无菌苗法筛选高必需氨基酸且抗镉的水稻品种的制作方法

本发明涉及无菌苗法筛选高必需氨基酸且抗镉的水稻品种，属于水稻品种的筛选技术领域。

背景技术：
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水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球大约有35％-50％的人以水稻作为主食，它为人类提供大约40％的蛋白质和20％的能量。在过去水稻的研究中，长期以来都是以产量作为主要路线。随着社会的发展，人们不仅注重产量，更为重要的是对品质要求不断地提高。水稻的品质特征由碾来品质、外观品质、蒸煮品质、营养品质4个方面共12项理化指标和食味品质进行综合评定。然而，水稻中蛋白质含量、氨基酸组成以及必需氨基酸的含量是决定水稻品质优劣的关键因素，其中最重要的指标是蛋白质中氨基酸的比例和必需氨基酸的含量。必需氨基酸是人体内必不可少的，而机体又不能合成的，必须从食物中摄取的氨基酸。目前，国内外在研究水稻蛋白质方面较多，而对蛋白质的营养品质及氨基酸的组成研究较为匮乏。

然而，水稻的一系列品质特征在遗传方面也都有显著表现。比如蒸煮品质的遗传，水稻直链淀粉含量主要受胚乳基因型控制。水稻品质性状不仅受到遗传基因的控制，同时又受到环境因素的影响，对于不同的环境条件具有不同的适应性和稳定性。在早期筛选过程中需要减少环境因素对水稻品质的影响，防止除了遗传因素以外的其他因素对水稻品种的早期筛选造成影响。

镉(Cd)是生物毒性极强的重金属元素，与Pb、Cr、As和Hg合称为“五毒”，位列第二。近年来，现代工业的发展以及镉在冶炼、化工、造纸和电子工业等方面的广泛应用，使得Cd污染日趋严重,金属镉极易在水稻体内富集，并通过食物链进入人体，危害人体健康。我国水稻栽培区耕地土壤镉污染极其严重，因此，研究稻米的抗镉性能具有重要的意义。

技术实现要素：
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针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种无菌苗法筛选高必需氨基酸且抗镉的水稻品种。

本发明的无菌苗法筛选高必需氨基酸及抗镉的水稻品种具体方法为：步骤一:无菌苗法筛选高必需氨基酸水稻品种，具体步骤为:

1-1:材料准备，聚丙烯塑料碗，口径为14-16cm，15个；

微生物摇瓶培养膜，规格15.5cm×16.5cm，15张；

纱布，规格10cm×10cm，60块；

封口膜；

75％的酒精200ml；

5％的福尔马林200ml；

0.15％的复合肥溶液200ml；

灭菌水400ml；

1-2：选择益丰3321、益丰3317、益丰3315、益丰14-24、益丰45为培育的水稻品种，所有的水稻品种均取自湖南永益农业科技发展有限公司；按照4分法每种称10g进行分种；

1-3：浸种，浸种之前汰除悬浮水面的空瘪粒，浸种4-8小时；

1-4：器材的灭菌处理，将15个聚丙烯塑料碗，60块纱布，2瓶共计400ml的灭菌水一同放入高压蒸汽灭菌锅内，在121℃下灭菌20-30min；

1-5水稻种子消毒，消毒过程在超净工作台内进行，对每种水稻种子用75％的酒精浸种30秒，浸毕，将酒精倒入废液缸，然后对每种水稻种子用5％的福尔马林浸泡5分钟，浸毕，用灭菌水洗3次；

1-6：播种，每个塑料碗内垫4层纱布，再倒入0.15％复合肥溶液，每个水稻品种播3碗，每碗播种50粒；

1-7：封膜，将透气性培养膜盖住碗口，其边缘用胶带粘封，防止边缘漏气；

1-8：无菌苗培养，将封好膜的塑料碗，置于25℃光照养箱内培养，光照模式为明暗各12时，培养15天；

1-9：取样并进行前处理，取根颈部以上的秧苗，在80-100℃下烘至恒重，研磨、粉碎过60目筛，检测氨基酸前再烘干至恒重；

1-10：测定无菌苗中17种氨基酸含量，计算氨基酸总量和8种必需氨基酸之和；必需氨基酸的测定参照GB7649-87《谷物籽粒氨基酸测定的前处理方法》、GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》确定，再通过高效液相色谱对无菌苗氨基酸含量进行测定，采用柱前衍生反向高压液相色谱的方法测无菌苗中氨基酸的含量，即先将提取的无菌苗中氨基酸样品在分离前进行水解、衍生，然后用反相色谱分离，最后用荧光检测器检测，普通方法测定得到其无菌苗中的氨基酸组成及其含量、必需氨基酸含量，通过数据分析及研究筛选出高必需氨基酸的水稻品种；

