一种选育半显性矮秆水稻光温敏核不育系的方法与流程

本发明涉及水稻遗传育种领域，主要涉及在环境因子智能可控下对半显性矮秆水稻光温敏核不育系的选育领域。

背景技术：

水稻光温敏核不育系（两系不育系）的育性转换（可育和不育）受环境因子控制，在长日高温下表现为不育可用于制种，生产杂交种以利用杂种优势；在短日低温下可转换为可育，自交结实生产出不育系种子。由于近些年来异常天气频发，在制种过程中不育系自交结实导致杂交种纯度下降、种子质量不能达标，因此筛选出适合生产需要的不育系尤为重要。以往在自然条件下进行筛选存在以下问题：1、由于自然环境因子（主要是光长、日平均温度）的不可控性，在自然条件下难以准确地筛选出符合生产需要的两系不育系；2、选种圃的环境跟踪观测，需要人员现场记录，难以保证数据的实时性和准确性，耗费颇多。

传统育种手段与现代信息技术的融合会助推其快速发展，水稻光温智慧控制系统应运而生，它综合利用了互联网、物联网、传感器以及相关控制等技术实时、远程精准控制冷水池里的水温、光照时间等环境要素，从而筛选出育性转换起点温度符合要求的水稻光温敏核不育系单株，从而确保两系杂交稻制种安全。

株高是株型中最重要的农艺性状，它与生物产量呈线性相关，株高超过一定范围易引起倒伏而减产，直播稻更是如此。半矮秆水稻不仅可提高抗倒伏性，而且适合水稻直播、抛秧等轻简栽培推广的需要，因此发掘新的半矮秆种质资源具有现实意义。但是，生产上利用的水稻矮秆资源主要是利用sd-1基因，该基因为隐性，对于杂交稻而言，双亲必须都含有该基因才可有效地降低株高。同一基因的广泛利用存在遗传背景单一性带来了潜在风险。发掘和利用新的水稻半矮秆资源，尤其是籼型半显性矮秆资源，可有效地降低杂交稻的植株高度，对于水稻育种应用及其相关基因的分离都具有重要意义。

在育种过程中发现一个矮秆籼型两系不育系皖矮907S，该不育系株高65cm左右，与30份株高在93cm到131cm间的恢复系杂交，所有F₁株高均表现为中间类型，比恢复系平均低11.7cm。选取其中一组合种植F₂群体，F₂代株高的分布呈正态分布。以上结果表明皖矮907S的矮秆性状为不完全显性遗传，而且是一个数量性状，即受到QTL的控制。初定位结果表明，有2个主效QTL影响了株高性状，分别位于第6染色体长臂、8染色体短臂上，其中位于第6染色体上的位点与已克隆的D35位置比较接近，在水稻第8染色体上位点可能是一个新发现的控制株高QTL，它能有效降低水稻株高。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：以光温智慧控制系统结合分子标记和常规技术手段，选育出育性起点温度在23.5℃左右的半显性矮秆两系不育系。

本发明所采取的技术方案是：

一种选育半显性矮秆水稻光温敏核不育系的方法，包括以下步骤：

（1） 将含有第8染色体上新发现的控制株高的QTL的水稻，通过人工杂交，使控制株高的QTL转入到目前生产上大面积使用的光温敏核不育系中；

（2）在步骤（1）培育的后代中，运用连锁的分子标记早期选择含有半显性QTL单株；

（3）运用光温智慧控制系统结合花粉镜检和不育性观察，筛选不育起点温度在23.5℃左右的半矮秆单株；

（4）选取步骤（3）中的半矮秆单株多代自交，使性状趋于稳定。

进一步地，步骤（1）中将含有第8染色体上新发现的控制株高的QTL的水稻为皖矮907S，可育期取P88S、C815S单株，人工去除花药，授以皖矮907S花粉，人工配制杂交种子，以P88S、C815S作为轮回亲本，多代回交，得到回交后代单株。

