一种利用水杨酸及其类似物药剂降低水稻黑条矮缩病发病率的方法与流程

本发明使用水杨酸(Salicylic acid，SA)和苯并噻二唑(Benzothiadiazole，BTH)预处理感水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)植株日本晴(Nipponbare)，随后用黑条矮缩病毒侵染日本晴秧苗，鉴定出SA及BTH的处理可以提高水稻对RBSDV的抗性，可应用于农业生产中降低因黑条矮缩病对水稻造成的危害，属于农业科学技术领域。

背景技术：
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RBSDV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第二组成员，以灰飞虱(Small brown planthopper，SBPH)为主要传毒媒介进行持久性传播，介体灰飞虱一旦染毒，终身带毒，并能连续传毒，但不经卵传毒。自然条件下，主要寄主有水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、粟、看麦娘、稗草及狗尾巴草等禾本科植物。在我国，RBSDV侵染小麦引起小麦绿矮病，侵染玉米引起玉米粗缩病，侵染水稻引起水稻黑条矮缩病。水稻黑条矮缩病植株的典型症状为植株矮缩、叶片短小僵直，颜色浓绿，心叶扭曲褶皱，发病初期叶背面的叶脉和茎秆上出现蜡泪状白色突起，后期突起变成黑褐色，后期不抽穗或穗小，造成严重减产。21世纪以来，水稻黑条矮缩病在我国各水稻产区尤其是江浙一带越来越严重，对我国水稻生产构成严重威胁。

SA，分子式为C₇H₆O₃，无色透明晶体，是植物一种重要的酚类激素，广泛作用于植物的生理过程：如生长发育、光合作用、蒸腾作用、矿物质的吸收转运等。最主要的，SA还是一种极其重要的信号分子参与植物免疫反应，因为它可以诱导产生一些抗病原物病程相关非表达子NPR1等，进入细胞核与受体因子TGA组成复合物，进一步诱导SA途径相关抗病基因的表达，提高植物抗病能力。

BTH，分子式为C₆H₄N₂S，针状结晶，SA类似物，是一种典型的植物抗病诱导剂，普通条件下无杀菌作用，但能够诱导植物的免疫活性，对于植物抗病及防病起着很大的作用。在植物病虫害防治过程中，BTH作为一种抗病诱导剂，比其他化学物质更加的环保高效。

技术实现要素：
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本发明针对上述研究背景，以RBSDV感病水稻品种日本晴(Nipponbare)为研究对象，对水、SA和BTH处理后的发病情况进行统计，发现SA和BTH处理后日本晴的发病率明显低于对照组。本发明提供了利用SA及BTH降低水稻黑条矮缩病发病率的方法，利用该方法可以调高水稻对RBSDV的抗性，可应用农业生产、科研、环保等众多领域，更加经济环保地降低病害造成的粮食损失。

附图说明：

图1健康水稻与水稻黑条矮缩病植株对比

图2饲毒所用病株RT-PCR检测结果

图3水稻黑条矮缩病株饲喂灰飞虱

图4度过循回期的灰飞虱Dot-ELISA带毒率检测结果

图5SA和BTH处理后与对照组的差异，ND(No detected)指未被检测到，不同字母表示在P＜0.05水平上存在组间差异。

具体实施方式：

下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1，利用水杨酸药剂预处理水稻调查其病情的方法

1、携带RBSDV水稻病株的获得

2016年4月于江苏省农业科学院采集植株矮缩、叶色浓绿，分蘖略有增多，心叶有缺刻等表现出水稻黑条矮缩病典型症状的新鲜水稻植株(图1)。参照Trizol(Reagent)说明书提取水稻叶片的总RNA。并用NanoDrop 2000分光光度计检测浓度和质量。只有260/280的比值在1.9和2.1之间且260/230的比值大于2.0的RNA可以用作后续的实验。采用已发表引物RB1-S9-F：5′-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3′(R：A/G；Y：T/C；M：A/C)和RB-S9-R：5′-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3′(H：T/G；M：G/A/T)(引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)进行RT-PCR检测，确定水稻疑似病株是否携带RBSDV。以提取的2μL水稻叶片总RNA为模板、RB-S9-R为引物，参照M-MuLV反转录酶(Fermentas)说明书进行反转录，合成cDNA。以合成的2μL cDNA为模板、RB1-S9-F/RB-S9-R为引物进行PCR反应，使用常规PCR反应体系，最终体系由ddH₂O补足20μL。PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后取2μL PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的条带(1200bp)(图2)。挑选出3株较好水稻病株以备饲毒。

2、植物材料、病毒分析以及侵染方法

水稻种子(Nipponbare)首先用0.1％HgCl₂消毒1h；然后用去离子水冲洗干净，25℃浸种2d，催芽1d；催芽后的种子点播于1L烧杯中培养，每杯40粒，每隔两天浇灌适量的Hoagland营养液，光照14h，黑暗10h，温度28±1℃。

本室常年饲养无毒灰飞虱群体，为避免传毒介体污染，每次使用无毒灰飞虱若虫前取100头Dot-ELISA法检测其是否携带RBSDV，确定其为无毒虫。将筛选备用的新鲜水稻病株种于5L烧杯中，土面覆盖滤纸，将适量1-2龄无毒灰飞虱若虫移入其中，并用纱布封口(图3)，饲喂48h后将其移入预先育有武育粳3号健康秧苗的1L烧杯中度循回期(10-12d)，循回期过后取100头灰飞虱用Dot-ELISA法检测其RBSDV带毒率(图4)。

3、不同处理下的发病情况

14d左右的水稻秧苗，在其土壤较干燥的情况下，分别施加dH₂O、500μM SA各30mL(SA购于台湾生工生物科技有限公司)。黑暗下过夜处理12h，平均每株秧苗以10头的量接入灰飞虱，侵染3d。随后将虫小心扫出，室内缓养1d，再将秧苗移栽至大田，正常管理。1个月左右查看发病情况，统计发病率。重复三次。

如表中所示，相比于对照组，SA处理后日本晴的发病率降低了约45％左右，效果显著，可以得到结论，外源添加水杨酸可以在很大程度上降低水稻黑条矮缩病的发病率。进一步数据分析如图5。

实施例2，利用苯并噻二唑药剂预处理水稻调查其病情的方法

1、携带RBSDV水稻病株的获得

同实施例1。

2、植物材料、病毒分析以及侵染方法

同实施例2。

3、不同处理下的发病情况

14d左右的水稻秧苗，在其土壤较干燥的情况下，分别施加dH2O、500μM BTH各30mL(BTH购于台湾生工生物科技有限公司)。黑暗下过夜处理12h，平均每株秧苗以10头的量接入灰飞虱，侵染3d。随后将虫小心扫出，室内缓养1d，再将秧苗移栽至大田，正常管理。1个月左右查看发病情况，统计发病率。重复三次。

如表中所示，相比于对照组，BTH处理后日本晴的发病率降低了约50％左右，效果显著，可以得到结论，外源添加BTH可以在很大程度上降低水稻黑条矮缩病的发病率。进一步数据分析如图5。

上述实施不以任何形式限定本发明。