1-11：测定结果的分析与研究，无菌苗氨基酸含量的分析：把实验所选择的益丰3321、益丰3317、益丰3315、益丰14-24、益丰45五种水稻测定的氨基酸组成及其含量、必需氨基酸含量通过数据分析及研究筛选出高必需氨基酸的水稻品种；

步骤二:采用无菌苗法筛选抗镉水稻品种；具体的步骤与步骤一中无菌苗法筛选高必需氨基酸水稻品种的步骤大体相同，不同之处在于在培养过程中，在复合肥溶液中按3mg/L加入氯化镉，培养15天，且培养完成后截取无菌苗水面以上的部分进行检测，含镉最少的即为抗镉水稻品种；

步骤三：用筛选出的高必需氨基酸水稻品种和抗镉水稻品种作为亲本，杂交培养出高必需氨基酸及抗镉水稻品种。

本发明的有益效果：1.环境可控，它能克服现有技术的弊端，选育过程简单，在选育过程中水稻品质性状完全受遗传基因的控制，不受环境因素影响，可防止除了遗传因素以外的其他因素对本研究的影响；2.在较短时期内可筛选大量样品；3.可大大缩短育种年限；4.可节省大量人力，物力，财力。

附图说明：

为了易于说明，本发明由下述的具体实施及附图作以详细描述。

图1为本发明实施例中5种水稻无菌苗氨基酸测定结果图；

图2为本发明实施例中5种水稻无菌苗必需氨基酸测定结果图；

图3为本发明实施例中5种水稻稻谷氨基酸含量测定结果图；

图4为本发明实施例中5种水稻无菌苗必需氨基酸含量数据图；

图5为本发明实施例中5种水稻无菌苗必需氨基酸含量方差分析图；

图6为本发明实施例中5种水稻无菌苗必需氨基酸含量方差分析差异比较结果图；

图7为本发明实施例中5种水稻稻谷必需氨基酸含量分析数据图；

图8为本发明实施例中5种水稻稻谷必需氨基酸含量方差分析图；

图9为本发明实施例中5种水稻稻谷必需氨基酸含量方差分析差异比较结果图；

图10为本发明实施例中5种水稻精米必需氨基酸测定结果图；

图11为人体不同年龄阶段每日必须氨基酸需要量估计及氨基酸需要量模式图。

图12为本发明实施例中5种水稻品种中无菌苗镉含量与相应品种精米镉含量比较图。

具体实施方式：

本具体实施方式采用以下实施例进一步表述：

实施例：

步骤一:无菌苗法筛选高必需氨基酸水稻品种，具体步骤为:

1-1:材料准备，聚丙烯塑料碗，口径为14-16cm，15个；

微生物摇瓶培养膜，规格15.5cm×16.5cm，15张；

纱布，规格10cm×10cm，60块；

封口膜；

75％的酒精200ml；

5％的福尔马林200ml；

0.15％的复合肥溶液200ml；

灭菌水400ml；

1-2：选择益丰3321、益丰3317、益丰3315、益丰14-24、益丰45为培育的水稻品种，所有的水稻品种均取自湖南永益农业科技发展有限公司；按照4分法每种称10g进行分种；

1-3：浸种，浸种之前汰除悬浮水面的空瘪粒，浸种6小时；

1-4：器材的灭菌处理，将15个聚丙烯塑料碗，60块纱布，2瓶共计400ml的灭菌水一同放入高压蒸汽灭菌锅内，在121℃下灭菌20min；

1-5:水稻种子消毒，对每种水稻种子用75％的酒精浸种30秒，浸毕，将酒精倒入废液缸，然后对每种水稻种子用5％的福尔马林浸泡5分钟，浸毕，用灭菌水洗3次；

1-6：播种，每个塑料碗内垫4层纱布，再倒入0.15％复合肥溶液，每个水稻品种播3碗，每碗播种50粒；

1-7：封膜，将透气性培养膜盖住碗口，其边缘用胶带粘封，防止边缘漏气；

1-8：无菌苗培养，将封好膜的塑料碗，置于25℃光照养箱内培养，光照模式为明暗各12时，培养15天；

1-9：取样并进行前处理，取根颈部以上的秧苗，在80℃下烘至恒重，研磨、粉碎过60目筛，检测氨基酸前再烘干至恒重；

1-10：测定无菌苗中17种氨基酸含量，计算氨基酸总量和8种必需氨基酸之和，其中必需氨基酸的测定参照GB7649-87《谷物籽粒氨基酸测定的前处理方法》、GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》确定，再通过高效液相色谱对无菌苗氨基酸含量进行测定，采用柱前衍生反向高压液相色谱的方法测无菌苗中氨基酸的含量，即先将提取的无菌苗中氨基酸样品在分离前进行水解、衍生，然后用反相色谱分离，最后用荧光检测器检测，普通方法测定得到其无菌苗中的氨基酸组成及其含量、必需氨基酸含量，通过数据分析及研究筛选出高必需氨基酸的水稻品种；