进一步地，所述的步骤（2）具体包括：

1）参照Rogers和Bendich公开的CTAB法提取DNA；

取0.5g的叶片在液氮中快速研磨成粉末，转移至1.5ml eppendorf 管中，至1/3体积处；加入600μl 65℃的2×CTAB提取缓冲液，然后65℃温浴15-20min，其间摇匀1-2次；取出 eppendorf 管，加入600μl氯仿：异戊醇=24:1混合液，混合均匀后，65℃温浴5-10min，其间充分摇匀一次；10,000rpm离心10min，取出后吸取上清液到新的eppendorf 管中；加入500μl预冷的异丙醇混合均匀，放入4℃冰箱12h以上使DNA沉淀；12,000rpm离心2min，使DNA沉于管底，去上清液；加入500μl 70% 乙醇洗涤沉淀；倒掉70%乙醇，再用无水乙醇洗涤一次，风干15-30min后，加入200μl 0.1×TE 缓冲液溶解DNA，然后置于4℃冰箱中保存备用；

2）SSR引物扩增；

扩增反应体系为20μl：2μl含有MgCl₂ 的10×Buffer、0.25μl dNTP （10m mol/L）、2μl 浓度40ng/μl的Primer、0.3μl 的2.5U/μl的Taq、2μl浓度为0.5μg/μl模板DNA、13.45μl的 ddH₂O；

反应过程：首先在95℃条件下，变性5min；然后进入扩增循环：95℃变性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸60sec，循环35次；最后72℃延伸10min；在4℃下保存；

3）聚丙烯酰胺凝胶电泳及显影

扩增反应产物用8%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳进行分离，然后用银染法显影：依次用10%醋酸固定30min、去离子水连续漂洗3次、在每升含有1g AgNO3和1.5ml 37%的甲醛染色液中染色30min、去离子水迅速漂洗5-10s、把玻璃板放入预冷的显影液中，其中1L显影液中含无水碳酸钠30g，37%的甲醛1.5ml，200μl 10%的硫代硫酸钠，显影液-20℃预冷，颠倒显影液直至扩增条带清楚显现，再用10%醋酸固定5-6min，最后用去离子水漂洗2-3min；

4）基因型的获得及单株选择

利用与半显性矮秆QTL紧密连锁的SSR引物获得每个单株的基因型(图1），与皖矮907S基因型相同，则含有纯合半显性QTL,保留该单株；与P88S或C815S基因型相同，则不含有可去掉该单株，如为杂合类型，可保留继续种植在后代中再进行分子检测和筛选。

进一步地，所述步骤（3）包含以下步骤：

根据生育进程，将水稻始穗期安排在7、8月份，将收获的不育系种子湿润育秧后，秧龄达25d时，选长势均匀一致的秧苗移栽到直径为30cm并装有深20cm泥土的塑料桶中，每个桶均匀栽插7株，活棵后正常施肥、治虫维护秧苗正常生长；

在育性转换敏感期，即花粉母细胞形成期至减数分裂期时移入水温保持在23.5℃的冷水池中进行低温处理7天左右，之后移出冷水池放到适宜环境中，只留下处于叶枕平时期的分蘖，即花粉母细胞减数分裂期的分蘖，抽穗后进行花粉镜检；为正常可育花粉的则剔除；花粉育性没有改变的单株则留下，割茬再生，在自然短日低温下生产不育系种子，也可利用光温智慧控制系统创造短日低温环境。

进一步地，所述的光温智慧控制系统包括控制箱、连接控制箱的水温传感器和光照传感器、连接控制箱并接受控制箱控制的电磁阀和智能遮光帘，所述控制箱连接网关，通过网关连接局域网和Internet网并将水温传感器和光照传感器检测数据上传，局域网和Internet网连接终端设备。

本发明的有益效果是：以光温智慧控制系统结合分子标记和常规技术手段，选育出育性起点温度在23.5℃左右的半显性矮秆两系不育系，其能提高抗倒伏性能；利用光温智慧控制系统可以实现选育过程中的精确控制和远程控制。

附图说明

图1为分子标记检测结果；

图2为光温智慧控制系统示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。

实施例1：光温智慧控制系统的运行

如图2所示的光温智慧控制系统包括控制箱、连接控制箱的水温传感器和光照传感器、连接控制箱并接受控制箱控制的电磁阀和智能遮光帘，所述控制箱连接网关，通过网关连接局域网和Internet网并将水温传感器和光照传感器检测数据上传，局域网和Internet网连接终端设备。

