试管固体培养基斜面中，放入恒温培养箱25℃培养至满管。
2)种子液的制备：取3块0.5cm2新鲜斜面菌种接种于种子培养基(100mL/500mL三角瓶)中，25℃，150r/min摇床培养5d。
所述斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁1.5，菜园土600，麦粒100，琼脂25。
所述种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁1，谷氨酰胺0.1。
所述发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁1。
以上培养基配好后，121℃灭菌20min。
3)高密度发酵棕色蘑菇液体菌种：采用5L全自动发酵罐，装液量为3L，初始葡萄糖为50g/L，接种量3％，25℃；在发酵过程，通过自动控制流加2mol/L的氢氧化钠将发酵过程的pH恒定为6.0；第一阶段0-24h结合自动控制通气量调整溶氧控制在50％，搅拌控制在100转/分钟，；第二阶段24h之后停止搅拌，通过控制通气量来实现溶氧控制，溶氧控制在30％，总培养时间100-160小时。
在pH恒定，二阶式控制溶氧策略下，最大菌球数与不控制发酵参数相比提高了300％以上。
有益效果：
本发明利用低转速搅拌结合通气的方式进行高密度发酵，优点在于，棕色蘑菇的菌丝非常脆弱。前期实验证明，转速高于150转/分钟，不锈钢搅拌桨会打碎棕色蘑菇菌丝，造成菌丝死亡，无法继续生长。而0-24小时采用100转/分钟的搅拌速度既可以满足菌丝生长的对氧气、营养传递的需要，同时不至于大量打断菌丝体，造成菌丝死亡。第二阶段的培养过程中，由于对溶氧的需求较低，因此停止搅拌，仅通过控制通气量边可以实现溶氧控制。这样既满足了溶氧和营养传递的需要，又减少了菌丝的损伤，利于实现高密度培养；发酵过程中在pH恒定，二阶式控制溶氧策略下，最大菌球数与不控制发酵参数相比提高了300％以上。
附图说明
图1为棕色蘑菇在二阶式溶氧控制策略下MPN的动力学。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
一种新型的棕色蘑菇液态菌种的高密度生产方法。包括以下步骤：
1)菌种活化：将棕色蘑菇菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC51579)转接入试管固体培养基斜面中，放入恒温培养箱25℃培养至满管。
2)种子液的制备：取3块0.5cm2新鲜斜面菌种接种于种子培养基(100mL/500mL三角瓶)中，25℃，150r/min摇床培养5d。
斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁1.5，菜园土600，麦粒100，琼脂25。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁1，谷氨酰胺0.1。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁1。
以上培养基配好后，121℃灭菌20min。
3)高密度发酵棕色蘑菇液体菌种：采用5L全自动发酵罐，装液量为3L，初始葡萄糖为50g/L，接种量3％，25℃。在发酵过程，通过自动控制流加2mol/L的氢氧化钠将发酵过程的pH恒定为6.0。第一阶段0-24h溶氧控制在50％(搅拌控制在100转/分钟，结合自动控制通气量调整溶氧。)，第二阶段24h之后溶氧控制在30％，总培养时间120小时。
在pH恒定，二阶式控制溶氧策略下，最大菌球数达到了116×103个/L，与不控制发酵参数相比，提高了338％。
实施例2
一种棕色蘑菇液态菌种的高密度生产方法，包括以下步骤：
菌种活化：将棕色蘑菇菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC51614)转接入试管固体培养基斜面中，放入恒温培养箱25℃培养至满管。
种子液的制备：取3块0.5cm2新鲜斜面菌种接种于种子培养基(100mL/500mL三角瓶)中，25℃，150r/min摇床培养5d。
斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁1.5，菜园土600，麦粒100，琼脂25。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁1，谷氨酰胺0.1。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁1。
以上培养基配好后，121℃灭菌20min。
高密度发酵棕色蘑菇液体菌种：采用5L全自动发酵罐，装液量为3L，初始葡萄糖为50g/L，接种量3％，25℃，通气量为1L/min发酵。在发酵过程，通过自动控制流加2mol/L的氢氧化钠将发酵过程的pH恒定为6.0。第一阶段0-24h溶氧控制在50％(搅拌控制在100转/分钟，结合自动控制通气量调整溶氧。)，第二阶段24h之后溶氧控制在30％，总培养时间100小时。
在pH恒定，二阶式控制溶氧策略下，最大菌球数达到了111×103个/L，与不控制发酵参数相比，提高了338％。
实施例3
一种棕色蘑菇液态菌种的高密度生产方法，包括以下步骤：
菌种活化：将棕色蘑菇菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC52355)转接入试管固体培养基斜面中，放入恒温培养箱25℃培养至满管。
种子液的制备：取3块0.5cm2新鲜斜面菌种接种于种子培养基(100mL/500mL三角瓶)中，25℃，150r/min摇床培养5d。
斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁1.5，菜园土600，麦粒100，琼脂25。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁1，谷氨酰胺0.1。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氢钾2，七水硫酸镁1。
以上培养基配好后，121℃灭菌20min。
高密度发酵棕色蘑菇液体菌种：采用5L全自动发酵罐，装液量为3L，初始葡萄糖为50g/L，接种量3％，25℃，通气量为1L/min发酵。在发酵过程，通过自动控制流加2mol/L的氢氧化钠将发酵过程的pH恒定为6.0。第一阶段0-24h溶氧控制在50％(搅拌控制在100转/分钟，结合自动控制通气量调整溶氧。)，第二阶段24h之后溶氧控制在30％，培养时间160小时。
在pH恒定，二阶式控制溶氧策略下，最大菌球数达到了119×103个/L，与不控制发酵参数相比，提高了338％。