1-11：测定结果的分析与研究，无菌苗氨基酸含量的分析：把实验所选择的益丰3321、益丰3317、益丰3315、益丰14-24、益丰45五种水稻测定的氨基酸组成及其含量、必需氨基酸含量进行比较分析，氨基酸测定结果如下图1，必需氨基酸测定结果如图2,由图1和图2可知,无菌苗中氨基酸总量及八种必需氨基酸的含量最高的为益丰3321；

把实验所选择的益丰3321、益丰3317、益丰3315、益丰14-24、益丰45五种水稻稻谷进行氨基酸含量的检测，得到其数据见图3，从图3可知，必需氨基酸含量占总氨基酸含量的35％-40％之间，与无菌苗法筛选结果基本一致，且益丰3321的氨基酸含量最高；接着对水稻无菌苗氨基酸的方差分析，参照图4和图5，根据图4数据以及下列公式计算出其处理方差、重复方差、误差方差得出：

总自由度df＝nk-1

处理自由度dft＝k-1

重复自由度dfr＝n-1

误差自由度dfe＝df-dft-dfr

查统计表得出，当dfe＝8，dfr＝4时，显著点的F值为3.84(1％)，F＝39.626大于3.84，说明品种间必需氨基酸含量具有显著差异。根据邓肯氏多重复差异比较，计算水稻品种间的差异性。

图6为无菌苗必需氨基酸含量方差分析差异比较结果，参照图6得出以下结论：无菌苗中必需氨基酸含量占氨基酸总量约在30％-40％，其中，益丰3321氨基酸含量较其他4个品种的高。益丰3321相对其他品种品质较好。

参照图7，根据图7的数据以及下列公式计算出其处理方差、重复方差、误差方差，结果见图8得出：

总自由度df＝nk-1

处理自由度dft＝k-1

重复自由度dfr＝n-1

误差自由度dfe＝df-dft-dfr

查统计表得知：当dfe＝8，dfr＝4时，显著点的F值为3.84(1％)，F＝39.626大于3.84，说明品种间必需氨基酸含量具有显著差异。根据邓肯氏多重复差异比较，计算水稻品种间的差异性。图9为稻谷必需氨基酸含量方差分析差异比较结果。根据稻谷氨基酸含量的测定与方差分析结果表明，益丰3321必需氨基酸含量和氨基酸总量均高于其他4个品种。

精米必需氨基酸含量的测定，将实验所选择的益丰3321、益丰3317、益丰3315、益丰14-24、益丰45五种水稻品种的精米进行氨基酸的提取及测定，总共检测出17种氨基酸，其中包括8种必需氨基酸和9种非必需氨基酸。必需氨基酸的测定结果如图10。

由图10可知，精米必需氨基酸含量最高为益丰3317，但在无菌苗以及稻谷必需氨基酸含量方差分析中却分别属于C类和b类，而在之前筛选出来的优质品种益丰3321在精米必需氨基酸含量上也拥有较高水平，仅次于益丰3317。因此在生产上可以直接选用益丰3321和益丰3317作为高必需氨基酸水稻品种；

图11为人体不同年龄阶段每日必须氨基酸需要量估计及氨基酸需要量模式图，由图11可知，根据不同年龄每日必需氨基酸需求量估计以及对比图10五种水稻精米中必需氨基酸的含量可知，每100g精米中已基本满足不同年龄阶段每日必需氨基酸的需求。

步骤二：采用无菌苗法筛选抗镉水稻品种；具体的步骤与无菌苗法筛选高必需氨基酸水稻品种的步骤大体相同，不同之处在于在培养过程中，在复合肥溶液中按3mg/L加入氯化镉，培养15天，且培养完成后截取无菌苗水面以上的部分进行检测，含镉最少的即为抗镉水稻品种；参照图12所示,图12为不同水稻品种无菌苗镉含量与相应品种精米镉含量比较图,由图12所得益丰3321无菌苗镉含量和精米镉含量最低,因此益丰3321具有较好的抗镉性能。

步骤三：将筛选出的高必需氨基酸水稻品种益丰3317和抗镉水稻品种益丰3321作为亲本，杂交培养出高必需氨基酸及抗镉水稻品种。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。