1.1、软件系统

1.1.1场地档案管理

场地类型：冷水池。

场地大小：长、宽、深度。

1.1.2数据采集设备管理

通过传感器采集光照度和水温数据，网关将数据传送至服务器软件，软件实时显示、存储，对存储数据进行报表生成、报表编辑、报表打印、转化生成TXT/EXCEL文件等。

实时显示：大小/行列自动调整。

报表：行列组合可设置。开始时间/结束时间/每行时间间隔可设，按设置精确筛选数据。

1.1.3环控设备管理

降温设备属性描述，降温设备类型添加、修改及删除。降温设备个数添加、修改及删除。

遮光设备属性描述，遮光设备类型添加、修改及删除。遮光设备个数添加、修改及删除。

1.1.4环境控制管理

环境场景属性描述，设备参数范围设定、修改及删除，自动调节系统参数设定、修改及删除。

报警提醒类型描述，设备故障、数据异常、阀值设定修改及删除。

1.1.5数据分析

实时采集来自传感器的数据或是异常的故障类型，并传输到数据库系统中。接收来自数据库的信息：如温度、光照等；进行分析计算，形成相应的各类图形，对结果进行自动判断，生成报告。

1.1.6权限管理

根据系统设置的安全规则或者安全策略，用户可以访问而且只能访问自己被授权的资源。权限管理设置两种类型：功能级权限管理；数据级权限管理。

1.2、光照控制系统

系统工作原理：光照传感器采集数据传送给智能无线控制模块，智能无线控制模块将数据传送给网关，网关将数据传送服务器，电脑、移动设备软件客户端将其数据和设定参数进行数据对比，如高于设定光照度将发生指令给网关，网关将指令解析发送给智能无线控制模块，智能无线控制模块将控制智能遮光帘进行控制。

光照度传感器采用对弱光也有较高灵敏度的硅兰光伏探测器作为传感器，随时监测记录太阳光线的强度。用ROHM原装BH1750FVI芯片，供电电源：3-5v，光照度范围：0-65535 lx，传感器内置16bitAD转换器，直接数字输出，省略复杂的计算，省略标定，不区分环境光源，接近于视觉灵敏度的分光特性，可对广泛的亮度进行1勒克斯的高精度测定，标准NXP IIC通信协议，模块内部包含通信电平转换，与5v单片机io直接连。

智能百叶窗可以自动调节遮光角度，免焊接集成组装工艺，制作简单，安装方便高温热浸锌带钢，经过全自动数控冷弯设备，二十道冷弯成型工艺，通过全自动涂装流水线的表面处理程序，造成高品质，高强度的锌钢百叶型材。

1.3、水温控制系统

系统工作原理：水温传感器采集数据传送给智能无线控制模块，智能无线控制模块将数据传送给网关，网关将数据传送服务器，电脑、移动设备软件客户端将其数据和设定参数进行数据对比，如高于设定水温将发生指令给网关，网关将指令解析发送给智能无线控制模块，智能无线控制模块将控制冷水阀进行降温。

水温传感器采用聚四氟乙烯镀银线，3芯镀银导体，耐200摄氏度，保护管直径为4×30mm，线尾采用优质开口端子，精度为0.1℃。薄膜铂电阻：用真空沉积的薄膜技术把铂溅射在陶瓷基片上，膜厚在2微米以内，用玻璃烧结料把Ni（或Pd）引线固定，经激光调阻制成薄膜元件。

电磁阀是根据直动和先导式相结合的原理，当入口与出口没有压差时，通电后，电磁力直接把先导小阀和主阀关闭件依次向上提起，阀门打开。当入口与出口达到启动压差时，通电后，电磁力先导小阀，主阀下腔压力上升，上腔压力下降，从而利用压差把主阀向上推开；断电时，先导阀利用弹簧力或介质压力推动关闭件，向下移动，使阀门关闭。电磁阀控制水温高于设置值阀门自动打开注入相对温度低的冷水，使其池中水温与设定值相符。

1.4、通讯网络系统

通过互联网、移动网络和物联网进行数据相互通讯模式。

互联网：网络与网络之间所串连成的庞大网络，这些网络以一组通用的协议相连。互联网连接设备可用路由器或者交换机。

物联网：物联网通过智能感知、识别技术与普适计算等通信感知技术，广泛应用于网络的融合中。可由网关和智能无线控制通讯模块组成。

移动网络：基于浏览器的Web服务，如万维网，WAP使用移动设备，如手机，掌上电脑或其它便携式工具连接到公共网络，支持高速数据传输的蜂窝移动通讯技术。

实施例2：半显性矮秆低起点温度的两系不育系的选育

2.1亲本材料：皖矮907S(含有半显性矮秆QTL），P88S、C815S。

2.2杂交

可育期取P88S、C815S单株，人工去除花药，授以皖矮907S花粉，人工配制杂交种子。

2.3回交及分子检测

以P88S、C815S作为轮回亲本，多代回交，在回交后代中用分子标记进行早期筛选含有半显性矮秆QTL的单株。

2.3.1 DNA的少量提取

参照Rogers和Bendich（1988）报道的CTAB法略加改动回交后代中提取DNA

（1）取0.5g左右的叶片在液氮中快速研磨成粉末，转移至1.5ml eppendorf 管中，大约至1/3体积处。

（2）加入600μl预热（65℃）的2×CTAB提取缓冲液，然后65℃温浴15-20min，其间摇匀1-2次。

（3）取出 eppendorf 管，加入600μl氯仿/异戊醇（24:1）混合均匀后，65℃温浴5-10min，其间充分摇匀一次。

（4）10,000rpm离心10min，取出后吸取上清液到新的eppendorf 管中。

（5）加入500μl预冷的异丙醇混合均匀，放入4℃冰箱过夜使DNA沉淀。

（6）12,000rpm离心2min，使DNA沉于管底，去上清液。

（7）加入500μl 70% 乙醇洗涤沉淀。

（8）倒掉70%乙醇，再用无水乙醇洗涤一次，风干15-30min后，加入200μl 0.1×TE 缓冲液溶解DNA，然后置于4℃冰箱中保存备用。

2.3.2、SSR引物扩增

扩增反应体系为20μl：

10×Buffer（含有MgCl2） 2μl；

dNTP （10m mol/L） 0.25μl；

Primer（40ng/μl） 2μl；

Taq （2.5U/μl） 0.3μl；

模板DNA （0.5μg/μl） 2μl；

ddH2O 13.45μl ；

扩增反应条件为以下步骤：

（1）95℃，5min；

（2）95℃，30sec；

（3）55℃，30sec；

（4）72℃，60sec；

其中步骤（2）、（3）和（4）连续循环35次；

（5）72℃，10min；

4℃ 保存。

2.3.3、聚丙烯酰胺凝胶电泳及显影

PCR产物用8%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳进行分离，然后用银染法显影。

（1）10%醋酸固定30min。

（2）去离子水连续漂洗3次。

（3）在染色液（1L染液中含有1g AgNO3，37%的甲醛1.5ml）中染色30min。

（4）去离子水迅速漂洗5-10s。

（5） 把玻璃板放入预冷的显影液中（1L显影液中含无水碳酸钠30g，37%的甲醛1.5ml，200μl 10%的硫代硫酸钠，显影液-20℃预冷），颠倒显影液直至扩增条带清楚显现。

（6）10%醋酸固定5-6min。

（7）去离子水漂洗2-3min。

2.3.4、基因型的获得及单株选择

利用与半显性矮秆QTL紧密连锁的SSR引物获得每个单株的基因型,如图1所示，用位于第8染色体上连锁标记RM3572对F₂群体进行基因型分析，图1中“矮秆”表示为在RM3572这个位点上皖矮907S的电泳带型，“高秆”表示为在该位点上P88S或C815S的电泳带型，而电泳带型则可表示各单株的基因型。与皖矮907S基因型相同，则含有纯合半显性QTL,保留该单株；与P88S或C815S基因型相同，则可去掉该单株，如为杂合类型即含有双亲的特征带型，可保留继续种植在后代中再进行分子检测和筛选。

2.4运用光温智慧控制系统进行筛选低起点温度的光敏核不育系。

根据生育进程，将水稻始穗期安排在7、8月份，此时大于50lx的日长在14h以上，基本排除了日长对育性的影响。将收获的不育系种子湿润育秧后，秧龄达25d时，选长势均匀一致的秧苗移栽到直径为30cm并装有深20cm泥土的塑料桶中，每个桶均匀栽插7株，活棵后正常施肥、治虫维护秧苗正常生长。

在育性转换敏感期（花粉母细胞形成期至减数分裂期）时移入水温保持在23.5℃的冷水池中进行低温处理7天左右（在冷水池四周和中心，均匀放置5个探头，探头高度视处理材料的幼穗高低而定），之后移出冷水池放到适宜环境中，只留下处于叶枕平时期（花粉母细胞减数分裂期）的分蘖，抽穗后进行花粉镜检。为正常可育花粉的则剔除；花粉育性没有改变的单株则留下，割茬再生，在自然短日低温下生产不育系种子，也可利用光温智慧控制系统创造短日低温环境。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。